一种美藤果的分段酶解工艺及其制备的美藤果肽

本发明属于活性肽生产技术领域，涉及一种美藤果的分段酶解工艺及其制备的美藤果肽。

背景技术：

美藤果学名南美油藤，为大戟科美藤果属的多年生木质藤本植物。目前主要种植于缅甸、老挝及我国云南普洱、西双版纳等多个国家和地区，且种植规模正在逐渐扩大。目前美藤果种子主要用于油脂的提取，随之会产生大量的饼粕。美藤果种仁含蛋白27％，其含量仅次于大豆，饼粕中蛋白含量为60％以上。研究发现美藤果蛋白营养价值较高，是一种优质的植物蛋白来源，富含9种人体必需的氨基酸。随着人们生活水平的不断提高，对植物蛋白的需求量也越来越大，植物蛋白不仅可作为食品添加剂，也可作为营养成分补充人体所需的蛋白质。蛋白质由于其分子量大且结构复杂，摄入人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。

近年来，生物活性肽在生物体内所发挥的生理功能受到越来越多的重视。生物活性肽与蛋白质相比，具有结构简单分子量小的特点，生物活性肽不仅能为机体提供营养，还具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能、抗衰老等多种生理活性功能。氧化与人类的癌症、老化、动脉硬化等多种疾病相关，适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病，对于预防和治疗心血管、糖尿病、癌症、衰老等慢性病有一定的疗效。现有技术中采用酶解法制备蛋白肽较普遍，但也存在多肽得率不高、生物活性较差等缺点。因此，通过蛋白质的可控酶解技术制备得率高、生物活性强的天然抗氧化肽，对于研究开发生物活性肽类抗氧化食品、保健品具有十分重要的科学意义和应用前景。

专利cn111961125a提出了一种美藤果免疫活性肽的制备方法，该方法先采用超声及透析的方法得到美藤果清蛋白，后采用超滤和分离纯化制备而得到，虽小分子肽的得率较高，但操作麻烦。专利cn110066844a一种具有降尿酸功效的美藤果粕生物活性肽的制备方法中也提出了一种美藤果活性肽的制备方法，该方法需要乳酸芽孢杆菌进行发酵，操作复杂，时间较长，发酵过程难以控制。因此为解决现实中美藤果生物活性肽制备过程复杂的问题，本专利提出一种分级酶解工艺制备美藤果生物活性肽的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单，处理条件温和，多肽得率高的分级酶解工艺制备美藤果生物活性肽的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种美藤果的分段酶解工艺，包括如下步骤：

s1、原料预处理：对美藤果饼粕进行粉碎，然后过筛，得美藤果粕粉备用；

s2、高温处理：将美藤果粕粉按料液比1：10-1：40加入纯净水，于90℃-100℃水浴锅中加热，并保温3-6h；

s3、蛋白酶解：美藤果蛋白高温变性后，将其取出冷却至50℃左右，加入0.5％-1.0％碱性蛋白酶，于ph8.5-10,温度为50℃-70℃下酶解2-6h，酶解完成后进行离心，收集溶液a；

s4、二次酶解：于沉淀物中按料液比1：5-1:20加入纯净水，加入0.1％-0.5％中性蛋白酶，于ph5-8,温度为40℃-60℃下酶解2-6h，酶解完成后进行离心，收集溶液b；

s5、灭酶活：合并溶液a和溶液b，于95℃-100℃下灭酶15-20min，即得美藤果肽溶液；

s6、浓缩干燥：将美藤果肽溶液减压蒸馏，然后进行干燥，即得美藤果抗氧化活性肽。

优选的，步骤s1中，粉碎后的物料过80-110目筛。

优选的，步骤s1中，粉碎后的物料过100目筛。

优选的，步骤s2中，高温处理料液比为1：20。

优选的，步骤s2中，水浴温度为100℃，保温时间为5h。

优选的，步骤s3中，碱性蛋白酶的添加量为0.75％，酶解ph为8.5。

优选的，步骤s3中，酶解温度为55℃，酶解时间为5h。

优选的，步骤s6中，所采用的干燥方式为真空冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明的有益效果是：

