一种具有药物缓释性能的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素的制备方法

本发明涉及药物缓释技术领域，特别是一种基于α-蒎烯和蔗渣纳米纤维素的新型药物缓释载体——α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素的制备方法。

背景技术：

农药的使用是防治植物病虫害，保证粮食产量和质量稳步增长的有效手段，然而传统的农药由于其应用方式和环境因素等的影响存在着易流失到空气或土壤中造成利用率低、环境污染等缺陷。因此，寻找新型的缓释载体、创新农药剂型成为当前农药应用技术领域的研究热点之一。生物质资源的高值化利用为这一研究提供了有效的思路。

纤维素是一种来源广泛且含量丰富的生物质资源，主要来源于棉花、木材和农作物秸秆中，在自然环境中可降解，而且对人体和哺乳动物无毒无害。从化学结构上，纤维素系由葡萄糖组成的大分子多糖，其表面富含羟基，可用于进行醚化、酯化等化学改性，也可与其他分子形成氢键结合。因此，纤维素被认为是药物及其他生物活性小分子的良好载体。甘蔗在制糖过程产生的固体废弃物甘蔗渣被认为是获得纤维素的良好来源。使用一定的化学、物理方法将漂白蔗渣浆进行加工，可获得解纤化程度高的、一维尺度上为纳米级别的纤维素产品，即纳米纤维素。纳米纤维素较纤维素而言具有明显的优势，例如比表面积大，表面暴露的羟基更多，更利于进行化学改性和药物负载。

松节油主要成分是α-蒎烯。α-蒎烯本身及其衍生物具有多种生物活性，如除草、抑菌、抗肿瘤、驱避等。这可能是由于α-蒎烯具有独特的双环单萜分子骨架，是天然的脂溶性小分子。在我们此前的研究中，一种α-蒎烯基生物活性化合物桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼被证实具有优异且广谱的体外抗真菌活性，是极具潜力的杀菌剂先导化合物，它可由α-蒎烯经关键中间体桃金娘烯酸酰氯与2-吡啶甲酰肼的反应得到。

本发明基于桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的分子结构，设计了一种具有一定脂溶性的药物缓释载体，首次将天然产物α-蒎烯的母环引入到纤维素分子的骨架中以增强载体的脂溶性和分散性，从而提高其药物负载和缓释性能，采用经济、简便、高效的方法合成了结构新颖的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载体。经载药和缓释性能测试发现，相应的载药复合物具有一定的药物负载量和包封率，在体积分数5％的乙醇水溶液体系中具有分段缓释的性能。该α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素及其载药复合物的制备方法和药物缓释应用迄今未见国内外报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素及其载药复合物的制备方法，首次将天然产物α-蒎烯的母环引入到纤维素分子的骨架中以增强载体的脂溶性和分散性，从而提高其药物负载和缓释性能，采用经济、简便、高效的方法合成了结构新颖的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载体。解决具有脂溶性的农药活性分子在实际应用中利用率低、流失严重的问题，制备方法具有简单，高效，成本低的优点。

本发明采用以下技术方案达到上述目的：一种具有药物缓释性能的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素，其结构通式如下：

所述的具有药物缓释性能的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素及其载药复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将废弃甘蔗渣粉碎后用去离子水脱去其中的水溶性杂质，然后用ph≈4的2wt％naclo2溶液和4wt％的naoh溶液交替、反复处理以脱除木质素和半纤维素，用去离子水洗涤至中性，收集残渣，用乙醇脱水，干燥至恒重，粉碎后加入一定量的去离子水打浆，得到固含量约为1wt％的漂白蔗渣浆；

(2)按如下反应式，将步骤(1)得到的漂白蔗渣浆中加入nabr和tempo，用量分别为1mmol/g漂白蔗渣和0.1mmol/g漂白蔗渣，混合均匀后用0.5mnaoh溶液调节至ph≈10，冰浴下缓慢滴入活性氯≥7.5％的30mlnaclo溶液，滴完后在室温下继续反应6h，期间用0.5m的naoh溶液将反应体系保持为弱碱性，反应结束后抽滤并用去离子水和0.5m盐酸交替洗涤滤饼，干燥至恒重，得到干燥的tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝tocn；

