一种处理焦化废水的微生物固定化颗粒的制备方法

本发明涉及有机污染的生物修复领域，特别是针对焦化废水的处理，利用本方法制备微生物固定化颗粒，可使功能微生物定殖于载体上，在一定程度上屏蔽焦化废水等高毒性污染物对微生物的抑制和毒害作用，可以提高微生物的降解效果和整个反应系统中处理污染的负荷及稳定性。

背景技术：

随着我国工业的快速发展，焦化废水排放量日益增多，大量含有苯酚、吡啶、喹啉等焦化废水特征污染物随着废水的排放进入环境中，对人类的生命健康和生态环境的稳定带来巨大的威胁。目前，生物处理技术是处理此类废水的重要技术手段之一，大量针对特定污染物的高效降解菌株被研究者从环境中筛选出来，为生物修复技术提供了坚实的基础。但是，焦化废水中所含的大量高毒性污染物和过高的cod严重抑制了微生物的活性；此外，传统的生物修复技术在实际使用过程中存在易流失，受环境影响大，易被废水中高毒性物质抑制等缺点，如何解决上述问题成为环境微生物和生物修复领域广泛关注的一个焦点问题。

固定化微生物技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，它能够大幅度提升参加反应的微生物细胞浓度，增强微生物在恶劣外界环境的耐受性，提高系统负荷和系统的稳定性。此外，固定化载体除了为微生物提供定殖场所外，还能够形成保护微生物的微环境，屏蔽土著微生物对被固定微生物体的恶性竞争、吞噬和环境中有害物质的毒害作用，从而缩短降解的滞后期，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能。因此，该技术被广泛应用至水、土、气体环境污染治理中。目前，微生物固定化技术已在处理苯酚、吡啶、喹啉等单一污染领域取得了极佳的效果，极大的提高了微生物的活性及降解效率。

用于焦化废水处理的固定化技术主要为依据包埋固定化和吸附固定化技术发展起来的复合固定技术，复合固定化技术整合了包埋固定化及吸附固定化技术的优点，在保证微生物密度的同时又可以有效防止微生物泄露，而且包埋颗粒成形好，机械强度高，固定化周期短。但是，以包埋技术为基础的固定化技术往往会由于载体的传质阻力而导致传氧、传质上的问题，然而本发明所开发的固定化技术能够在载体内部形成较大空洞，在载体表面形成传质通道，大幅度改善颗粒的传质性能。

聚乙烯醇(pva)是被广泛采用的固定化包埋载体，具有低毒性、应用广、机械强度好等优点。但是，使用纯聚乙烯醇进行包埋时，往往会导致颗粒黏连的问题，因此一般配合海藻酸钠混合使用，海藻酸钠(sa)同样是一种被广泛采用的固定化包埋材料，其具有极佳的生物适应性，加入海藻酸钠能够解决聚乙烯醇黏连的问题，有利于成球和固定化颗粒的制备。

技术实现要素：

本发明所要解决的菌株在焦化废水中活性受抑制难以存活导致降解效果不佳的技术问题，在于提供了一种微生物固定化方法，能使固定化微生物高效处理焦化废水。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种处理焦化废水的微生物固定化颗粒制备方法，其特征在于：将高效降解菌株利用特定混合包埋载体进行固定化，然后投加到污染水体或反应器中进行生物降解。

首先，制备混合载体溶液：称取一定量的醇解度为99％的聚乙烯醇与海藻酸钠于烧杯中，海藻酸钠与聚乙烯醇均需使用分析纯，搅拌均匀，保证聚乙烯醇与海藻酸钠充分混合后加入去离子水，边加水边进行搅拌使其混匀，聚乙烯醇与海藻酸钠的最终添加质量比应为4∶1，聚乙烯醇与海藻酸钠的质量浓度应分别为8％(w/v)与2％(w/v)，之后进行121℃高压湿热灭菌20min，完成后取出常温下冷却至25-30℃。

然后，制备用于载体固化的交联剂，本发明所使用的混合交联剂分别为硼酸与cacl2的混合溶液及硝酸钠溶液，其中硼酸与cacl2的混合溶液制备方法为：在25℃的饱和硼酸溶液中加入cacl2搅拌使其溶解，最终交联剂中cacl2的质量浓度应为2％(w/v)；硝酸钠溶液的制备方法为：在去离子水中加入的硝酸钠，配制成质量浓度为45％(w/v)的硝酸钠溶液，待硝酸钠完全溶解后，冷却至室温。

最后，进行固定化颗粒的制备：将功能菌株培养至对数生长末期收集菌体，用无菌水清洗3次后悬浮于无菌水中，并调节od600(600nm处吸光度)值为3.0的菌液，将菌液加入温度为25℃的混合载体溶液中(10％加入量，即每90ml配制的载体溶液加入10ml菌液)，至少搅拌30min以使载体与菌液充分混合，搅拌均匀后静置1h，利用注射器吸取载体与菌液混合液滴加至25℃的饱和硼酸与cacl2混合溶液中，形成2-3cm的颗粒，在25℃交联2h，交联完成后取出，用无菌水冲洗3次后再次加入硝酸钠溶液中，在25℃下交联22h，然后取出颗粒用无菌水冲洗3次，得到的固定化颗粒浸泡在生理盐水中并放置于4℃冰箱中备用。

