一种与湖羊睾丸性状相关的ADPGK基因分子标记及其应用

no.1的130bp处y表示有一个c/t的碱基突变，该突变导致rflp
‑ꢀ
hpych4
ꢀⅲ
多态性。
7.扩增上述分子标记的引物对如下：正向引物f：acctgaaaagggttggagaat；反向引物r：aggaaggttgttggggtcattt。
8.利用上述与湖羊睾丸性状相关的adpgk基因分子标记可以用于湖羊分子标记辅助选择，特别是可用于精子产量高的湖羊公羊的分子标记辅助选择。
9.本发明通过采集湖羊公羊附睾尾精液，提取基因组dna，并设计特异性引物对，对湖羊基因组进行pcr扩增，并采用hpych4
ꢀⅲ‑
rflp方法对湖羊adpgk基因snp位点进行基因分型，最后分析了湖羊adpgk基因分型与睾丸性状的关联，结果显示，湖羊个体的基因分型为cc基因型和tc基因型，且tc基因型个体睾丸重量、大小、附睾重以及精子数显著高于cc基因型个体，因此，湖羊公羊的早期选种中可以选择tc基因型个体，从而实现精子产量较高的湖羊公羊的早期选育。
10.通过本发明提供的分子标记进行分子标记辅助选择，只需检测分子标记的特征扩增条带，即可预测幼年湖羊公羊成年后的精子产量，此方法简单可行、选择效率高，可在湖羊公羊幼年时选择出精子产量较高的湖羊个体，选择目标明确，且不受生长环境影响，使湖羊品种的早期选育成为可能，加速了育种进程。
附图说明
11.图1是本发明的湖羊adpgk基因部分测序结果和snp位点；图2是本发明湖羊adpgk基因hpych4
ꢀⅲ‑
rflp检测结果。琼脂糖浓度为3%，图中标记说明：泳道m为dl2000 dna marker (包含100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp和2000 bp共6种带型)；tt基因型片段大小为312 bp，cc基因型片段大小分别为131 bp和181 bp；tc基因型片段大小分别为131 bp、181 bp和312 bp。
具体实施方式
12.以下实施方式是对本发明的进一步说明，但不理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或替换，均应落入本发明的保护范围。
13.本发明6月龄湖羊公羊样品采自民勤县德福农业生物科技有限公司。
14.1. 湖羊睾丸组织及附睾尾精液采集取上述湖羊公羊左侧睾丸组织，液氮保存，用于rna提取。并将湖羊左侧附睾尾称重并浸泡在50 ml盐水中，用无菌剪刀将组织剪成小块置于试管中，于37℃的水浴中孵育1小时，通过200目铜网过滤去除组织碎片，获得精液。
15.2. 睾丸rna提取（1）将睾丸组织块于液氮中研磨成粉末状；（2）取100mg睾丸组织粉末转移至1.5 ml离心管，加入1ml trizol充分裂解5 min；（3）加入200μl的氯仿，离心管加盖，振荡混合15s，室温放置10 min；（4) 在4℃下，12000r/min离心10min，上清移至另一新的离心管中，并加入0.5ml异戊醇，混匀后室温放置5
‑
10min；（5）在4℃下，将新离心管 12000r/min离心10分钟，弃上清液，加入1ml的75%乙醇
悬浮沉淀，并于4℃下12000r/min继续离心5min后弃乙醇，于空气中放置5
‑
10min，得到rna沉淀；（6）用50μl无rnase 水（depc）溶解 rna沉淀，分光光度计测定浓度后，
‑
80℃保存。
16.3. 反转录反应根据全式金easyscript one
‑
step gdna removal and cdna synthesis supermix试剂盒说明，将提取好的rna稀释至同一浓度(1 μg/μl)后转移1μl rna稀释液至新pcr管，向所述pcr管内加入1 μl anchored oligo(dt) primer、10 μl 2
×
es reaction mix、1 μl easyscript rt/ri enzyme mix、1μl gdna remover、6 μl rnase
‑
free water，总体积为20 μl，轻轻混匀。采用pcr仪按下列条件进行反转录反应：42℃孵育15 min，85℃加热5 s失活easyscript rt/ri enzyme mix和gdna remover。将反转录生成的cdna稀释至20 ng/μl，
‑
80℃保存。
17.4. 聚合酶链式反应（pcr）根据湖羊adpgk基因的mrna序列（xm_027971562.1），利用oligo7设计p1
‑
p4四对引物（如表1所示）分别扩增该基因mrna序列，具体为：将50个湖羊公羊个体的cdna做混池（每10个湖羊个体为一个混池），并以混池cdna为模板，pcr扩增目的片段。pcr扩增反应总体系为20 μl：其中cdna模板（20 ng/μl）1 μl，2
×
easy taq pcr super mix 10 μl（trangen），上述正向引物和反向引物各0.5 μl（10 μm），ddh2o补足至20 μl。pcr扩增反应条件：94℃预变性5 min后于94℃变性30 s，然后按照表1中各引物对应的退火温度退火30 s，再于72℃延伸60 s（变性、退火、延伸步骤进行34个循环）；最后于72 ℃延伸5 min，得到pcr产物，并利用1%琼脂糖凝胶对所述pcr产物进行电泳检测。
18.5. adpgk基因单核苷酸多态性筛查将上述得到的pcr产物进行测序，测序比对后发现，p3引物扩增得到的pcr产物存在一处c/t的碱基突变，此突变产生限制性内切酶hpych4
ꢀⅲ
的酶切位点（a[t/c]n
↓
gt）单核苷酸多态性 (snp)，测序峰图部分结果如图1所示。
[0019]
6. 基因组dna提取（1）取步骤1中湖羊精液(1 ml)转移至1.5ml的离心管中，4℃下，12000 rpm离心5
‑
10 min，弃上清，精子贴于管壁；（2）向离心管中加入100
ꢀµ
l的sds（20%，20g sds溶于100ml蒸馏水中）和400
