本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素粉剂及其制备方法。
背景技术：
细菌纤维素(bacterialcellulose，bc)是除植物纤维素、动物纤维素之外的另一类纤维素，为细菌合成的天然惰性材料。细菌纤维素具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性，是医药、建筑、通讯等行业的原材料，也是世界上公认的性能优异的新型生物材料。目前，对bc的应用主要集中在高附加值的生物医用材料上，如组织工程支架、人造血管、人造皮肤、敷料等方面。能够产生以细菌纤维素的细菌主要有acetobacter、rhizobium、agrobacterium和sarcina等，其中产量最高的为木醋杆菌(acetobacterxylinus)，属革兰氏阴性，严格好氧。公开号为cn102337311a的中国专利，公开了以木醋杆菌为生产菌株，利用土豆废渣做为培养基培养细菌纤维素的方法，该方法主要是采用静态培养，培养后形成细菌纤维素膜片。但是利用该方法制得的细菌纤维素，不能形成颗粒状或粉末状，无法与其他组分进行组合，加工成性能更高的含细菌纤维素的复合材料。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌纤维素粉剂及其制备方法。
为实现上述目的，本案发明人经过长期研究和大量实践，得以提供本发明技术方案。具体实施过程如下：
一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、向甘油中加入氮源，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二盐，硫酸亚铁，醪糟和水，混合制成细菌纤维素生产菌株的生产培养基，并调节培养基的ph值为5.8～6.2，然后在115～125℃条件下灭菌，冷却备用；
所述甘油，氮源，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二盐，硫酸亚铁，醪糟和水的配方比例按g:g:g:g:g:g:g:l计为15:10～23:2～4:0.2～0.4:4～6:0.2～0.4:20～60:1；
s2、待灭菌后的上述培养基冷却至25～35℃时，接种细菌纤维素生产菌株，接种比例为6～7％；将接种好生产菌株的培养液置于恒温摇床中，在28～32℃条件下动态培养6～8天；摇床培养的摇动速率为80～180rpm，通气量为0.3～0.6v/v·min；
s3、培养结束后，从培养液中取出球团状的细菌纤维素，放入柠檬酸沸水溶液中煎煮，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于过氧化氢溶液中进行脱色处理，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，用剪切机将球团状细菌纤维素剪切成小颗粒状，烘干至至含水量为50～70％，然后迅速低温冷冻，行冷冻超微粉碎，干燥即可。
优选的，所述s1中，灭菌的温度为121℃，时间为20min。
优选的，所述s1中，氮源为硫酸铵、酵母浸粉和蛋白胨中的一种或多种。
优选的，所述s1中，磷酸氢二盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。
优选的，所述甘油，酵母浸粉，蛋白胨，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二钠，硫酸亚铁，醪糟和水按g:g:g:g:g:g:g:g:l计为15:13:10:3:0.3:5:0.3:60:1。
优选的，所述s1中，调节培养基的ph值为6.0。
优选的，所述s3中，柠檬酸沸水溶液中柠檬酸的质量分数为0.5％，用于脱色处理的过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为3％，ph值为10。经过醪糟-无机盐培养基培养完毕的细菌纤维素，因含有醪糟成分及金属离子，产出的细菌纤维素颜色较深，故需要进行洗脱金属离子和脱色处理。
优选的，所述s2中，细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌，接种比例为6.5％，动态培养时间为7天，摇床摇动速率为150rpm，通气量为0.45v/v·min。
优选的，所述木醋杆菌菌液的制备方法为：从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种保藏管，火焰干法消毒下，敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，摇匀后接种至木醋杆菌种子培养液中，扩增为高生物量的木醋杆菌菌液，然后将接种了木醋杆菌菌液的培养基，置于30℃恒温摇床中连续动态培养48h，即可生产出大量团球状的细菌纤维素。
2、上述制备方法制得的细菌纤维素粉剂。
3、上述制备方法制得的细菌纤维素粉剂在制备人体血管支架中的应用。
将本发明经上述制备方法制得的团球状细菌纤维素迅速冷冻，再经过超微冷冻设备行超微冷冻粉碎，将细菌纤维素中的纤维完全破碎成湿粉末状，并且粒度均匀，经真空干燥后，可直接用于加工终端产品，如用3d生物打印机可打印出人工血管支架等。
本发明的有益效果在于：
本发明公开的细菌纤维素粉剂的制备方法，具有操作简单，反应条件温和，安全环保等优点，且制成的细菌纤维素球团颗粒产量高，从而降低了生产成本，再通过超微粉碎设备进行湿法超微粉碎，制成的细菌纤维素粉末经干燥后，能够直接加工成终端产品，如通过3d生物打印加工为人工血管支架，扩大了细菌纤维素的应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台，用紫外灯照射30min消毒，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，用镊子敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，30g醪糟和0.5l去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，将上述组分充分混合，制成细菌纤维素生产性培养基，并调节该培养基的ph值为6.0，分装至500ml的三角烧瓶中，每瓶200ml，分装2瓶，剩余的备用，然后在121℃条件下灭菌20min，待冷却至30℃左右时，按6％的比例接种前述木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液置于恒温摇床中，30℃条件下行好氧振荡培养7天；设摇床培养转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；
