编码重组UNG酶及其纯化工艺的制作方法

no：2所示，重组ung酶氨基酸序列如seq id no：1所示。
8.一种包含了如上文所述编码重组ung的基因的载体，载体为pet15b。
9.一种包含了如上文所述载体的大肠杆菌宿主菌株，大肠杆菌宿主菌株为bl21(de3)。
10.一种重组ung酶，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
11.一种ung酶在大肠杆菌中高效可溶表达方法，包括如下步骤：s1挑取一个含有权利要求3所述的大肠杆菌菌株单菌落，接入lb培养液，适当温度培养过夜；s2取适量过夜培养物接入lb培养液中，适当温度下震荡培养至对数中期od600为0.6-0.8；s3在培养物中加入1mm iptg，于适当温度下震荡过夜诱导表达，适当温度下离心收集含有重组ung酶的大肠杆菌菌体沉淀。
12.优选地，上述技术方案中，lb培养液中均含有氨苄青霉素50mg/l。
13.一种重组ung酶的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：s1将收集得到的含有诱导重组ung酶大肠杆菌菌体沉淀；s2吸去上清，菌种加入适量裂解液搅拌，获得足量的破碎菌体；s3破碎菌体于冰浴中超声，取上清液离心，上清液滤除固体颗粒；s4将上清液经过层析柱流穿后，以平衡液和10%洗脱液分别清洗样品；s5当杂蛋白洗脱完全后，用100%洗脱液进行udg酶洗脱收集；s7将收集到的样品用离子柱a液稀释并流穿已经平衡好的阴离子柱，以离子柱a液洗脱杂蛋白完全后，用100 %洗脱液进行洗脱及收集，uv ≥ 50收集，uv 《 100停止收集。
14.优选地，上述技术方案中，包括如下步骤：s1将收集得到的含有诱导重组ung酶大肠杆菌菌体沉淀；s2吸去上清，100g菌种加1600ml裂解液置于5l烧杯中，放到磁力搅拌器上进行搅拌裂解，800rpm搅拌裂解30min；s3破碎菌体，于冰浴中超声，超声条件：超声4 s，停止5 s，变幅杆功率为50% 于细胞超声破碎仪中超声30 min；取上步上清液置于贝克曼allegratm 25r centrifug离心机中以13000 rpm 离心12 min。待离心完成后，将上清液通过0.22 um 滤膜过滤；s4将上述样品以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的层析柱，待样品流穿完全后，以平衡液以4 ml/min流速洗杂蛋白的，当杂蛋白洗脱完全后，用10%洗脱液进行再次洗杂；s5当杂蛋白洗脱完全后，用100%洗脱液进行udg酶洗脱收集；s6将上述样品用离子柱a液稀释50倍（电导：2.0 cons），以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的阴离子柱，以5-10个柱体积的离子柱a液以4 ml/min流速洗杂蛋白的，当杂蛋白洗脱完全后，用100 %洗脱液进行洗脱及收集，uv》=50收集，uv《100停止收集。
15.优选地，上述技术方案中，裂解液为：20 mm tris-hcl，500 mm nacl，10 mm 咪唑；洗脱液为：20 mm tris-hcl，50 mm nacl，400 mm 咪唑；离子柱a液：20 mm tris-hcl; 200 mm nacl; ph:8；离子柱b液：20 mm tris-hcl; 1 m nacl; ph:8。
16.重组ung酶在预防非特异性pcr扩增和污染、保证pcr结果准确性中的应用。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：其编码出的ung酶具有较强的活性，该ung酶编码基因在大肠杆菌中能高效可溶表达，通过两步纯化工艺即可获得纯度较高的重组ung酶。
18.具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
19.除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
20.实施例1：ung酶基因的表达载体构建在ung酶全基因(如seq id no：2所示)5’端引入xhoi酶切位点序列，在3’端引入组氨酸标签和bamhi酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pet-15b质粒中，得到冻干质粒两管（约5ug/管），记为pet15b-ung质粒。
