人FITM1和HIST1H2BJ基因甲基化位点的检测和应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及人fitm1和hist1h2bj基因甲基化位点的检测和应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肝癌是全球范围内致死率排名第三的恶性肿瘤，也是我国位居第二的癌症“杀手”。目前对肝癌的治疗主要以手术、放化疗为主，同时结合免疫治疗、中医等其他治疗方法；但由于对于肝癌的发病机制尚不明确及缺乏有效的治疗靶点，中后期的病人治疗效果不佳,生存率低。研究表明，肝癌发生发展是一个表观遗传学调控的过程。dna甲基化是目前表观遗传学研究的热点之一，它是指在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dnmt)介导下，以s-腺苷蛋氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到dna某些碱基上的过程。dna甲基化异常被认为是发生肿瘤的一个重要原因。研究肝癌相关基因特异性位点甲基化的改变，有助于了解肝癌的发病机理，为肝癌的预防和治疗提供有效的作用靶点。

fitm1(fatstorageinducingtransmembraneprotein1，脂肪贮藏诱导跨膜蛋白1)基因位于14号染色体长臂1区2带，属于一个进化保守的蛋白质家族，参与脂肪储存。chenj等人研究显示，fitm1是一种抑癌基因，其相关的甲基化特征可以预测非病毒性肝细胞癌患者的预后。但fitm1与肿瘤的相关报道还较少，其dna特异性位点的甲基化与肝癌的关系目前国内外尚未见报道。

hist1h2bj(histonecluster1h2bfamilymemberj,组蛋白簇1h2b家族成员j)基因存在于人6号染色体短臂2区1带的组蛋白微团簇中。该基因无内含子，编码一个复制依赖的组蛋白，是组蛋白h2b家族的成员。该基因转录本没有polya尾，而是包含一个回文终止元件。组蛋白是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的基本核蛋白。四种核心组蛋白(h2a、h2b、h3和h4)中的每一种的两个分子形成一个八聚体，大约146bp的dna被包裹在被称为核小体的重复单元中。连接体组蛋白h1与连接体dna在核小体间相互作用，起着将染色质压缩成高阶结构的作用。据lixf等报道，hist1h2bj基因与宫颈癌的预后相关。但目前该基因异常及基因启动子区甲基化异常与肝癌的关系未见报道。

技术实现要素：

本发明公开了人fitm1基因和hist1h2bj基因特异性dna甲基化位点在肝癌中的甲基化定量信息的改变，具体公开了应用焦磷酸测序技术发现fitm1基因特异性dna甲基化位点(cg06186808)在肝癌中甲基化程度升高；hist1h2bj基因特异性dna甲基化位点(cg04424621)在肝癌中甲基化程度降低。本发明为探索肝癌的发病机理，找到与诊断或治疗相关的潜在标志物提供了支持。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了检测fitm1基因中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述甲基化位点为cg06186808。

其中，fitm1基因特异性位点所在的序列为(seqidno.1)：

cctgctcaaggtgctgctctgggtggcctctgccttgctgtactttggaagcgaacaggc[cg]cccgccttctgggcagcccctgcttacggcgcctctaccatgcctggctggcagcagtgg

在本发明的第二方面，本发明提供了检测hist1h2bj基因中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述甲基化位点为cg04424621。

hist1h2bj基因特异性位点所在的序列为(seqidno.2)：

gtaagcaacttgggatattaggcctttccaaatgagccatctttcttgggctccagataa[cg]tcatcccagtattttactcacttcattttaaaggaatactttgcaacatgcagtagggtg

在本发明的第三方面，本发明提供了检测fitm1基因和hist1h2bj基因中甲基化位点的甲基化水平的试剂在制备辅助诊断肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述甲基化位点为cg06186808和cg04424621。

在本发明的上述应用中，所述肝癌为原发性肝癌。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂，所述试剂包括用于检测fitm1基因的cg06186808甲基化位点的甲基化水平的检测试剂。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂，所述试剂包括用于检测hist1h2bj基因的cg04424621的甲基化水平的检测试剂。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂，所述试剂包括用于检测fitm1基因的cg06186808甲基化位点和hist1h2bj基因的cg04424621的甲基化水平的检测试剂。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种用于辅助诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测fitm1基因的cg06186808甲基化位点和/或hist1h2bj基因的cg04424621的甲基化水平的检测试剂。

在本发明的实施方式中，所述试剂盒包括针对cg06186808和/或cg04424621的pcr引物和甲基化测序引物；

其中，针对cg06186808的pcr引物和甲基化测序引物，包括：

pcr上游引物序列为(seqidno.3)：5’-aggggagggaatatggag-3’，下游引物序列为(seqidno.4)：biotin-5’-accactactaccaaccaaacataata-3’，甲基化测序引物序列为(seqidno.5)：5’-gttttgttgtattttggaag-3’。

其中，针对cg04424621的pcr引物和甲基化测序引物；

pcr上游引物序列为(seqidno.6)：5’-tgggatattaggtttttttaaatgagtta-3’，下游引物序列为(seqidno.7)：biotin-5’-caccctactacatattacaaaatattcct-3’，甲基化测序引物序列为(seqidno.8)：5’-atgagttattttttttgggt-3’。

