检测脊髓性肌萎缩运动神经元SMN2基因突变的检测试剂盒及其检测方法和应用与流程

检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明属于pcr扩增技术领域，具体地说，是关于一种检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测试剂盒及其检测方法和应用。


背景技术：

2.脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,sma)是以脊髓中
ɑ
动神经元变性退化、导致对称性肌无力和肌萎缩的一种罕见的常染色体隐性遗传的运动神经元疾病，主要表现为肌肉萎缩、肌张力减退。通常根据发病年龄和临床表现分为三种亚型，i 型患者在0～6个月开始发病，不能独自坐或走，通常在两年内因呼吸功能不全死亡； ii型患者在18个月之前发病，可以独坐但多不能走路，存活时间超过两年；iii型患者通常在2岁之后发病，可以独立行走但不能跑，且会逐渐失去行走能力。脊髓性肌萎缩症在人群中的携带率约为1/40-1/60左右，发病率约为1/6000-1/10000左右。
3.sma是由染色体5q11.2～5q13.3区域的smn基因缺失所引起的，该区域存在两个高度同源的两个基因，这两个基因以7号外显子和8号外显子上的两个基因位点不同可以区分为端粒拷贝(smn1)和着丝粒拷贝(smn2)，smn1是主要功能基因，其缺失或突变会造成sma表型，但与临床表现的严重性无相关性。smn2基因缺失不会造成sma表型，但其拷贝数的多少与sma表型的严重程度相关，smn2拷贝数越多，产生的smn蛋白也越多，病情越轻，每个smn2拷贝可以产生约10％的功能性smn蛋白。因此，smn2在健康个体中并不重要，但在sma患者中却至关重要，且smn2拷贝数与疾病的严重程度成反比。c.859g》c变异体是smn2中的阳性疾病修饰物，存在于慢性sma患者中，这是smn2基因外显子7的独特碱基变化，这种变化产生了一个新的外显子剪接增强子，并增加了全长转录物的数量，从而导致较不严重的表型，说明 smn2序列变异也能影响疾病的严重程度。
4.目前已知96％的sma患者都有smn1外显子7的纯合缺失或突变，而4％呈现复合杂合性，即一条染色体上有细微突变，另一条染色体上有缺失/基因转换。在该疾病的分子诊断中，目前只能通过对smn1突变检测来作为医生诊断该疾病的基因信息辅助临床诊断。
5.患者smn2基因的测定，结合临床病理表现，有助于医生了解基因型与病理表现的关系。目前，相关报道的检测方法主要有定量实时聚合酶链反应、变性高效液相色谱(dhplc)、多重连接依赖探针扩增(mlpa)等。限制性片段长度多态性(rflp)是通过对目标区域进行扩增后，使用限制性内切酶来区分，临床上可以诊断smn1纯和缺失的患者，但不能区分携带者与正常人，且该方法需要的费用高、操作繁琐、耗时长，性价比不高。
6.相对rflp来说，荧光定量pcr和mlpa可以通过对smn1基因第7和第8外显子进行拷贝数定量判断是否发生缺失或突变，来区分患者、携带者和正常人，且具有样本用量少，耗时短、成本可控等优点。但同时也存在一个问题，荧光定量pcr结果可能会出现假阳性，需要进一步通过mlpa验证，也不能检测出smn2序列的变异情况。
7.而全外显子测序这类ngs技术虽然可以定向检出sma，并覆盖其他相关表型的类似
肌病，但初筛疑似阳性的结果还需要进行mlpa或sanger测序的验证。另外，ngs 本质上还是pcr，在建库过程中，样本被扩大千万倍，因为样本中基因的量线性关系会有所偏差，因此在smn2拷贝数分析方面，ngs还有待更多的证据证明其准确性和可靠性。


技术实现要素：

8.本发明针对现有的smn2基因诊断技术的不足，提供了一种检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的方法。该方法针对smn2基因的检测有明显优势，弥补了 qpcr和mlpa的不足。该方法可检测出smn2序列变异，同时具有检测所需样本量较少、检测成本相对较低、检测结果针对性强、准确性高等优点。
9.因此，本发明的第一个目的是提供一种检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的方法。本发明的第二个目的是提供一种检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测试剂盒。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.作为本发明的第一个方面，一种检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测试剂盒，包括反应体系，所述反应体系包含：i5
tm 2x high-fidelity master mix、质粒样本、dna样本、水、以及一对特异性引物对，其中，
12.所述特异性引物对的核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示。
13.根据本发明，所述反应体系为25μl，包括i-5
tm 2x high-fidelity master mix 12.5μl，5x10-4
ng/μl质粒样本0.4-0.6μl，1ng/μl dna样本1.4-1.6μl，特异性引物各1μl，余量为水。
14.根据本发明，所述pcr检测试剂盒还包括扩增程序：94℃变性2min；进入循环， 98℃变性10s，56℃退火15s和72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保持温度不变。
15.根据本发明，所述质粒样本是将基因smn2克隆到puc57载体中构建获得。
16.进一步的，所述质粒样本的序列如seq id no:3所示。
