一种利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产阿拉伯半乳低聚糖的方法

本发明属生物化工中的微生物酶解制糖
技术领域：
，具体涉及阿拉伯半乳聚糖原料经微生物分泌的酶生物降解后，制备功能性阿拉伯半乳低聚糖的技术。
背景技术：
：阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan，ag)是一类具有高度分支结构的阿拉伯糖与半乳糖组成的中性多糖，其大量地存在于针叶材中，尤其是落叶松。其主链为由β-1，3键连接而成的半乳聚糖，阿拉伯糖侧链通过β-1，3键或β-1，6键与半乳糖连接。近年来落叶松木材作为森林资源的一部分，其加工后剩余的木料木屑却未得到合理利用，这不仅会对环境产生污染，还会造成林业资源的浪费。落叶松木材废弃物中含有丰富的阿拉伯半乳聚糖，通过技术手段提取其中的阿拉伯半乳聚糖则可以实现林业资源的合理高值化利用。此外，在植物果皮废弃物中还存在一种酸性阿拉伯半乳聚糖衍生物——阿拉伯聚半乳糖醛酸，其主链为由α-1，4键连接而成的聚半乳糖醛酸，阿拉伯糖基通常以α-1，5键与主链相连。在果汁加工工业中产生大量果皮渣，国内目前由于欠缺先进的技术或设施，果皮渣常作为废弃物进行填埋处理。往往产生大量酸性液体，破坏土壤结构、污染水体和空气，亟待一种经济环保的果皮渣资源化处理方式。由于落叶松木材废弃物以及植物果皮废弃物中含有丰富的阿拉伯半乳聚糖，通过技术手段提取其中的阿拉伯半乳聚糖则可以实现林业资源的合理高值化利用。阿拉伯半乳聚糖早期在食品行业中常被用作甜味剂、增稠剂、乳化剂等食品添加剂，其还具有提高机体免疫力，降低血液中胆固醇、葡萄糖和胰岛素水平，增加肠道益生菌、调节肠道等诸多生物活性，是一种功能性多糖，但由于阿拉伯半乳聚糖的链分子量较大、活性低，需通过降解分子链以提高其活性，才能进入生物体内发挥生物活性。降解阿拉伯半乳聚糖的方法主要包括化学法、物理法以及酶法。化学法不可避免的会用到酸或碱，存在反应条件剧烈，水解程度难以控制，低聚糖得率低，水解产物中单糖及单糖分解产物比例高，产品分离精制工艺复杂、成本高等缺点。物理法虽然能耗低，无污染，但其降解效率不高，难以达到预期效果。而酶法降解具有反应条件温和、副产物少、降解产物中低聚糖含量高的优点。但目前大多数能合成半乳聚糖酶的微生物，其分泌的半乳聚糖酶酶系中都含有一定数量的外切半乳聚糖酶，而在外切半乳聚糖酶存在的情况下，阿拉伯半乳聚糖很容易被没酶解成单糖，导致阿拉伯半乳低聚糖的得率极低。因此，在微生物酶法制备阿拉伯半乳低聚糖的工艺中，我们需要通过一些手段尽可能地降低天然半乳聚糖酶系中外切半乳聚糖酶的活力。在已有的文献报道中，有采用物理、化学诱变或基因工程的方法改造微生物，以期获得新的突变株或工程菌，它们可以分泌低外切半乳聚糖酶含量的半乳聚糖酶酶系，但这类方法存在盲目性、随机性，周期长及过程繁琐等不足。技术实现要素：针对一般的微生物分泌的半乳聚糖酶在降解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产阿拉伯半乳低聚糖的方法，以期提高阿拉伯半乳聚糖降解成低聚糖的得率和产物中低聚糖的含量。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产阿拉伯半乳低聚糖的方法：先采用超滤技术对微生物生产的天然半乳聚糖酶液进行组分拆分，获得截留分子量为10-100kda的内切半乳聚糖酶；以阿拉伯半乳聚糖为底物，采用获得的内切半乳聚糖酶进行酶解，制备获得阿拉伯半乳低聚糖。所述的微生物生产的天然半乳聚糖酶液是由黑曲霉(aspergillusnigernl02)分泌的半乳聚糖酶。所述的利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产阿拉伯半乳低聚糖的方法，包括如下步骤：(1)用黑曲霉nl02制备获取天然半乳聚糖酶；(2)半乳聚糖酶液的定向拆分；(3)将阿拉伯半乳聚糖与步骤(1)得到的内切半乳聚糖酶混合，加入ph缓冲液混合至底物浓度为10-30g/l，控制ph值为4.0-6.0，反应体系中内切半乳聚糖酶用量为37.5-600u/g阿拉伯半乳聚糖，于40-50℃下水解24-48h，水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心得到的上清即为含阿拉伯半乳低聚糖的溶液。