(3)按如下反应式，向250ml的反应瓶中加入100ml无水乙醇及40gseo2，回流半小时后蒸除乙醇，得到的白色液体为亚硒酸单酯氧化剂，再加入30ml1,4-二氧六环，配制成亚硒酸单酯的1,4-二氧六环溶液，把54.03gα-蒎烯、60ml1,4-二氧六环和1.0g对苯二酚加入到250ml三口瓶中，将油浴温度升至65℃后将亚硒酸单酯的1,4-二氧六环溶液缓慢滴加至三口瓶，继续升温的同时控制滴加速度，使其略快于馏出速度，滴加完毕后维持油浴温度在100℃，直至没有馏出液产生为止，抽滤回收单质硒，减压蒸1,4-二氧六环，加入0.90g对苯二酚和1.75g亚硫酸钠进行水蒸气蒸馏得澄清的馏出液，加入氯化钠饱和馏出液后，用无水乙醚萃取水相3次，每次用量30ml，合并有机层，最后用无水硫酸镁干燥并蒸馏除去乙醚，得到粗产品为浅黄色透明液体；

将15.5g桃金娘烯醛溶于100ml乙腈，再向其中依次加入5.3gpeg-400、40ml质量分数为7.4％的nah2po4水溶液、9.7ml质量分数为30％的h2o2水溶液，冰浴搅拌10min使其冷却至10℃以下，继续搅拌并缓慢滴加100ml质量分数为17％的naclo2水溶液。滴完后室温下继续搅拌7h，反应结束后加入1.0g亚硫酸钠，再用适量稀hcl调节反应液ph＝3.0，接着用无水乙醚萃取3次，每次用量50ml，合并有机相，依次用饱和nahso3和饱和食盐水洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，蒸除乙醚后得粗产物为淡黄色黏稠液体，静置一段时间成蜡状固体；

绝水条件下，将20.0g桃金娘烯酸溶于50ml苯，再加几滴n,n-二甲基甲酰胺，搅拌下缓慢滴加17.3g二氯亚砜和20ml苯配成的溶液，滴完后升温回流6～8小时，反应结束后常压蒸馏除去苯和未反应掉的二氯亚砜，减压蒸馏收集70～71℃/5mmhg馏分，得淡黄色液体，即桃金娘烯酸酰氯中间体；

将干燥的tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝悬浮于三乙胺中，固体浓度为0.01g/ml，然后用上述制备的桃金娘烯酸酰氯作为酯化试剂，用量为1g/gtocn，在加热回流下反应10h，反应结束后抽滤并用无水乙醇和去离子水多次洗涤固体，干燥至恒重，即得α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素；

(4)制备负载桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物，取同等质量的药物和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载体于体积分数60％的乙醇水溶液中混合均匀，用φ6、500w的高强度超声处理30min后静置一段时间使乙醇挥发完全，抽滤、干燥即得负载桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物。

制备得到的负载桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物在药物缓释中的应用。

本发明的有益效果：

(1)首次以甘蔗渣和松节油为原料，选用三乙胺、tempo等价格低廉且易获得的溶剂及试剂，通过酯化反应将相应的主要成分纤维素和α-蒎烯的化学结构整合，具有原料绿色化、手段绿色化和经济高效的特点，实现了生物质优势资源的高值化利用，符合绿色化学理念。

(2)所制备的tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝长径比大、分散性好，以其为原料制备的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素具有松散的纤维结构，并具有一定数量和大小的孔道，有利于药物负载，相应的载药复合物具有同样的微观形态，而且药物在其中的分布较为均匀。