17.作为本发明的第二个方面，一种上述所述的检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2 基因突变的检测试剂盒在用于检测smn2基因是否突变中的应用，该检测试剂盒用于检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因位点突变的情况，用于辅助研究是否有脊髓性肌萎缩症。
18.作为本发明的第三个方面，一种上述所述的检测试剂盒检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测方法，包括如下步骤：
19.步骤一，分别以待测样品的dna和质粒样本y0036561-1为模板，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；其中，质粒样本y0036561-1是将基因smn2克隆到puc57载体中构建获得的；
20.步骤二，观察扩增产物的电泳结果和一代测序结果，若电泳结果为单一条带且正向测序结果出现cg双份，则可以同时检测杂合样本的突变位点和非突变位点。
21.进一步的，步骤一的反应体系包含：i5
tm 2x high-fidelity master mix、质粒样本、dna样本、水、以及一对特异性引物对，其中，
22.所述特异性引物对的核苷酸序列分别如seq id no：1和seq id no：2所示。
23.根据本发明，所述质粒样本y0036561-1的序列如seq id no:3所示
24.进一步的，所述反应体系为25μl，包括i-5
tm 2x high-fidelity master mix 12.5μl，5x10-4
ng/μl质粒样本0.4-0.6μl，1ng/μl dna样本1.4-1.6μl，特异性引物各1μl，余量为
水。
25.根据本发明，步骤一的扩增程序：94℃变性2min；进入循环，98℃变性10s， 56℃退火15s和72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保持温度不变。
26.作为本发明的第四个方面，一种质粒样本y0036561-1，其序列如seq id no:3 所示。该质粒样本y0036561-1用作检测脊髓性肌萎缩运动神经元smn2基因突变的检测试剂盒的组成成分。
27.本发明的有益效果：扩增特异性强、操作简便、成本较低，具有较好的应用前景。
附图说明
28.图1为本发明的smn2基因突变的检测方法的流程示意图。
29.图2、图3、图4和图5为实施例1的dna样本反向测序结果图。
30.图6为质粒图谱。
31.图7为实施例2的不同浓度质粒的扩增特异性比较。其中，m泳道为dna marker； n泳道为阴性参照
32.图8为实施例3的不同扩增条件下产物电泳结果。其中，m泳道为dna marker； s6-1，s6-2，s6-3，s6-4泳道为四个dna样本pcr电泳结果；n泳道为阴性参照。
33.图9为实施例4添加质粒与不添加质粒条件下产物电泳结果。其中，m泳道为dnamarker；s7，s8，s9，s10泳道为四个dna样本pcr电泳结果；n泳道为阴性参照。
34.图10为实施例4的dna样本s10反向测序结果图。
35.图11为实施例5的不同扩增条件下产物电泳结果。其中，m泳道为dna marker； s10-s16泳道为7种不同比例质粒与dna样本混合pcr电泳结果，结果；n泳道为阴性参照。
36.图12、图13和图14为实施例5的s10-1至s10-5正向测序结果。
具体实施方式
37.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
38.实施例1特异性引物对的设计及特异性验证
39.(1)本部分内容的主要目的是验证设计的引物是否可以用于检测smn2基因点突变，dna样本均为正常人样本，扩增结果如果为非单一条带则显示引物的扩增特异性不是很好。
40.通过数据库ncbi获得目的基因序列(ng.008728.1)，设计了1对引物，引物信息如表1所示。
41.表1引物名称及序列信息
[0042][0043]
(2)然后利用上述引物分别对不同样本进行pcr扩增。反应体系和反应程序，分别如表2和表3所示。
[0044]
表2反应体系
[0045][0046]
备注：dna样本s1、dna样本s2、dna样本s3、dna样本s4、dna样本s5均为正常人血液样本。
[0047]
表3反应程序
[0048][0049]
(3)实验结果如表4和图2-图5所示。
[0050]
表4测序结果分析
[0051][0052][0053]
结果显示：用上述引物对进行pcr时，dna样本电泳结果均为单一条带且阴性参照无条带(见图2)，说明该引物对的特异性好，且能检测出正常人的非突变位点(见图3-图5)。
因此，用该引物进行后续试验。
[0054]
实施例2质粒浓度的优选
[0055]
本实施例的主要目的是由于该样本量少，新生儿筛查中难以获得样本，将基因 smn2克隆到puc57载体中构建类似病人样本的质粒(编号：y0036561-1)，插入位点大小为1098bp，并优选适合浓度的质粒，从而与dna样本混合后形成杂合样本检测smn2 基因位点突变，利用实施例1的引物分别对不同浓度质粒样本进行pcr扩增。反应条件如表5和表6所示。扩增结果如图7所示。其中，质粒y0036561-1是通过上海擎科生物有限公司将基因smn2克隆到puc57载体中构建获得，smn2基因序列来源数据库ncbi (ng.008728.1)，puc57载体由上海擎科生物有限公司提供，质粒图谱如图6所示。
[0056]
表5y0036561-1质粒信息
[0057]
基因名称smn2质粒编号y0036561-1克隆载体puc57插入大小1098克隆位点n-a
ꢀꢀ
[0058]
质粒y0036561-1的序列如下：