步骤(1)中，天然半乳聚糖酶的制备过程包括：1)黑曲霉nl02的活化培养：50ml活化培养基置于250ml带棉塞的三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的黑曲霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中于30±3℃、170rpm条件下培养36h后用于产酶；2)黑曲霉天然半乳聚糖酶的制备：50ml产酶培养基于在250ml带棉花塞的三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却至室温，按10％接种量接入种子；于30±3℃、170rpm的摇床中培养72h；3)产酶结束后，用离心机在3000rpm条件下离心10min将培养液中的固体物质分离除去，即半乳聚糖酶液。步骤(2)中，半乳聚糖酶液的定向拆分：选用截留分子量为10-100kda的超滤膜，对天然半乳聚糖酶进行超滤，收集透过超滤膜的酶组分，即透过液酶组分。所述的利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产阿拉伯半乳低聚糖的方法，其特征在于，内切半乳聚糖酶活力不低于40iu/ml，外切半乳聚糖酶活力不高于20iu/ml。有益效果：本发明根据内切半乳聚糖酶与外切半乳聚糖酶蛋白分子量的差异，采用超滤技术定向拆分天然半乳聚糖酶系中的外切半乳聚糖酶以后，由于水解体系中的外切半乳聚糖酶活力大幅度降低，提高制备阿拉伯半乳低聚糖的选择性，因而进一步提高阿拉伯半乳聚糖降解成低聚糖的得率和产物中低聚糖的含量，降低了产物中单糖的含量，为微生物产天然半乳聚糖酶制备阿拉伯半乳低聚糖工艺提供了一个高效、低成本的新途径。附图说明图1是酶用量对低聚糖得率的影响结果图；图2是底物用量对低聚糖得率的影响结果图；图3是阿拉伯半乳聚糖酶水解历程结果图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中，阿拉伯半乳低聚糖水解得率计算方法为：阿拉伯半乳低聚糖水解得率(％)＝(c1/c)×100单糖水解得率计算方法为：单糖水解得率(％)＝(c2/c)×100酶对阿拉伯半乳低聚糖选择性计算方法为：酶的选择性(％)＝[y1/(y1+y2)]×100其中：c--初始阿拉伯半乳聚糖含量，g/lc1--酶解后酶解液中阿拉伯半乳低聚糖含量，g/lc2--酶解后酶解液中单糖含量，g/ly1--阿拉伯半乳低聚糖水解得率，％y2-酶解液中单糖水解得率，％。实施例1：用黑曲霉(aspergillusnigernl02)制备获取天然半乳聚糖酶。(1)黑曲霉(aspergillusnigernl02)活化培养基成分(g/l)：葡萄糖10.0；蛋白胨1.0；硫酸铵1.4；尿素0.3；磷酸二氢钾2.0；二水氯化钙0.4；七水硫酸镁0.3；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014；氯化钴0.0037；吐温802滴/50ml。(2)黑曲霉(aspergillusnigernl02)产酶培养基成分(g/l)：阿拉伯半乳聚糖20.0；硫酸铵5.0；胰蛋白胨3.0；磷酸二氢钾2.0；磷酸氢二钾3.0；氯化钾0.1；七水硫酸镁0.24；七水硫酸亚铁0.005；一水硫酸锰0.0016；七水硫酸锌0.0014。(3)黑曲霉的活化培养：50ml活化培养基置于250ml带棉塞的三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却至室温，接入适量保藏于试管斜面的黑曲霉孢子，摇瓶置于恒温摇床中于30±3℃、170rpm条件下培养36h后用于产酶。(4)黑曲霉天然半乳聚糖酶的制备：50ml产酶培养基于在250ml带棉花塞的三角瓶中，121℃灭菌30min，冷却至室温，按10％(v/v)接种量接入种子。于30±3℃、170rpm的摇床中培养72h。(5)产酶结束后，用离心机在3000rpm条件下离心10min将培养液中的固体物质分离除去，即半乳聚糖酶液。透析-dns结合法测定半乳聚糖酶液中内外切半乳聚糖酶活力：称取阿拉伯半乳聚糖0.3g于100ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)48ml，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后加入半乳聚糖酶液2ml，于50℃、150rpm的摇床中水解24h，水解结束后于100℃下灭酶活10min，并在5000rpm下离心10min得到的上清液即为酶水解液。酶水解液先用透析袋(mwco＝200da)进行透析，再利用dns法分别测定酶促反应后透析袋内、外的还原糖含量。