一种防治芋疫病的生防菌剂及其应用

1.本发明属于农作物病害防治技术领域，具体涉及一种防治芋疫病的生防菌剂及其应用。


背景技术：

2.芋原产于印度东部和马来西亚等热带地区，在我国栽培历史悠久，主要在华南、西南和长江流域种植。近年来，随着农业产业化的调整，芋的种植面积不断扩大。由芋疫霉（phytophthora colocasiae racib ）侵染引起的芋疫病是芋头栽培中最常见、最主要、造成损失最严重的病害之一，在各芋头产区均有发生和流行。该病主要危害叶片、叶柄，严重时亦危害球茎，一般情况下， 发病率为20%
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35%，暴发流行盛期常造成大量叶片腐烂和植株枯死，严重影响芋头产量和品质，发病严重时，造成产量损失高达30%
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40%，有的田块甚至绝收。
3.目前为止，芋疫病防治主要还是依靠培育抗病品种和化学农药的大量使用。其中培育抗病品种是防治疫病最成功的措施，但是疫病菌毒性组成具多变异性特点，导致利用主抗基因育成的抗病品种抗性丧失，而在短时间内筛选并培育出具有抗疫病的新品种是非常困难的。化学农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但化学农药的长期使用会带来许多负面影响。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，还出现生态环境被破坏、人畜和有益生物中毒、化学性物质在粮食和饲料中残留量大大超标，影响人畜生存质量等诸多问题，许多国家和地区已经相继禁止了一些高毒、高残留化学农药的生产和使用。在当今人们越来越关注自己的生存环境，及越来越提倡绿色生活的时代，探索有效的生防措施无疑具有重大的理论和现实意义。
4.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)广泛分布在自然界中，易于分离培养，并且具有广谱的抗菌活性，不污染环境，对人畜无毒，抗逆能力强，稳定性好。它能够产生多类高效的活性代谢产物，有效地抑制真菌和其他细菌的活性，同时促进植物生长并诱导生物体自身产生抗性，多方面控制植物病原菌的生长和对生物体的侵害作用。目前该菌已广泛应用于水果、蔬菜、花卉等各种农作物病害防治，但其用于防治芋疫病的研究则鲜有报道。本实验室分离获得了一株具有生防作用的解淀粉芽孢杆菌gz5，研究其生防菌剂对芋疫霉菌丝生长抑制作用，为芋疫病的生物防治和该生防菌的深入开发应用提供实践依据。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：针对目前芋疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种防治芋疫病的生防菌剂及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种防治芋疫病的生防菌剂，所述生防菌剂包含解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液，或解淀粉芽孢杆菌gz5无菌体发酵液。
7.上述解淀粉芽孢杆菌gz5为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)gz5，已于2019年11月21月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.18987。
8.上述解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液的制备方法为：（1）将解淀粉芽孢杆菌gz5菌株接种于lb液体培养基中，30℃，200 r/min，培养24 h，制成种子液；（2）取10 ml步骤（1）制得的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养，获得解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液。
9.上述步骤（2）中所述发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠，加蒸馏水定容至1000 ml，溶解并调ph为7.0
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7.2；发酵培养条件为：接种量3%(v/v)、装瓶量100ml /250ml，30℃，200 r/min，培养48 h，制成浓度为10
8 cfu/ml解淀粉芽孢杆菌gz5的发酵液。
10.上述解淀粉芽孢杆菌gz5无菌体发酵液的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液经4 ℃，8000 r/min离心20 min后，用0.22
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m细菌过滤器过滤，得解淀粉芽孢杆菌gz5无菌体发酵液。
11.上述一种防治芋疫病的生防菌剂的使用方式：在芋头幼苗期或成株期灌根100 ml生防菌剂，连续使用2~3次，每次间隔2天。
12.上述一种防治芋疫病的生防菌剂在芋疫病防治中的应用。
13.本发明有益效果：1、本发明筛选出的解淀粉芽孢杆菌gz5抑制作用强，能够明显抑制芋疫霉的生长。由于解淀粉芽孢杆菌gz5分离自番茄根围土壤，与土壤生态和谐相容，其发酵液制备的生防菌剂没有化学农药使用带来的一系列问题，减少农业污染，且能有效防治芋疫病，具有良好的开发应用前景。
14.2、本发明解淀粉芽孢杆菌菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，是一种理想的生防细菌。
附图说明
15.图1菌株gz5在lb培养基上的菌落形态。
16.图2菌株gz5对芋疫霉菌丝生长的抑制作用1。
17.图3菌株gz5对芋疫霉菌丝生长的抑制作用2。
18.图4菌株gz5无菌体发酵液对芋疫霉菌丝生长的抑制作用。
具体实施方式
19.为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