[0059]
cctccaaaagtgcaaggcaaggcattacaggcatgagccactgtgaccggcaatgtttttaaattttttaca tttaaattttattttttagagaccaggtctcactctattgctcaggctggagtgcaagggcacattcacagct cactgcagccttgacctccagggctcaagcagtcctctcacctcagtttcccgagtagctgggactacagtg ataatgccactgcacctggctaatttttatttttatttatttatttttttttgagacagagtcttgctctgtc acccaggctggagtgcagtggtgtaaatctcagctcactgcagcctccgcctcctgggttcaagtgattctcc tgcctcaacctcccaagtagctgggattagaggtccccaccaccatgcctggctaattttttgtactttcagt agaaacggggttttgccatgttggccaggctgttctcgaactcctgagctcaggtgatccaactgtctcggc ctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgtgcctagcctgagccaccacgccggcctaattttta aattttttgtagagacagggtctcattatgttgcccagggtggtgtcaagctccaggtctcaagtgatcccc ctacctccgcctcccaaagttgtgggattgtaggcatgagccactgcaagaaaaccttaactgcagcctaat aattgttttctttgggataacttttaaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttg aataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagcta tctatatctatatagctattttttttaacttcctttattttccttacagggttttagacaaaatcaaaaagaa cgaaggtgctcacattccttaaattaaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaa actttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttagaaagttgaaaggttaa tgtaaaaca，seq id no:3。
[0060]
puc57载体序列：
[0061]
tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgta agcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaac tatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaagga gaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctc ttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcc cagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggat cccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaa attgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatg agtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg cattaatgaatc
ggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactg actcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccac agaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggcc gcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggt ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttcc gaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgc tgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccg accgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagc agccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaac tacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttg gtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcg cagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactca cgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctat ctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggag ggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaa taaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaa ttgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggc atcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacat gatc，seq id no:4。