(3)采用桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼作为模型药物，负载在α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素上并进行药物释放实验，测试结果表明，所制备的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物具有较高的药物负载量和包封率，分别为0.32和0.49，在体积分数5％的乙醇水溶液中具有分阶段的体外缓释效果，总释放周期可达7天，符合农用杀菌剂的使用需求。

附图说明

图1是桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼在乙腈中的紫外吸收值-浓度标准曲线。

图2是漂白蔗渣浆(a)、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝(b)和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素(c)的ir谱图。

图3是漂白蔗渣浆(a)、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝(b)和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素(c)的xrd图谱。

图4是α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素(a)及其载药复合物(b)的sem照片。

图5是tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝的tem照片。

图6是桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼在体积分数5％乙醇水溶液中的紫外吸收值-浓度标准曲线。

图7是载药复合物的缓释规律曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。

实施例1

漂白蔗渣浆的制备

取100g本地的废弃甘蔗渣，用打粉机粉碎，再加入3l去离子水浸泡以去除其中的水溶性杂质，再用大量去离子水反复洗涤至澄清，然后加入2l预先配制的2wt％的naclo2溶液，用5％稀盐酸调节ph≈4后在70℃水浴锅中加热2h，用于去除其中的木质素并漂白，再用去离子水洗涤至中性，接着加入1l预先配制的4wt％的naoh溶液，在80℃水浴锅中加热2h以脱去其中的半纤维素，用去离子水洗涤至中性，以上过程重复4-6次，收集残渣，用乙醇脱水，在60℃烘箱中干燥12h以上，得固体31.790g，将以上粉碎后加入3.1l去离子水打浆，即得固含量约为1wt％的漂白蔗渣浆。

产物经红外和x射线粉末衍射分析表征。

实施例2

tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝的制备

将200ml固含量约1wt％的漂白蔗渣浆、0.211gnabr和0.032gtempo混合均匀后用0.5mnaoh溶液调节至ph≈10，在冰浴下缓慢滴入30ml活性氯≥7.5％的naclo溶液，滴完后在室温下继续反应6h，期间不断用0.5m的naoh溶液调节ph，使之保持为弱碱性，反应结束后抽滤并用去离子水和0.5m的盐酸交替洗涤滤饼，得到的白色粉末在60℃烘箱下干燥，得白色粉末1.035g，即tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝。

产物经红外、x射线粉末衍射和透射电镜分析表征。

实施例3

α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素的制备

向250ml的反应瓶中加入100ml无水乙醇及40gseo2，回流半小时后蒸除乙醇，得到的白色液体为亚硒酸单酯氧化剂，再加入30ml1,4-二氧六环，配制成亚硒酸单酯的1,4-二氧六环溶液，把54.03gα-蒎烯、60ml1,4-二氧六环和1.0g对苯二酚加入到250ml三口瓶中，将油浴温度升至65℃后将亚硒酸单酯的1,4-二氧六环溶液缓慢滴加至三口瓶，继续升温的同时控制滴加速度，使其略快于馏出速度，滴加完毕后维持油浴温度在100℃，直至没有馏出液产生为止，抽滤回收单质硒，减压蒸1,4-二氧六环，加入0.90g对苯二酚和1.75g亚硫酸钠进行水蒸气蒸馏得澄清的馏出液，加入氯化钠饱和馏出液后，用无水乙醚萃取水相3次，每次用量30ml，合并有机层，最后用无水硫酸镁干燥并蒸馏除去乙醚，得到粗产品为浅黄色透明液体。

将15.5g桃金娘烯醛溶于100ml乙腈，再向其中依次加入5.3gpeg-400、40ml质量分数为7.4％的nah2po4水溶液、9.7ml质量分数为30％的h2o2水溶液，冰浴搅拌10min使其冷却至10℃以下，继续搅拌并缓慢滴加100ml质量分数为17％的naclo2水溶液。滴完后室温下继续搅拌7h，反应结束后加入1.0g亚硫酸钠，再用适量稀hcl调节反应液ph＝3.0，接着用无水乙醚萃取3次，每次用量50ml，合并有机相，依次用饱和nahso3和饱和食盐水洗涤，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，蒸除乙醚后得粗产物为淡黄色黏稠液体，静置一段时间成蜡状固体。