本发明采用高温蒸煮结合酶解得方法对美藤果蛋白进行水解，高温使得蛋白空间结构发生变化，空间结构松散，更容易被蛋白酶水解，多肽得率明显提高；

按照本发明的方法制得的美藤果肽分子量低且均一，纯度较高，能够快速穿过人体口腔和胃，直接进入小肠，能更好地被人体消化吸收，而且具有显著清除自由基的功效，可作为一种天然的抗氧化剂应用到保健品领域。

附图说明

图1为本发明实验例1多肽得率图；

图2为本发明实施例1制得的美藤果肽的相对分子质量分布图；

图3为本发明实验例4羟自由基清除率图；

图4为本发明实验例4超氧自由基清除率图；

图5为本发明实验例4dpph自由基清除率图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1

一种美藤果的分段酶解工艺，包括如下步骤：

s1、原料预处理：对美藤果饼粕进行粉碎，然后过100目筛，得美藤果粕粉备用；

s2、高温处理：将美藤果粕粉按料液比1：20(w/v)加入纯净水，于95℃水浴锅中加热，并保温6h；

s3、蛋白酶解：美藤果蛋白高温变性后，将其取出冷却至50℃左右，加入0.75％碱性蛋白酶，于ph10,温度为60℃下酶解6h，酶解完成后进行离心，收集溶液a；

s4、二次酶解：于沉淀物中按料液比1：10(w/v)加入纯净水，加入0.25％中性蛋白酶，于ph7,温度为50℃下酶解3h，酶解完成后进行离心，收集溶液b；

s5、灭酶活：合并溶液a和溶液b，于100℃下灭酶20min，即得美藤果肽溶液；

s6、浓缩干燥：将美藤果肽溶液减压蒸馏，然后进行喷雾干燥干燥，即得美藤果抗氧化活性肽。

实施例2

一种美藤果的分段酶解工艺，包括如下步骤：

s1、原料预处理：对美藤果饼粕进行粉碎，然后过100目筛，得美藤果粕粉备用；

s2、高温处理：将美藤果粕粉按料液比1：30(w/v)加入纯净水，于100℃水浴锅中加热，并保温4h；

s3、蛋白酶解：美藤果蛋白高温变性后，将其取出冷却至50℃左右，加入0.9％碱性蛋白酶，于ph9,温度为50℃下酶解3h，酶解完成后进行离心，收集溶液a；

s4、二次酶解：于沉淀物中按料液比1：15(w/v)加入纯净水，加入0.4％中性蛋白酶，于ph7,温度为50℃下酶解3h，酶解完成后进行离心，收集溶液b；

s5、灭酶活：合并溶液a和溶液b，于100℃下灭酶15min，即得美藤果肽溶液；

s6、浓缩干燥：将美藤果肽溶液减压蒸馏，然后进行喷雾干燥干燥，即得美藤果抗氧化活性肽。

对比例1

利用目前常见的酶解技术进行，步骤如下：

s1、原料预处理：对美藤果饼粕进行粉碎，然后过100目筛，得美藤果粕粉备用。

s2、高温处理：将美藤果粕粉按料液比1：20(w/v)加入纯净水，于95℃水浴锅中加热，并保温6h。

s3、蛋白酶解：将美藤果粕粉按料液比1：20(w/v)加入纯净水，加入0.75％碱性蛋白酶和0.25％中性蛋白酶进行于ph8.5,温度为55℃下复合酶解6h，酶解完成后进行离心，过滤并收集溶液。

s4、灭酶活：100℃下灭酶20min，即得美藤果肽溶液。

s5、浓缩干燥：将美藤果肽溶液减压蒸馏，然后进行喷雾干燥，即得。

实验例1

美藤果多肽得率的测定：

取5ml酶解上清液测定其蛋白质含量；另取5ml酶解上清液，加入5ml20％三氯乙酸溶液，摇匀，静置30min，以4000r/min离心20min，取上清液测定肽得率。

分别取实施案例1，实施案例2，对比案例1所制得的美藤果肽样品，测定其蛋白质的含量；另取一批样品制成溶液后，加入5ml20％三氯乙酸溶液，摇匀，静置30min，以4000r/min离心20min，取上清液测定多肽得率，计算公式为：