在本发明的实施方式中，对特异性位点的甲基化水平进行定量检测的方式为焦磷酸测序法。

相较于现有技术，本发明的优势在于：

本发明发现了与原发性肝细胞癌人群相关基因的特异性dna甲基化位点，并针对该特异性位点设计焦磷酸测序pcr引物和测序引物，通过焦磷酸测序能对该特异性位点的甲基化进行快速准确的定量检测。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为fitm1基因pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为fitm1基因焦磷酸测序结果图，其中框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

图3为hist1h2bj基因pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为hist1h2bj基因焦磷酸测序结果图，其中框内柱状部分显现甲基化的位点及甲基化百分比；1为癌组织，2为癌旁组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，单独存在b，同时存在a和b三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，a/和b，可以表示：单独存在a，单独存在a和b两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并且不意在限制本发明的示例实施例。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”意在包括复数形式，除非上下文明确指示相反意思。还应当理解术语“包括”、“包括了”、”包含”、和/或“包含了”当在本文中使用时，指定所声明的特征、整数、步骤、操作、单元和/或组件的存在性，并且不排除一个或多个其他特征、数量、步骤、操作、单元、组件和/或他们的组合的存在或增加。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

此外，特定特征、结构、功能或特性可以以任何适合的方式组合到一个或多个实施例中。例如，第一实施例可以结合第二实施例，只要与这两个实施例相关联的特定特征、结构、功能或特性不互相排斥。

实施例

1.特异性位点分析

用infiniumhumanmethylation27beadchip甲基化芯片筛查原发性肝细胞癌与对应的癌旁组织中甲基化谱之间的差异，发现在原发性肝细胞癌的基因组dna中，fitm1基因启动子区一个位点(该位点在上述甲基化芯片中的编号为(cg06186808)的甲基化水平明显高于癌旁组，hist1h2bj基因启动子区一个位点(cg04424621)的甲基化水平明显低于癌旁组。

fitm1基因特异性位点所在的序列为(seqidno.1)：

cctgctcaaggtgctgctctgggtggcctctgccttgctgtactttggaagcgaacaggc[cg]cccgccttctgggcagcccctgcttacggcgcctctaccatgcctggctggcagcagtgg

hist1h2bj基因特异性位点所在的序列为(seqidno.2)：

gtaagcaacttgggatattaggcctttccaaatgagccatctttcttgggctccagataa[cg]tcatcccagtattttactcacttcattttaaaggaatactttgcaacatgcagtagggtg

为检测该筛查结果的准确性，设计相关特异性引物，利用焦磷酸测序法对该特异性位点的特异性进行验证。

2.人基因组dna提取

1)采集42例原发性肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织，提取每个样本的基因组dna，操作按照德国qiagenqiaampdnaminikit(cat.no.51304)说明书进行。

2)对获取的基因组dna样本进行琼脂糖凝胶电泳分析。

3)重亚硫酸盐转化

使用德国qiagen公司转化试剂盒epitectfastdnabisulfitekit(cat.no.59824)进行重亚硫酸盐转化，步骤按照该试剂盒说明书进行。

4.引物设计

以经重亚硫酸盐转化后的基因组dna为模板，使用qiagen公司pyromarkassaydesign2.0软件设计焦磷酸测序pcr引物及测序引物，并由上海生工生物工程有限公司合成。

其中，针对cg06186808的pcr引物和甲基化测序引物，包括：

pcr上游引物序列为(seqidno.3)：5’-aggggagggaatatggag-3’，下游引物序列为(seqidno.4)：biotin-5’-accactactaccaaccaaacataata-3’，甲基化测序引物序列为(seqidno.5)：5’-gttttgttgtattttggaag-3’。

其中，针对cg04424621的pcr引物和甲基化测序引物；

pcr上游引物序列为(seqidno.6)：5’-tgggatattaggtttttttaaatgagtta-3’，下游引物序列为(seqidno.7)：biotin-5’-caccctactacatattacaaaatattcct-3’，甲基化测序引物序列为(seqidno.8)：5’-atgagttattttttttgggt-3’。

5.焦磷酸测序

1)pcr扩增

以重亚硫酸盐转化后的基因组dna为模板，利用下列条件进行pcr反应，体系如下：

反应条件：95℃15min；

94℃30sec,60℃1min,72℃1min(45个循环)；

72℃10min.

反应完成后对pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，验证产物的特异性与准确性，见图1、3。

2)焦磷酸测序

在德国qiagenpyromarkq48id平台上，进行焦磷酸测序，具体步骤按仪器说明书进行。

3)dna甲基化检测结果

甲基化结果显示：cg06186808位点癌旁组的甲基化水平明显低于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为65.94±11.32，癌组甲基化平均水平为91.89±12.48(p<0.01)；cg04424621位点癌旁组的甲基化水平明显高于癌组，该位点癌旁组甲基化平均水平为25.74±7.14，癌组甲基化平均水平为8.46±3.81(p<0.01)。测序图分别见图2、4。

4)结论：研究结果发现原发性肝细胞癌中，fitm1基因cg06186808位点的甲基化水平明显低于癌旁组，hist1h2bj基因cg04424621位点的甲基化水平明显高于癌旁组。因此，本发明针对位点cg06186808和cg04424621设计的焦磷酸测序pcr引物和测序引物可用于原发性肝细胞癌中两位点的甲基化水平进行定量检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>杨小丽

<120>人fitm1和hist1h2bj基因甲基化位点的检测和应用

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