s3、培养结束后，从培养液中取出木醋杆菌生产的团球状细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡、冲洗至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于ph为10的3％过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用清水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心分离水分至含水量为60％左右，在-20℃下迅速冷冻，取出冻结的物料后，先用胶体磨初粉碎，再用冷冻超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的细菌纤维素超微颗粒，真空干燥，即得细菌纤维素粉末。
本实施例1中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素湿重为86.4g，二级粉碎、真空干燥后的细菌纤维素粉末中干重为2.04g。
实施例2
一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台，用紫外灯照射30min消毒，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，用镊子敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，50g醪糟和0.5l去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，将上述组分充分混合，制成细菌纤维素生产性培养基，并调节该培养基的ph值为6.0，分装至500ml的三角烧瓶中，每瓶200ml，分装2瓶，剩余的备用，然后在121℃条件下灭菌20min，待冷却至30℃左右时，按6％的比例接种前述木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液置于恒温摇床中，30℃条件下行好氧振荡培养7天；设摇床培养转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；
s3、培养结束后，从培养液中取出木醋杆菌生产的团球状细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡、冲洗至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于ph为10的3％过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用清水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心分离水分至含水量为60％左右，在-20℃下迅速冷冻，取出冻结的物料，先用胶体磨初粉碎，再用冷冻超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的细菌纤维素超微颗粒，真空干燥，即得细菌纤维素粉末。
本实施例2中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素湿重为32.04g，二级粉碎、真空干燥后得细菌纤维素粉末干重为1.03g。
实施例3
一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，10g醪糟和0.5l去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的ph值为6.0，分装至500ml的三角烧瓶中，每瓶200ml，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧摇床培养7天；摇床培养的转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；
s3、培养结束后，从培养液中取出细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素浸泡于ph为10的3％的过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心，浓缩至含水量为60％左右，然后在-80～-20℃下冷冻，再用超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的颗粒，真空干燥，即得粉末细菌纤维素。
本实施例3中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素的湿重为60.73g，粉碎烘干后的粉末细菌纤维素中干重为1.56g。
实施例4
一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，7.5g醪糟和0.5l去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的ph值为6.0，分装至500ml的三角烧瓶中，每瓶200ml，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧摇床培养7天；摇床培养的转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；
s3、培养结束后，从培养液中取出细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素浸泡于ph为10的3％的过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心，浓缩至含水量为60％左右，然后在-80～-20℃下冷冻，再用超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的颗粒，真空干燥，即得粉末细菌纤维素。
本实施例4中，制得的细菌纤维素经过氢氧化钠溶液静置处理2天后，两瓶培养得到的细菌纤维素的湿重为28g，粉碎烘干后的粉末细菌纤维素中干重为0.68g。
从实施例1至实施例4中得到的结果，综合分析可知，酵母浸粉和醪糟的加入可明显提高细菌纤维素的产量，且随着加入量的增加而增加。
本发明公开的细菌纤维素粉剂的制备方法，具有操作简单，反应条件温和，安全环保等优点，能够形成细菌纤维素颗粒，且产量高，从而降低了生产成本，通过超微粉碎设备进行粉碎，制成的粉末细菌纤维素能够直接加工成产品，如通过3d打印加工为人工骨架，扩大了细菌纤维素的应用价值。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。