使用固定化微生物颗粒进行生物降解之前须进行固定化微生物的增殖和活化，其主要特征在于：将固定化微生物在无机盐培养基中培养，并添加可被微生物降解利用的特异底物(即某种污染物，针对焦化废水，应采用苯酚、吡啶、喹啉等特征污染物进行培养)，待底物被降解殆尽后，再次加入适量该底物，待降解效果稳定后逐步提高底物浓度，直至降解效果再次稳定后，维持该底物浓度再连续培养3-5次后将固定化微生物连同该无机盐培养基转移至一个无菌瓶中保存作为活化后的固定化微生物备用。

附图说明

图1为固定化颗粒表面扫描电镜照片

图2为固定化颗粒内部扫描电镜照片(中央区域)

图3为固定化颗粒内部扫描电镜照片(边缘区域)

根据本方法制备的微生物固定化颗粒，在结构形态上其应具有以下特征：

如图1所示，在固定化颗粒表面，表面结构粗糙且存在大量的微小孔道，此外，颗粒表面具有大量不规则凸起，在这些凸起部位存在大量被载体所网缚的微生物。在使用过程中，这些凸起成为固定化颗粒内部与外部进行物质交换的通道。

如图2固定化颗粒剖视图所示，在固定化颗粒中心部位存在较大的空洞，空洞中存在大量网状复杂孔洞结构，微生物附着在这些网状结构中进行定殖和生物降解。由于载体内部存在空洞，大分子污染物质仍能很好地向固定化颗粒内部迁移，通过表面的凸起的传质通道及颗粒内部的空洞，减少了固定化载体对大分子物质传递的阻碍作用，弥补了包埋法对大分子物质传质效果不佳的缺点。此外如图3固定化颗粒剖视图所示，越靠近固定化颗粒的边缘地带，颗粒内的孔隙直径越小，孔隙数量越多，在最外层边缘部分形成大约6-8μm的致密层，可以有效防止微生物的泄露。

具体实施方式

为进一步说明本发明，特以一株红球菌(rhodococcussp.w7)的固定化为例加以说明实施过程。

实施实例：

红球菌的固定化，步骤如下：

1、红球菌菌液的培养。

菌液培养基组成：牛肉膏5.00g，蛋白胨10.00g，nacl5.00g，水定容到1l，ph7.0；

接种和培养条件：从平板上挑取一单菌落，接种于100mllb液体培养基中，在30℃、180rpm摇床培养至对数生长期后期，将菌液在室温下6000rpm离心10min后用无菌水洗涤两次，并制成菌悬液。

2、固定化微生物制备。方法如下：

首先，制备混合载体溶液：称取醇解度为99％的聚乙烯醇(分析纯)8g，海藻酸钠(分析纯)2g于烧杯中，搅拌均匀，保证聚乙烯醇与海藻酸钠充分混合后加入90ml去离子水，边加水边进行搅拌使其混匀，之后再121℃下在高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，完成后取出冷却至25-30℃。

然后，制备用于载体固定化的交联剂，其中硼酸与cacl2的混合溶液制备方法为：量取100ml25℃的饱和硼酸溶液，加入2gcacl2搅拌使其溶解，最终交联剂中cacl2的质量浓度为2％(w/v)；硝酸钠溶液的制备方法为：量取100ml去离子水，加入40g的硝酸钠，配制成质量浓度为40％(w/v)的硝酸钠溶液，待硝酸钠完全溶解后，放至25℃再使用。

最后，进行固定化颗粒的制备：将10ml菌液(od600值为3.0)加入25℃的混合载体溶液中，搅拌30min以使载体与菌液充分混合，搅拌均匀后静置1h，利用注射器吸取载体与菌液混合液滴加至饱和硼酸与cacl2混合溶液中，形成2-3mm的颗粒，在25℃交联2h，交联完成后取出，用无菌水冲洗3次后放入硝酸钠溶液中，在25℃下交联22h，然后取出颗粒用无菌水冲洗3次，得到的固定化颗粒浸泡在生理盐水中并放置于4℃冰箱中备用。上述固定化颗粒的制备过程需在无菌环境下进行。

无机盐培养基组成：nacl1.00g，nh4cl1.34g，k2hpo41.0g，kh2po40.50g，mgso4·7h2o0.20g；水定容到1l，ph为7.0。

3、固定化菌株细胞的增殖与活化。首先将固定化颗粒置于无机盐培养基中，加入50ppm的苯酚，在30℃，180rpm的摇床上培养，待苯酚被降解消耗殆尽后，再次加入50ppm的苯酚，待其降解50ppm苯酚效果稳定后，加入100ppm苯酚并重复上述步骤，维持该底物浓度再连续培养3-5次后将固定化微生物连同该无机盐培养基转移至一个无菌瓶中保存作为活化后的固定化微生物备用。在驯化过程中，由于rhodococcussp.w7菌落呈现红色，固定化颗粒会随着驯化时间的增长而逐渐呈现出红色，当驯化完成时，颗粒的颜色应不再发生变化。