[0062]
表6反应体系
[0063][0064][0065]
表7反应程序
[0066][0067]
结果显示：用实施例1的引物对进行pcr时，不同浓度质粒y0036561-1的pcr 结果中5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl、5x10-4
ng/μl有明显条带，且其中5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl有杂带，5x10-4
ng/μl无杂带，为单一条带且阴性参照无条带；5x10-5
ng/μl、5x10-6
ng/μl、5x10-7
ng/μl、5x10-8
ng/μl、 5x10-9
ng/μl浓度质粒无条带。通过使用5x10-4
ng/μl质粒与样本混合进行pcr，特异性要好一些。
[0068]
实施例3无/低偏好性实验条件筛选
[0069]
本实施例的主要目的是通过优化不同的实验条件，利用实施例1的特异性引物及质粒，实现smn2基因是否发生位点突变。质粒y0036561-1的浓度5x10-4
ng/μl，dna 为smn1与smn2均正常的血液dna样本。预期的pcr结果均为单一条带。
[0070]
反应体系如表8所示。反应条件设计了四组，分别如表9-表12所示。
[0071]
表8反应体系
[0072][0073][0074]
备注：dna样本s6为smn1与smn2均正常的血液样本。
[0075]
1、条件
[0076]
(1)条件1的反应体系和反应条件如表9所示。
[0077]
表9反应程序
[0078][0079]
(2)条件2的反应体系和反应条件如表10所示。
[0080]
表10反应程序
[0081][0082]
(3)条件3的反应体系和反应条件如表11所示。
[0083]
表11反应程序
[0084][0085][0086]
(4)条件4的反应体系和反应条件如表12所示。
[0087]
表12反应程序
[0088][0089]
2、实验结果。
[0090]
不同扩增条件下的电泳结果如图8所示。
[0091]
结果显示，大部分条件都没有完全符合预期；仅有条件1符合，dna样本(条件 1:s6-1和s6-3)为单一条带且明亮无拖带。
[0092]
实施例4实例验证
[0093]
本实施例的主要目的是使用smn2缺失、smn1正常的血液dna样本s7、s8及smn1与 smn2均正常的血液dna样本s9、s10验证上述实验条件，质粒浓度为5x10-4
ng/μl，预期的pcr结果为均为单一条带。反应体系和反应条件分别如表13-表15所示，结果如图9 和图10所示。
[0094]
1、实验条件
[0095]
表13添加质粒反应体系
[0096][0097][0098]
表14不添加质粒反应体系
[0099][0100]
表15反应程序
[0101][0102]
备注：dna样本s7、dna样本s8为smn2缺失、smn1正常的血液dna样本，dna样本s9、 dna样本s10为smn1与smn2均正常的血液dna样本。其中，反应体系1采用dna样本s7，反应体系2采用dna样本s8，反应体系3采用dna样本s9，反应体系4采用dna样本s10。
[0103]
2、实验结果
[0104]
不同样本的电泳结果如图9所示，添加质粒的样本s7-s10与不添加质粒的样本 s7-s10均出现单一条带。
[0105]
3、扩增结果一代测序验证
[0106]
为了进一步确证添加质粒与不添加质粒扩增得到的产物是否发生smn2的位点突变，对其进行一代测序，结果如图10所示，正向测序结果中发现dna样本s10的一代测序结果中smn2突变位点本应出现明显双峰，但该位点由c变为g，说明在该实验中质粒浓度过高。
[0107]
实施例5
[0108]
本实施例的主要目的是通过优化质粒与血液dna样本适合的混合比例形成杂合样本，利用上述引物及质粒，实现smn2是否发生突变。质粒浓度5x10-4
ng/μl，dna为smn1 与smn2均正常的血液dna样本s10。预期的pcr结果为均为单一条带。反应体系和反应条件分别如表16和表17所示，结果如图11所示。
[0109]
表16反应体系
[0110][0111]
表17反应程序
[0112][0113][0114]
备注：dna样本s10为smn1与smn2均正常的血液dna样本。
[0115]
实施例6对扩增结果进行一代测序验证
[0116]
为了进一步确证不同比例混合后扩增得到的smn2序列，对其进行一代测序，结果如图12、图13及图14所示，正向测序结果中反应体系1至反应体系5的样本s10序列中均出现cg双峰，且反应体系3、反应体系4和反应体系5双峰比反应体系1和反应体系2 双峰明显，而反应体系6、反应体系7显示无变化，通过分析显示，反应体系中，5x10-4 ng/μl质粒含量为0.4-0.6μl、1ng/μl的血液dna样本为1.4-1.6μl较合适，该实验条件下可以同时检测杂合样本的突变位点和非突变位点。
[0117]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。