20.实施例一拮抗菌的分离鉴定本发明用于制备防治芋疫病的生防菌剂的菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)gz5，已于2019年11月21月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种
保藏号为cgmcc no.18987。
21.该菌株的分离鉴定方法与申请号为202010353837x，发明名称为一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯晚疫病中的应用中实施例1的方法相同。
22.实施例二菌株gz5对芋疫霉菌丝生长的抑制作用1．菌株gz5的活化培养：从
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80 ℃冰箱中取出已分离保存的解淀粉芽孢杆菌gz5，常温下待上层溶解后，用接种环蘸取gz5菌液在lb平板上划线，30 ℃恒温培养箱中培养24 h备用。
23.黑麦培养基制作：将黑麦60 g加适量去离子水浸泡36 h，匀浆机捣碎，55
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60℃水浴1
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2 h，四层纱布过滤，上清液用蒸馏水补至1000 ml，加琼脂粉13.5g，121℃高压灭菌30min。
24.菌株gz5对芋疫霉菌丝生长的抑制作用测定：采用平板对峙培养法，在黑麦培养基与lb培养基等比例混合培养皿正中央接种菌龄一致、直径7mm的芋疫霉菌丝块，在距离菌丝块相对两侧2.5 cm处接种gz5菌液，或用接种环蘸取gz5菌液划线，以未接gz5的芋疫霉为对照，重复3次，放置在28 ℃恒温培养箱中培养3天后，测量抑菌带大小，结果表明菌株gz5对芋疫霉菌丝生长具有很好的拮抗作用（图2、图3）。
25.实施例三菌株gz5无菌体发酵液的制备菌株gz5无菌体发酵液的制备，包括以下步骤：（1）将解淀粉芽孢杆菌gz5菌株接种于lb液体培养基(l0 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠，加蒸馏水定容至1000 ml，溶解并调ph为7.0
‑
7.2，高压灭菌备用) 中30℃，200 r/min，培养24 h，制成种子液；（2）取10 ml种子液接种于发酵培养基中，发酵培养，获得菌株gz5发酵液；（3）将菌株gz5发酵液经4 ℃，8000 r/min离心20 min后，用0.22
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m细菌过滤器过滤，得菌株gz5无菌体发酵液。
26.上述步骤（2）中发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、5 g氯化钠，加蒸馏水定容至1000 ml，溶解并调ph为7.0
‑
7.2；发酵条件为：接种量3%(v/v)、装瓶量100ml /250ml，发酵培养基ph值7.0
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7.2，30℃，200 r/min，培养48 h，制成浓度为10
8 cfu/ml菌株gz5的发酵液。
27.实施例四菌株gz5无菌体发酵液对芋疫霉菌丝生长的抑制作用将实施例三制备的菌株gz5无菌体发酵液稀释100倍，取2 ml加入到融化的20 ml冷却至45 ℃的黑麦培养基中混匀倒平板，制成菌株gz5无菌体发酵液的抑菌平板，在平板中央接种直径大小为7 mm芋疫霉菌丝块。将2 ml无菌水加入到融化的20 ml冷却至45 ℃左右的黑麦培养基中混匀倒平板，同样在平板中央接种直径大小为7 mm芋疫霉菌丝块为对照。每个处理重复3次，置于28 ℃培养箱中培养，3 天后以十字交叉法测量的菌丝生长直径。结果表明，gz5无菌体发酵液对芋疫霉菌丝生长具有明显抑制作用，抑菌率为60.1%(图4)。
28.实施例五菌株gz5发酵液盆栽防效试验选取3~4叶大小芋疫病感病芋头品种（六月红）苗，每株苗灌根100 ml 实施例三制备的菌株gz5发酵液（10
8 cfu /ml）。24 h后灌根接种芋疫霉游动孢子悬浮液（103个孢子/
ml），每株50 ml。接种2 天后再灌根一次100 ml 菌株gz5发酵液（10
8 cfu /ml）。以75％百菌清可湿性粉剂（山东绿丰农药有限公司）600倍液灌根处理作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理10株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80%以上时结束实验。
29.芋疫病的分级标准：0级：无病斑；l级：病斑面积占整张叶面积的5％以下；3级：病斑面积占整张叶面积的6％
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10％；5级：病斑面积占整张叶面积的11％
‑
25％；7级：病斑面积占整张叶面积的26％
‑
50％；9级：病斑面积占整张叶面积的50％以上。
30.病情指数=[∑病级叶片数
×
代表数值)／(最重病级数
×
总叶片数)]
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100防治效果=[(空白对照病情指数－处理病情指数)／空白对照病情指数]
×
100%实验结果见表1，该结果表明供试解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液能够显著降低芋疫病的病情指数，防治效果高达64.25%，仅略低于化学农药75％百菌清可湿性粉剂600倍液的防治效果70.42%。另外，表中结果还表明，发酵培养基处理的病情指数略低于清水处理的病情指数。温室盆栽实验结果说明，解淀粉芽孢杆菌gz5能够有效防治芋疫病，表现出良好的应用潜力。
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表1 解淀粉芽孢杆菌gz5发酵液对芋疫病的防治效果以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。