本发明涉及海参加工
技术领域：
，具体涉及一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法。
背景技术：
：海参属于棘皮动物门海参纲，它具有很高的经济价值。全世界海参有几千种，但其中只有40多种能食用，我国约有20种。海参，也称之“海人参”，因补益作用类似人参而得名，与鲍鱼同列为海产“八珍”。在《本草纲目拾遗》有相关记载：海参，味甘咸，其性温补，益精髓，补肾，壮阳疗痿，摄小便，足敌人参。科学研究表明，海参含高蛋白、低胆固醇、低糖、低脂肪，且富含多种微量元素，是营养价值极高的优质食品。近年来，海参作为补益药膳的功能性食品越来越受人们的关注，用于延缓性腺衰老、提高记忆力、抗肿瘤、防止糖尿病以及动脉硬化等。目前市面上主要对海参进行粗加工和精深加工，提高海参的营养价值，而作为副产品的海参内脏，往往被丢弃，造成了资源浪费、污染环境等问题，因此一些研究者进一步探究了海参内脏深加工的方式，通过提取出海参内脏中的营养成分，用以制备天然产物，或是以此为基础开发功能性食品，进一步提高海参的营养和经济价值。研究表明，海参内脏中含有丰富的多肽，并具有较好的生物活性，可以充分发挥海参的功效性。在现有技术中，通常采用水提法或者酶解法来制备海参多肽，但所制得的海参多肽产率低，纯度低，含有较多的杂质，不能充分提取出海参多肽，造成资源浪费，未能实现海参高附加值的综合利用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，该方法有利于海参内脏粉末中内容物的释放，并通过二次酶解技术，克服产物抑制效应，使得海参内脏中的肽键充分断裂，最后通过除杂及冷冻干燥后可充分提高海参多肽的产率和纯度，实现海参高附加值的综合利用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将海参内脏依次经过烘干、粉碎、浸泡、水浴处理后得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加2.5％-3.5％的蛋白酶，调节温度和ph值后，酶解3-5h，酶解完成后，经过沸水浴灭酶和冷冻离心后，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1；s3、取海参内脏酶解沉淀b1，添加水后重悬成海参内脏重悬液，再向海参内脏重悬液中加入0.5％-1.5％的蛋白酶，调节温度和ph值后，酶解2-4h，酶解完成后，经过沸水浴灭酶后将溶液的ph调至中性，冷冻离心后，得到海参内脏酶解上清液a2和海参内脏酶解沉淀b2；s4、将海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解上清液a2混合后，经冷冻干燥得到海参多肽粉；s5、取海参多肽粉，复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，得到海参多肽纯化液；s6、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。优选地，步骤s1的具体过程为：将海参内脏放置于40-70℃的环境中，烘干1-3h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:(25-35)将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行40-90℃恒温水浴处理3-5h，得到海参内脏匀浆。优选地，步骤s2和步骤s3中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或酸性蛋白酶中的一种或多种。优选地，步骤s2和步骤s3中，先调节至温度为40-90℃，ph值为2-9后，再进行酶解处理。优选地，步骤s3中所述海参内脏重悬液是按照料液比1:(10-20)将海参内脏酶解沉淀b1加入到水中进行重悬制备而得。优选地，步骤s2和步骤s3中酶解前均采用碳酸钠溶液进行ph值调节。优选地，步骤s2和步骤s3中沸水浴灭酶的具体步骤为：将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活5-15min。优选地，步骤s2和步骤s3中所述冷冻离心的条件为：在4℃、10000r/min条件下离心15min。采用上述技术方案后，本发明与
背景技术：
相比，具有如下有益效果：1、本发明一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，将海参内脏烘干后粉碎成海参内脏粉末，海参内脏粉末浸泡溶胀后经水浴处理，可让原料充分分解，有利于海参内脏粉末中内容物的释放，再利用二次酶解技术，克服产物抑制效应，使得海参内脏中的肽键充分断裂，促进海参内脏中的蛋白质转化成多肽，提高了海参内脏中多肽的提取率，最后通过除杂及冷冻干燥后制得海参多肽。2、本发明一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，将海参多肽按比例复溶后，利用柱层析技术，起到了除杂和定向收集海参多肽的效果，提高了海参多肽的纯度，同时避免了外来物对产品品质的影响。3、本发明一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，海参内脏依次经过烘干、粉碎、浸泡和水浴处理，可减少海参内容物的流失，充分利用了海参内脏原料，节约了成本，在保证提取率的同时，提高了纯度，实现了海参内脏高附加值的综合利用。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将50g海参内脏放置于50℃的环境中，烘干2h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:30将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行50℃恒温水浴处理4h，得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加3％的中性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解4h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1；s3、取海参内脏酶解沉淀b1，按照料液比1:15将海参内脏酶解沉淀b1加入到水中进行重悬制备得到海参内脏重悬液，再向海参内脏重悬液中加入1％的碱性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解3h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后将溶液的ph调至中性，在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min后，得到海参内脏酶解上清液a2和海参内脏酶解沉淀b2；s4、将海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解上清液a2混合后，经冷冻干燥得到海参多肽粉；s5、取海参多肽粉，按比例复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，上样量为柱体积的1/20，分别收集洗脱峰，得到海参多肽纯化液；s6、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。