绝水条件下，将20.0g桃金娘烯酸溶于50ml苯，再加几滴n,n-二甲基甲酰胺，搅拌下缓慢滴加17.3g二氯亚砜和20ml苯配成的溶液，滴完后升温回流6～8小时，反应结束后常压蒸馏除去苯和未反应掉的二氯亚砜，减压蒸馏收集70～71℃/5mmhg馏分，得淡黄色液体，即桃金娘烯酸酰氯中间体。

将1.0g干燥的tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝悬浮于100ml三乙胺中，然后在室温下缓慢滴加15ml含1.0g桃金娘烯酸酰氯的二氯甲烷溶液，滴完后加热回流10h，反应结束后抽滤并用无水乙醇和去离子水多次洗涤固体，得到的白色粉末在60℃烘箱下干燥，得白色粉末0.912g，即α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素。

产物经红外、x射线粉末衍射和扫描电镜分析表征。

实施例4

桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物的制备

取70.0mgα-蒎烯基蔗渣纳米纤维素悬浮于20ml去离子水，并将该悬浮液逐滴滴入含70.4mg桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的30ml乙醇溶液，磁力搅拌20min使混合均匀后对其进行φ6、500w的高强度超声处理30min，静置一段时间使乙醇挥发完全，抽滤、干燥，得白色粉末86.4mg，即负载桃金娘烯醛基2-吡啶甲酰肼的α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素载药复合物。

产物经扫描电镜分析表征。

取一定量药物完全溶解于乙腈中，分别配制浓度为5μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、35μg/ml、45μg/ml和55μg/ml的含药标准溶液，在uv-vis中测得其最大吸收波长为219.5nm，并记录相应的吸收值，作如图1所示的吸收值-浓度线性拟合的标准曲线。

取载药复合物1.3mg于离心管中，加入10.0ml乙腈，震荡使其中的药物充分溶出，取适量上清液进行uv-vis检测，并记录最大吸收波长及相应波长下的吸收值。根据上述测得的标准曲线计算出被测溶液的浓度后通过以下公式计算载药量和包封率：

式中，b为被测溶液的浓度数值，单位为μg/ml.经uv-vis测定，载药复合物的载药量和包封率分别为0.32和0.49，表明该载体具有较好的药物负载能力。

实施例5

对实施例一至四中制备的样品进行仪器表征，具体如下：

(1)红外光谱分析：采用傅里叶变换红外光谱仪(ft-ir)及kbr压片法制样对漂白蔗渣浆、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素进行测定。

(2)结晶情况分析：采用x射线衍射仪(xrd)对漂白蔗渣浆、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素在衍射角2θ＝5～40°进行测定。

(3)微观形貌分析：采用场发射扫描电子显微镜(fe-sem)观察α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素及其载药复合物的微观形貌。

(4)纤丝粒径分析：采用透射电子显微镜(tem)定性地观察tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝的粒径。

图2为漂白蔗渣浆(a)、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝(b)和蒎烯基蔗渣纳米纤维素(c)的ir谱图。三者在波数3404cm^-1和2902cm^-1处均出现吸收峰，分别对应于纤维素的o-h和c6-h伸缩振动。但是，tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝在1732cm^-1处出现吸收峰，而漂白蔗渣浆没有出现此峰，因此可以将该信号归属于羧基的c＝o伸缩振动；此外，二者在1630cm^-1处均出现吸收峰，这可以认为是coo^-的c＝o特征吸收峰，但是从吸收强度来看前者明显大于后者，这是因为在制备漂白蔗渣浆过程中纤维素的少部分ch2oh被氧化成coo^-，而tempo氧化处理漂白蔗渣浆的过程则使得更多的ch2oh转化成为coo^-，且最终获得的tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝未被彻底酸化。此外，由于有更多ch2oh转变为coo^-，所以tempo氧化蔗渣纳米纤维素在2902cm^-1处的信号峰稍弱于1630cm^-1而漂白蔗渣浆则相反。由此可以证明，tempo氧化处理成功地使ch2oh转化成coo^-或cooh，这更利于纤维素纳米纤丝解纤和分散。酯基的c＝o吸收峰可能和羧基重叠，均在波数1732cm^-1处出现，但是在cooh和coo^-总量一定时，蒎烯基蔗渣纳米纤维素比tempo氧化蔗渣纳米纤维素在1732cm^-1处的信号峰明显增强，由此可以证明酯基的生成。