透析袋外的单(寡)糖可被认为是由外切半乳聚糖酶水解形成的产物，而透析袋内还原糖含量的增加则被认为是由内切半乳聚糖酶水解引起的。于15ml具塞刻度管中加入上述酶解液500μl和500μldns试剂，迅速混合并沸水浴7min，冷却至室温后，加水定容至5ml，充分摇匀后于540nm波长下测定吸光度a值，反应生成的还原糖根据标准曲线求得。以500μl蒸馏水代替酶解液作空白对照。每个样品做2～3个平行样，取平均值。一个酶活力的单位(iu/ml)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol还原糖所需要的酶用量。结果表明，黑曲霉制备获取的天然半乳聚糖酶中，内切半乳聚糖酶活力为33.24iu/ml，外切半乳聚糖酶活力为51.97iu/ml。实施例2：超滤技术定向拆分黑曲霉产天然半乳聚糖酶系中内切半乳聚糖酶和外切半乳聚糖酶(1)半乳聚糖酶液的定向拆分：选用截留分子量为10-100kda的超滤膜，对天然半乳聚糖酶进行超滤，收集透过超滤膜的酶组分，即透过液酶组分。(2)测定透过液酶组分中内外切半乳聚糖酶活力：称取阿拉伯半乳聚糖0.3g于100ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)48ml，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后加入透过液酶组分2ml，于50℃、150rpm的摇床中水解24h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，并在5000rpm下离心10min得到的上清液即为酶水解液。通过实施例1所述的透析-dns结合法，测定出透过液酶组分中，内切半乳聚糖酶活力为45.98iu/ml，外切半乳聚糖酶活力为14.57iu/ml。结果表明，对比实施例1中天然半乳聚糖酶中内外切半乳聚糖酶活力，经过10-100kda超滤膜所得透过液组分中外切半乳聚糖酶活力由51.97iu/ml降低至14.57iu/ml，因此通过超滤技术可以有效的去除天然半乳聚糖酶中的外切酶组分。表1超滤技术对天然半乳聚糖酶中内切半乳聚糖酶和外切半乳聚糖酶的定向拆分超滤技术对天然半乳聚糖酶中内切半乳聚糖酶和外切半乳聚糖酶的定向拆分结果(以酶活力表示)如表1实施例3：利用定向拆分获得的黑曲霉内切半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。(1)半乳聚糖酶液的定向拆分：选用截留分子量为10-100kda的超滤膜，对天然半乳聚糖酶进行超滤，收集透过超滤膜的酶组分，即透过液酶组分。(2)水解制备阿拉伯半乳低聚糖：称取阿拉伯半乳聚糖于75ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)至底物浓度为10g/l，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后按酶用量37.5-600u/g阿拉伯半乳聚糖加入上述透过液酶组分，于50℃、150rpm的摇床中水解24h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心取上清液，分析检测其中阿拉伯半乳低聚糖的含量，结果见图1。结果表明：当酶用量在37.5-600u/g阿拉伯半乳聚糖范围内，随着酶用量的不断提高，低聚糖得率呈现不断上升的趋势，从初始得率5.69％提高至69.84％；而单糖得率从0.65％提高到8.09％，并一直处于较低水平；酶的选择性则呈现平稳趋势，保持在90％。由此可见酶用量越大，低聚糖得率越高。实施例4：利用定向拆分获得的黑曲霉内切半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。水解制备阿拉伯半乳低聚糖：称取阿拉伯半乳聚糖于75ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)至底物浓度为10-30g/l，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后按酶用量600u/g阿拉伯半乳聚糖加入上述透过液酶组分，于50℃、150rpm的摇床中水解24h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心取上清液，分析检测其中阿拉伯半乳低聚糖的含量，结果见图2。