一种检测新型冠状病毒的PNA探针结构及合成方法

本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒的pna探针结构及合成方法。

背景技术：

所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。新型冠状病毒是一种仅含有rna的病毒，病毒中特异性rna序列是区分该病毒与其他病原体的标志物，即靶序列。

检测新型冠状病毒特异序列的方法中最常见的是荧光定量pcr(聚合酶链式反应)。核酸检测的试剂实际上是一段特异性寡核苷酸序列，该序列是与病毒中特异性rna靶序列相匹配的，两者通过碱基配对原理杂交后，释放出荧光信号，从而特异性识别病毒。

在众多的核酸探针中，荧光核酸探针主要采用荧光强度作为定量分析的信号，具有灵敏度高、设计多样化和定量分析能力强等特点，成为分析化学的研究热点之一。但荧光核酸探针也存在背景噪音大，识别特异性不十分理想，有假阳性信号等缺点。

pna是一种人工合成的具有多肽骨架的dna类似物，正因为与dna及其相似的结构，pna能够通过watson-crick碱基互补形式与单链核酸杂交形成双螺旋的稳定复合物。更重要的是，pna与dna、rna的亲和性也比dna更强，杂交稳定性大大提升，并且在watson-crick原则上不能允许一个碱基错配，特异性也大大提高，此外，对核酸酶与蛋白酶有着的良好的抗性。正是基于这三点，pna肽核酸探针有着更好的灵敏度，更强的稳定性和更高的选择性，更有发展意义。

核酸探针检测是诊断的主要和重要的测试手段，但其瓶颈在于检测速度，检测灵敏度及检测准确度(或特异性或选择性)需要提高。因此，现需要一种能够解决以上问题的检测新型冠状病毒的pna探针结构及合成方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测新型冠状病毒的pna探针结构及合成方法，能够提高新型冠状病毒的检测速度、灵敏度和准确度。

本发明提供了如下的技术方案：

一种检测新型冠状病毒的pna探针结构，以肽核酸(即pna)为骨架模拟和取代常规dna或rna中磷酸戊糖酯骨架，即探针骨架为pna骨架；pna侧链上用以杂交识别的碱基序列的正确顺序，即为下列顺序：5'-fam-ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg-bhq1-3'或者5‘-fam-ttgctgctgcttgacagatt-tamra-3’。

一种检测新型冠状病毒的pna探针结构的合成方法，制备0.1mmolpna的方法包括如下步骤：

s1：将0.1g树脂与适量dmf加入柱反应器中，振摇溶胀30min后抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将fmoc-肽核酸单体0.5mmol、dcc0.5mmol、hosu0.5mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，半小时后转移至固相反应器，加入适量dmf避光振摇反应3h，反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干；

s2：向s1制备的溶液中加入脱保护试剂20％(v/v)哌啶/dmf溶液，振摇30min脱下树脂上的首个pna单体的保护基fmoc，抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将从碱基序列3’→5’第二个fmoc-pna单体0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，半小时后转移至装有肽核酸-树脂的固相反应器，加入适量dmf避光振摇反应3h；反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干；重复s2中的上述步骤，脱去n-末端的fmoc保护基，进入连接下一个肽核酸单体循环，不断两两缩合，直至合成预期得到的寡聚体；最后一次缩合完成后，得到的寡聚体-树脂以甲醇洗5次，每次振摇2min，抽干，抽真空干燥过夜，称重；

s3：称取s2步骤中制得的一定量寡聚体-树脂复合物放入反应器中，并按比例配好切割试剂，均放入冰箱中冷却数分钟；向反应器中缓慢加入切割剂，室温下磁力搅拌3h；过滤，加入4ml裂解溶液重复切割0.5h；过滤，用10ml90％tfa/dcm洗涤树脂，洗涤液与滤液一并转入烧瓶，35℃减压蒸馏；浓缩液逐滴滴入十倍体积的预冷乙醚，振荡，冰箱静置30min；高速离心，倒去上清液，真空干燥过夜，得粗产品；用重蒸水溶解，冻干，得到白色粉末，称重。