图3为漂白蔗渣浆(a)、tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝(b)和α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素(c)的xrd图谱。三者在衍射角2θ＝15.7°、22.5°和34.4°处均有吸收峰，分别对应于101面、002面和040面，说明三个样品中均存在纤维素i型结晶结构，即tempo氧化处理和酯化反应过程未明显破坏纤维素的结晶区。然而，tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝比漂白蔗渣浆在2θ＝22.5°处的衍射峰相对强度略有减小，且在衍射角2θ＝18～22°处出现了一个较小的宽峰，这是因为羧基化反应仅发生在纤维表面，破坏了漂白蔗渣浆的无定形区和少量结晶区。此外，α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素在2θ＝22.5°处的衍射峰相对强度反而增大，说明其结晶区又重新生成。漂白蔗渣浆在2θ＝26.5°处的小衍射峰在tempo氧化处理后消失，酯化反应后又重新生成，说明在tempo氧化处理和酯化反应的过程中发生了无定形区和结晶区的重组。

图4为α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素(a)及其载药复合物(b)的sem照片。由于α-蒎烯母环的引入，α-蒎烯基蔗渣纳米纤维素具有松散的纤维结构，其表面粗糙有枝节并且出现了一定数量和大小的孔道，有利于药物负载。同样地，在药物负载过程中，由于载体中含有大体积且脂溶性结构，药物能均匀进入其中与纤维紧密复合，得到了药物粒子分布均匀、具有开放的网状结构的载药复合物。

图5为tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝的tem照片。tempo氧化蔗渣纤维素纳米纤丝具有长径比大、分散性好的特点，这是由于tempo氧化处理使纤维素的ch2oh转变为了coo^-，增加表面负电荷，有利于纳米纤丝分散，这一形态的纤维素在后续的酯化反应中具有更好的反应活性。

实施例6

载药复合物的体外缓释性能测试

取一定量药物完全溶解于体积分数为5％的乙醇水溶液中，分别配制浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml和60μg/ml的含药标准溶液，在uv-vis中测得其最大吸收波长为219.5nm，并记录相应的吸收值，作如图6所示的吸收值-浓度线性拟合的标准曲线。

取载药复合物6.9mg于50ml锥形瓶中，并加入50ml预先配制的体积分数为5％的乙醇水溶液作为缓释介质。在不同的时间节点取出一定体积的上清液进行uv-vis测试并根据上述标准曲线确定其浓度，再补加同等体积的新鲜缓释介质以维持体积恒定。根据以下公式计算载药复合物中药物的累积释放率并绘制缓释规律曲线：

图7为载药复合物的缓释规律曲线。载药复合物在体积分数5％的乙醇水溶液中具有分阶段体外缓释的效果。第一阶段为0～25h，表现为纤维表面的药物突释，总释放量达到79.9％；第二阶段为26～60h，溶剂进入网状结构的纤维内部将药物缓慢溶出，因此药物的释放量上升不明显；第三阶段为61～168h，网状纤维被破坏，药物以恒定速率溶出，表现为累积释放量线性上升，最终可达99.8％.三个阶段的总释放周期为7天，总释放量接近100％，符合农用杀菌剂的使用需求。