结果表明：当阿拉伯半乳聚糖浓度在10-30g/l范围内，随着聚糖浓度不断提高，低聚糖得率呈先上升再下降的趋势，在底物浓度为20g/l时低聚糖的得率最高，为77.01％；这是由于聚糖浓度过高，导致体系粘度增大，降低了体系传质效率。此外，单糖得率一直保持较低水平。而酶的选择性则呈现不断下降的趋势，从90.34％降低至86.93％。因此，在酶用量为600u/g、聚糖浓度为20g/l的条件下，酶解24h后，低聚糖的得率达77.01％，单糖得率为9.31％，此时酶的选择性为89.21％。实施例5：利用定向拆分获得的黑曲霉内切半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。水解制备阿拉伯半乳低聚糖：称取阿拉伯半乳聚糖于75ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)至底物浓度为20g/l，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后按酶用量600u/g阿拉伯半乳聚糖加入上述透过液酶组分，于50℃、150rpm的摇床中水解3-48h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心取上清液，分析检测其中阿拉伯半乳低聚糖的含量，结果见图3。结果表明：在酶水解历程中，酶水解初期酶反应速度较快。当酶解时间达到24h，低聚糖得率达76.41％，单糖得率仅为8.76％。进一步延长酶解时间至48h，低聚糖得率与单糖得率增加均不显著，其中低聚糖得率达77.86％，仅提高了1.45％。酶对低聚糖的选择性均大于80％。基于上述结果，利用定向拆分获得的黑曲霉内切半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖的最适条件为：聚糖浓度为20g/l、酶用量为600u/g、ph5.5，50℃及150rpm条件下酶解48h后，低聚糖得率为77.86％，单糖得率为10.16％，此时酶的选择性为88.46％。对比例1：利用未经定向拆分的黑曲霉半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。直接使用实施例1中用黑曲霉制备获取的天然半乳聚糖酶水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。实验方法如下：称取阿拉伯半乳聚糖于75ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)至底物浓度为10g/l，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后按酶用量600u/g阿拉伯半乳聚糖加入未经定向拆分的天然半乳聚糖酶，于50℃、150rpm的摇床中水解24h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心取上清液，分析检测其中阿拉伯半乳低聚糖的含量，结果分析见表2。表2原酶液水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖的得率低聚糖得率(％)单糖得率(％)低聚糖％/单糖％原酶液7.4058.280.13结果表明，采用原酶液水解阿拉伯半乳聚糖所得低聚糖的得率仅为7.40％，而单糖得率高达58.28％。表明未经定向拆分的原酶液制备阿拉伯半乳低聚糖的效率远低于经定向拆分所得的内切半乳聚糖酶。对比例2：利用超滤得到的截留液酶组分水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。直接使用实施例2中超滤得到的截留液酶组分水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖。实验方法如下：称取阿拉伯半乳聚糖于75ml酶解瓶中，加入0.1m乙酸/乙酸钠缓冲液(ph为5.5)至底物浓度为10g/l，待阿拉伯半乳聚糖完全溶解后按酶用量600u/g阿拉伯半乳聚糖加入超滤得到的截留液酶组分，于50℃、150rpm的摇床中水解24h。水解结束后于100℃下灭酶活10min，离心取上清液，分析检测其中阿拉伯半乳低聚糖的含量，结果分析见表3。表3超滤截留液酶组分水解阿拉伯半乳聚糖制备低聚糖的得率低聚糖得率(％)单糖得率(％)低聚糖％/单糖％截留液组分5.3260.060.09结果表明，采用超滤截留液酶组分水解阿拉伯半乳聚糖所得低聚糖得率仅为5.32％，而单糖得率高达60.06％。表明截留液酶组分制备阿拉伯半乳低聚糖的效率远低于经定向拆分所得的透过液酶组分，即内切半乳聚糖酶。当前第1页12