5’端头荧光团的键合包括如下步骤：

s1：fam-pna合成，

加入脱保护试剂20％(v/v)哌啶/dmf溶液，振摇30min脱下树脂上的fmoc保护基，抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将fam(5-羧基荧光素)0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，转移至装有pna-树脂的固相反应器，加入适量dmf避光振摇反应3h；反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干；

s2：fam-pna-tamra合成，

将tamra(罗丹明)0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，加入s1中切割下的粗pna中，避光振摇反应3h；反应结束后加水淬灭，减压旋干，加入乙醚振荡洗涤，冰箱静置30min；高速离心，小心倒去上清，真空干燥过夜，得粗产物；用重蒸水溶解，冻干，得到白色粉末，即fam-pna-tamra。

优选的，s1中fmoc-肽核酸单体0.5mmol为碱基序列3’端开始的首个碱基的肽核酸单体；s2中pna单体顺序按3’→5’逐个延长。

优选的，s2步骤中通过茚三酮显色法测定缩合反应的游离氨基，判断反应进行是否完全。

优选的，取s2步骤中制得的数十粒碱基-树脂复合物放入试管中，加入dmf洗涤3次；分别加入两滴茚三酮溶液；120℃加热3min；观察树脂的颜色。

优选的，s2步骤中5g水合茚三酮溶于100ml乙醇中，稍加热或搅拌促溶。

优选的，s1步骤中的树脂为1mmol/g。

优选的，s1和s2步骤中分别共加入5ml的dmf。

优选的，s3步骤中切割试剂tfa:edt:苯甲醚＝38:1:1，时间为3.5h，温度为26℃，乙醚沉淀粗肽。

本发明的有益的效果：

本发明的pna与带有负电荷的dna和rna不同，pna的骨架为中性，与dna和rna之间不存在静电斥力，结合的稳定性大为提高；

pna的骨架与dna/rna不同，但与dna/rna的结合仍然严格遵守watson-crick原则，可用较短的序列(12～15mer)更快地形成杂交链,可识别单碱基错配，因此能够提高新型冠状病毒的检测速度、灵敏度和准确度；

pna几乎不与蛋白质作用，因而毒性作用很小；

pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响；

pna探针的高敏感性和特异性应用到微生物或病毒的检测方法中，其样品的前处理，与传统的检测技术非常相似，可以直接得到确切的结果，无需再进行其他检测；

pna的合成比dna合成难度低，且收率高；

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明pna骨架合成示意图；

图2是本发明碱基乙酰化示意图；

图3是本发明pna单体合成示意图；

图4是本发明pna寡聚体的合成示意图。

具体实施方式

如图1至图4所示，一种检测新型冠状病毒的pna探针结构，以肽核酸(即pna)为骨架模拟和取代常规dna或rna中磷酸戊糖酯骨架，即探针骨架为pna骨架；pna侧链上用以杂交识别的碱基序列的正确顺序，即为下列顺序：5'-fam-ccgtctgcggtatgtggaaaggttatgg-bhq1-3'或者5‘-fam-ttgctgctgcttgacagatt-tamra-3’。

一种检测新型冠状病毒的pna探针结构的合成方法，制备0.1mmolpna的方法包括如下步骤：

s1：将0.1g1mmol/g树脂与适量dmf加入柱反应器中，振摇溶胀30min后抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将fmoc-肽核酸单体0.5mmol(按pna探针结构内所强调碱基序列3’端开始的首个碱基的肽核酸单体)、dcc0.5mmol、hosu0.5mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，半小时后转移至固相反应器，加入适量dmf(共5ml)避光振摇反应3h，反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干。

s2：向s1制备的溶液中加入脱保护试剂20％(v/v)哌啶/dmf溶液，振摇30min脱下树脂上的fmoc保护基，抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将从碱基序列3’→5’第二个fmoc-pna单体0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，半小时后转移至装有肽核酸-树脂的固相反应器，加入适量dmf(共5ml)避光振摇反应3h；反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干；