实施例2一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将50g海参内脏放置于50℃的环境中，烘干2h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:30将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行50℃恒温水浴处理4h，得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加3％的中性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解3h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1；s3、取海参内脏酶解沉淀b1，按照料液比1:15将海参内脏酶解沉淀b1加入到水中进行重悬制备得到海参内脏重悬液，再向海参内脏重悬液中加入1％的碱性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解3h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后将溶液的ph调至中性，在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min后，得到海参内脏酶解上清液a2和海参内脏酶解沉淀b2；s4、将海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解上清液a2混合后，经冷冻干燥得到海参多肽粉；s5、取海参多肽粉，按比例复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，上样量为柱体积的1/20，分别收集洗脱峰，得到海参多肽纯化液；s6、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。实施例3一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将50g海参内脏放置于50℃的环境中，烘干2h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:30将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行50℃恒温水浴处理4h，得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加3％的中性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解4h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1；s3、取海参内脏酶解沉淀b1，按照料液比1:15将海参内脏酶解沉淀b1加入到水中进行重悬制备得到海参内脏重悬液，再向海参内脏重悬液中加入1％的碱性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解4h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后将溶液的ph调至中性，在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min后，得到海参内脏酶解上清液a2和海参内脏酶解沉淀b2；s4、将海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解上清液a2混合后，经冷冻干燥得到海参多肽粉；s5、取海参多肽粉，按比例复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，上样量为柱体积的1/20，分别收集洗脱峰，得到海参多肽纯化液；s6、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。实施例4一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将50g海参内脏放置于50℃的环境中，烘干2h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:30将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行50℃恒温水浴处理4h，得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加3％的中性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解3h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1；s3、取海参内脏酶解沉淀b1，按照料液比1:15将海参内脏酶解沉淀b1加入到水中进行重悬制备得到海参内脏重悬液，再向海参内脏重悬液中加入1％的碱性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解4h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后将溶液的ph调至中性，在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min后，得到海参内脏酶解上清液a2和海参内脏酶解沉淀b2；s4、将海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解上清液a2混合后，经冷冻干燥得到海参多肽粉；s5、取海参多肽粉，按比例复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，上样量为柱体积的1/20，分别收集洗脱峰，得到海参多肽纯化液；s6、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。对比实施例一种从海参内脏中提取出海参多肽的方法，包括以下步骤：s1、将50g海参内脏放置于50℃的环境中，烘干2h，再将海参内脏放入高速粉碎机中粉碎成海参内脏粉末，按照料液比1:30将海参内脏粉末加入水中浸泡，待海参内脏粉末充分溶胀后，进行50℃恒温水浴处理4h，得到海参内脏匀浆；s2、往海参内脏匀浆中添加3％的中性蛋白酶，调节温度至50℃，并采用碳酸钠溶液将ph值调节至7.5，酶解5h，酶解完成后，将酶解后的溶液置于沸水浴中灭活10min，灭活后在4℃、10000r/min条件下冷冻离心15min，得到海参内脏酶解上清液a1和海参内脏酶解沉淀b1，将海参内脏酶解上清液a1进行冷冻干燥得到海参多肽粉；s3、取海参多肽粉，按比例复溶之后，采用柱层析技术，过sephadexg-100，进行除杂和定向收集海参多肽的组分，上样量为柱体积的1/20，分别收集洗脱峰，得到海参多肽纯化液；s4、海参多肽纯化液经冷冻干燥后，得到海参多肽。各成分的检测方法如下：海参多肽的提取率：采用甲醛滴定法测定酶解液中的水解度，水解度越高说明多肽含量的提取率越高。甲醛滴定法：在小烧杯中量取蛋白酶解液5.0ml并加入60ml蒸馏水混合均匀，采用0.2mol/l标准naoh溶液调节酶解稀释液至ph8.2，再加入ph8.2的甲醛溶液20ml，最后用0.1mol/l标准naoh溶液滴定，记录ph滴至9.2时所消耗的标准naoh溶液的体积。计算公式：游离氨基氮式中：δv：滴定样品与滴定蛋白原液所消耗的标准naoh溶液体积之差；c：naoh标准溶液浓度(mol/l)；w：原料克数(g)；vtot：酶解液的总体积(ml)；v：滴定取用的酶解液体积(ml)；no：水解前每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g)；n：水解后每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g)；htot：原料蛋白质中所含肽键总数(mmol/g)；pro％：样品的蛋白质含量；110：氨基酸平均分子量。海参内脏粉降解率：海参内脏粉降解率计算公式如下：海参多肽的纯度：海参多肽的纯度计算公式如下：实施例1-4和对比实施例所提取的海参多肽检测结果如表1所示。表1为海参多肽检测结果：名称实施例1实施例2实施例3实施例4对比实施例海参多肽水解度62％67％55％57％35％海参多肽降解率82％78％70％77％65％海参多肽纯度88％92％90％83％73％综上，本发明通过采用高速破碎和水浴处理，提高了海参内脏的水解度和降解率，多肽含量有了明显的提高；此外，酶解生成的海参多肽会抑制蛋白酶的水解，即海参多肽的产量达到了平稳期，即使再延长酶解时间，海参多肽的量也不会再增加。因此，本发明对第一次酶解的沉淀物进行了第二次酶解，由于该沉淀物含有少量海参多肽，因而在第二次酶解中，解除了产物抑制的作用，使得沉淀物中含有的海参内脏底物被进一步得以分解利用。本发明利用二次酶解法，克服产物抑制效应，在缩短现有反应时间的同时，提高了海参多肽的提取率，且利用柱层析技术，除去海参多肽中的杂质，有效地提高了海参多肽的纯度。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。当前第1页12