肽得率＝(水解后酸溶蛋白含量-水解前酸溶蛋白含量)/总蛋白含量×100％

结果如图1所示，采用本发明方法所制备得到的美藤果肽得率显著高于常见的酶解方式制得的美藤果肽。

实验例2

美藤果抗氧化活性肽的氨基酸组成测定：

称取2.5g实施案例1所制得的干燥样品，加入20ml3mg/ml的磺基水杨酸，10000r/min冰浴匀浆20s×3。12000×g、4℃离心15min后，取4ml上清液加2ml正己烷，混合均匀后静置分层。取水相通过0.22μm滤膜过滤。使用氨基酸自动分析仪对氨基酸含量进行测定。测定结果如表1所示，美藤果抗氧化活性肽中一共含有16种氨基酸，其中必需氨基酸，支链氨基酸，碱性氨基酸的含量分别为31.29％，17.69％，17.53％。

表1

注：碱性氨基酸包括lys、arg、his；支链氨基酸包括val、leu、ile。

实验例3

美藤果抗氧化活性肽相对分子质量分布测定：

参考gb/t22492－2008附录a《大豆肽相对分子质量分布的测定方法》，采用高效凝胶过滤色谱法测定实施案例1制得的美藤果肽的相对分子质量分布情况，色谱柱为tskg2000swxl(5μm，300mm×7.8mm)凝胶色谱柱对制得的美藤果抗氧化活性肽的相对分子质量分布进行测定，结果如图2所示，美藤果抗氧化活性肽大多为分子量＜1000da的寡肽(占94％)，分子量在2000da以上的大分子多肽只占1％，这说明经本方法制备而得到的美藤果抗氧化活性肽分子量低且均一，纯度较高。

表2

实验例4

美藤果抗氧化活性肽的抗氧化性能验证

对实施案例1方法所制得的美藤果抗氧化活性肽的羟自由基清除率，超氧自由基清除率，dpph自由基清除能力进行测定，结果表明通过本方法制备而得到的美藤果肽具备较强的抗氧化活性。

1.羟自由基清除率

取实施例1制得的美藤果抗氧化活性肽样品配置成浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml的溶液，取2ml制备好的溶液加入到2ml浓度9mmol/l的硫酸亚铁溶液和2ml浓度10mmol/l的过氧化氢水溶液，摇匀，37℃静置10min，加入2ml浓度9mmol/l的水杨酸溶液，混合后37℃静置30min于510nm处测吸光度值，计算公式为:

式中：a0：不加样品的吸光度值

ai：加入样品的吸光度值

a2：无显色剂时样品的本底值

羟自由基清除率结果如图3所示，说明通过该方法制备出来的美藤果抗氧化活性肽具有较强的羟自由基清除能力，且具有浓度依赖效应，在2.0mg/ml时，羟自由基清除能力越强，高达32.15％。

2.超氧自由基清除率

取实施例1制得的美藤果抗氧化活性肽样品配置成浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml的溶液，吸取2.25ml的0.05mol/ltris-hcl缓冲液于25℃下预热20min，加入0.5ml不同浓度的样品和0.2ml25mmol/l邻苯三酚溶液，迅速混匀后于25℃下反应3min，用3mol/l盐酸终止反应，以tris－hcl溶液调零，在320nm处测定吸光度，空白对照组用相同体积的蒸馏水作为替代。超氧阴离子自由基的消除率可表示为:

式中：a1：蒸馏水吸光度

a2：样品吸光度

超氧自由基清除率结果如图4所示，说明通过该方法制备出来的美藤果抗氧化活性肽具有较强的超氧自由基清除能力，且具有浓度依赖效应，在2.0mg/ml时，超氧自由基清除能力越强，高达35.51％。

3.dpph自由基清除能力

以无水乙醇为溶剂，配制dpph的浓度为0.1mmol/l。将实施例1制得的美藤果抗氧化活性肽样品配置成浓度为0.5mg/ml，1mg/ml，1.5mg/ml，2mg/ml的溶液，分别取2ml与2mldpph无水乙醇溶液混合，并剧烈振荡，在室温下避光反应30min，然后在517nm处测定其吸光值ai。空白组以等体积无水乙醇溶液替代dpph溶液，对照组以等体积蒸馏水替代样品溶液。dpph自由基清除率用下式计算:

式中：aa：对照组吸光度

ai：样品组吸光度

aj：空白组吸光度

dpph自由基清除率结果如图5所示，说明通过该方法制备出来的美藤果抗氧化活性肽具有较强的dpph自由基清除能力，且具有浓度依赖效应，在2.0mg/ml时，dpph自由基清除能力越强，高达40.55％。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。