µ
l组织抽提液[0.5mol/l的edta 3ml、1 mol/l的tris
‑
hcl(ph 7.4) 1ml、10%的sds 15ml、dtt 0.1155g、nacl 0.435g，加水至120ml，按常规方法进行高压灭菌]，涡旋震荡使精子沉淀完全溶于抽提液；（3）于上述组织抽提液中加入20
µ
l蛋白酶k（10mg/ml）得到反应液，用封口膜封住后颠倒混匀，置于55℃水浴消化过夜，期间取出轻摇几次，使沉淀块散开，以利酶解；（4) 将反应液冷却至室温，加入300
ꢀµ
l饱和食盐水，颠倒混匀2
‑
3 min，4℃静置10 min；（5）12000rpm离心 10 min，转移上清至新的离心管；（6）沉淀中加入1 ml预冷无水乙醇，颠倒混匀1
‑
2 min（此时可看到白色絮状沉淀），12000 rpm离心2 min；（7）弃上清，保留dna沉淀；
（8）dna沉淀中加入500
µ
l 75%乙醇（v/v），轻轻混匀，12000 rpmm离心1 min，弃上清；（9）重复步骤8，弃上清；（10）等乙醇挥发干净后加入200
ꢀµ
l水或te，溶解dna；（11）4℃保存至dna完全溶解，分光光度计测定浓度后，
‑
80℃保存。
[0020]
7. 限制性酶切片段多态性（rflp）检测根据adpgk的dna序列 (gene bank id: 101116836) 在上述发现的突变位点附近序列设计一对特异性引物p5，以步骤6提取的湖羊基因组dna为模板，pcr扩增目的片段，引物p5序列如表1，pcr反应扩增反应体系及反应条件同步骤4。
[0021]
表1 湖羊adpgk基因pcr引物序列采用所述引物对p5扩增得到的dna序列如序列表seq id no.1所示，位于该序列130 bp处存在c/t单核苷酸多态性 (snp)。采用hpych4
ꢀⅲ‑
rflp方法对湖羊adpgk基因snp位点进行基因分型，酶切反应体系为20 μl：其中pcr 产物4 μl，限制性内切酶（hpych4
ꢀⅲ
）0.3 μl，10
×
buffer 3 μl，ddh2o 12.7 μl，样品混匀后离心，37℃孵育12 h。
[0022]
取5 μl酶切产物用3%琼脂糖凝胶电泳，之后进行基因分型和鉴定，结果如图2所示。此扩增片段大小为312 bp，该酶切多态位点位于该片段的130 bp处，当该变异位点为c碱基时，会产生限制性内切酶hpych4
ꢀⅲ
的酶切位点（a[t/c]n
↓
gt），hpych4
ꢀⅲ
酶切pcr产物后会产生2个大小分别为131 bp和181bp的条带，其基因型为cc型；当该位点为t碱基时，则不能产生hpych4
ꢀⅲ
的限制酶酶切位点，hpych4
ꢀⅲ
酶切pcr产物后仍为一条312 bp的条带，其基因型为tt型；当该位点出为t/c杂合型时，由于同时存在t和c碱基，则hpych4
ꢀⅲ
酶切pcr产物后产生3条大小分别为312 bp、131 bp和181 bp条带，其基因型为tc型。
[0023]
8. 湖羊adpgk基因型与睾丸性状关联分析试验共检测了466只湖羊的多态性，基因型检测结果表明在466只湖羊个体中cc基因型有319只，tc型有147只，没有tt型个体。分析湖羊adpgk基因上该单核苷酸多态性基因频率分布，结果见表2。
[0024]
表2 adpgk基因型频率和等位基因频率
利用r软件去除批次效应，采用spss 19.0软件进行基因型与表型之间的关联分析，如果数据符合正态性检验，则通过独立样本t检验分析数据，否则使用mann
‑
whitney u检验。所有值均报告为平均值
±
标准误，并且p <0.05被认为具有统计学意义。
[0025]
基因型与睾丸性状分析结果见表3，湖羊adpgk基因多态性与睾丸大小、睾丸长径、睾丸短径、附睾重以及精子数显著相关（p<0.05）。
[0026]
表3 adpgk 基因不同基因型与睾丸性状的相关性表3中结果显示，湖羊tc基因型个体睾丸重量、大小、附睾重以及精子数显著高于cc基因型个体，因此，湖羊公羊的早期选种中可以选择tc基因型个体，从而实现精子产量较高的湖羊公羊的早期选育。
[0027]
序列表<110>
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兰州大学<120>
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一种与湖羊睾丸性状相关的adpgk基因分子标记及其应用<160>
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1<170>
ꢀꢀ
siposequencelisting 1.0<210>
ꢀꢀ
1<211>
ꢀꢀ
312<212>
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dna<213>
ꢀꢀ
绵羊(ovis aries)<220><221> mutation<400>
ꢀꢀ
1acctgaaaag ggttggagaa tcaagttttt agccctgtaa cacacaacat aaaaataaac 60gagaacaaaa atccagtctt gttagtagat agctgaattg cgattaaaac ctgaaatgtt 120tctgtgtaay（c/t）tgtcaaaagg ctggaatgta tctggtagtt taatctgctg ttgtttcttt 180ggctgtcttt cagtttgatc aacagaaatg gtttttgaca ctctcgatcc tatttcccag 240accactgaat tcctgtcatt tttaggttgg ctagttttcc ttcatcagaa aaatgacccc 300aacaaccttc ct
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312