通过茚三酮显色法测定缩合反应的游离氨基，判断反应进行是否完全，其原理是游离的α-氨基与茚三酮共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，然后，茚三酮与反应产物(氨)和还原茚三酮发生作用，生成一种紫色的物质(dyda)；取s2步骤中制得的数十粒碱基-树脂复合物放入试管中，加入dmf洗涤3次；分别加入两滴茚三酮溶液(5g水合茚三酮溶于100ml乙醇中，稍加热或搅拌促溶)；120℃加热3min；观察树脂的颜色；无色表明树脂上的游离氨已全部连接下一个fmoc-碱基，可以进行下一步操作；若树脂呈蓝紫色，则说明连接反应不完全，要延长反应时间，直到树脂呈无色，可进行下一步反应；

重复s2中的上述步骤，脱去n-末端的fmoc保护基，进入连接下一个肽核酸单体循环(pna单体顺序pna探针结构强调顺序3’→5’逐个延长)，不断两两缩合，直至合成预期得到的寡聚体；最后一次缩合完成后，得到的寡聚体-树脂以甲醇洗5次，每次振摇2min，抽干，抽真空干燥过夜，称重。

s3：称取s2步骤中制得的一定量寡聚体-树脂复合物放入反应器中，并按tfa:edt:苯甲醚＝38:1:1的比例配好切割试剂(时间为3.5h，温度为26℃)，均放入冰箱中冷却10min；向反应器中缓慢加入切割剂，室温下磁力搅拌3h；过滤，加入4ml裂解溶液重复切割0.5h；过滤，用10ml90％tfa/dcm洗涤树脂，洗涤液与滤液一并转入烧瓶，35℃减压蒸馏；浓缩液逐滴滴入十倍体积的预冷乙醚，振荡，冰箱静置30min；高速离心，倒去上清液，真空干燥过夜，通过乙醚沉淀得粗肽；用重蒸水溶解，冻干，得到白色粉末，称重。

5’端头荧光团的键合包括如下步骤：

s1：fam-pna合成，

加入脱保护试剂20％(v/v)哌啶/dmf溶液，振摇30min脱下树脂上的fmoc保护基，抽干，dmf洗6次，每次振摇3min，抽干；将fam(5-羧基荧光素)0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，转移至装有pna-树脂的固相反应器，加入适量dmf避光振摇反应3h；反应结束后抽干，用dmf、dcm、meoh分别洗3次，每次振摇3min，抽干；

s2：fam-pna-tamra合成，

将tamra(罗丹明)0.3mmol、dcc0.3mmol、hosu0.3mmol、dmap0.1mmol用适量dmf溶解，加入s1中切割下的粗pna中，避光振摇反应3h；反应结束后加水淬灭，减压旋干，加入乙醚振荡洗涤，冰箱静置30min；高速离心，小心倒去上清，真空干燥过夜，得粗产物；用重蒸水溶解，冻干，得到白色粉末，即fam-pna-tamra。

本发明的pna与带有负电荷的dna和rna不同，pna的骨架为中性，与dna和rna之间不存在静电斥力，结合的稳定性大为提高；pna的骨架与dna/rna不同，但与dna/rna的结合仍然严格遵守watson-crick原则，可用较短的序列(12～15mer)更快地形成杂交链,可识别单碱基错配，因此能够提高新型冠状病毒的检测速度、灵敏度和准确度；pna几乎不与蛋白质作用，因而毒性作用很小；pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响；pna探针的高敏感性和特异性应用到微生物或病毒的检测方法中，其样品的前处理，与传统的检测技术非常相似，可以直接得到确切的结果，无需再进行其他检测；pna的合成比dna合成难度低，且收率高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。