21.实施例2：ung酶在重组大肠杆菌中的表达和鉴定1) 将实施例1中测序比对正确的pet15b-ung质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，37℃氨苄青霉素lb平板中过夜培养。
22.2) 第二天挑含有pet15b-ung质粒的重组单菌落，接入含有50mg/l氨苄青霉素lb培养液，37℃培养过夜。
23.3) 取5ml过夜培养物接入500ml含50mg/l氨苄青霉素的lb培养液中，37℃振荡培养。
24.4) 接种后每隔1小时测菌液od600值，待od600≈0.6-0.8时，用1mm iptg进行诱导表达。
25.5) 25℃过夜诱导表达后收集菌液，取1ml菌液，12000rpm高速离心3min，用预冷的 pbs清洗沉淀，加入5
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sds凝胶上样缓冲液，100℃加热5min，12000rpm高速离心1min，取上清。
26.sds-page验证步骤如下：1.将最终所得样品用样品稀释液稀释为0.1 mg/ml，取80 ul样品与20 ul 5x蛋白上样缓冲液混匀于金属浴中100 ℃加热煮沸20 min。
27.2.待完成后将样品置于冰上冷却5 min。
28.3.冷却后将样品振荡混匀，然后置于离心机以12000 rpm 离心1 min。
29.4.取protein marker 5 ul，取离心后蛋白处理样品上清液20 ul进行点样。
30.5.设定电压80 v电流60 ma 时间20 min，然后再以120 v电流60 ma 时间40 min进行电泳。
31.6.待电泳时间完成后，将蛋白胶取出置于200 ml 考马斯亮蓝溶液中，然后微波高火加热30 s。
32.7.待上述步骤完成后，将蛋白胶小心取出置于200 ml清水中，高火煮沸数次，直至脱色完全。
33.8.考马斯亮蓝染色，观察表达产物条带。其中：1: 400mm咪唑洗脱样品（经过透析后，二次纯化，所得udg酶较纯）；2: 50mm咪唑洗脱样品；3：udg酶大肠杆菌诱导上清； 4：udg
酶大肠杆菌未诱导上清；5：100mm咪唑洗脱样品；6： 400mm咪唑洗脱样品（初次纯化）。实施例3：ung酶纯化步骤1重组菌体破碎1.称取实施例2中20 g(5 l 培养基所获取菌种) 离心后的udg酶菌种固体置于1 l烧杯中并用800 ml 裂解液（ph=8~9）以800 rpm转速于磁力搅拌器上进行搅拌裂解30 min。
34.2.取上步已裂解液体400 ml 置于冰水浴中，以条件为：超声4 s，停止5 s，变幅杆功率为50% 于细胞超声破碎仪中超声30 min。
35.3.取上步上清液置于贝克曼allegratm 25r centrifug离心机中以13000 rpm 离心12 min。待离心完成后，将上清液通过0.22 um 滤膜过滤，为下一步层析纯化做准备。
36.步骤2.镍柱亲和纯化细菌裂解液1.将上述样品以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的层析柱（5 ml预装柱），待样品流穿完全后，以平衡液以4 ml/min流速洗杂蛋白的（5-10个柱体积），当杂蛋白洗脱完全后，用10%洗脱液（40 mm咪唑）进行再次洗杂。
37.2.当杂蛋白洗脱完全后，用100%洗脱液进行udg酶洗脱收集。
38.3.将上述样品用离子柱a液稀释50倍（电导：2.0 cons），以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的阴离子柱，以离子柱a液以4 ml/min流速洗杂蛋白的（5-10个柱体积），当杂蛋白洗脱完全后，用100 %洗脱液进行洗脱（uv》=50收集，uv《100停止收集），样品收集后以紫外分光光度计按照bsa模式进行蛋白定量。
39.步骤3.rung酶保存将上述纯化合并样品加入dtt、tris-hcl和甘油等，最终ung酶的保存缓冲液为：10 mm tris-hcl(ph:7.4);50 mm kcl;1 mm dtt;0.1mm edta;0.1 mg/ml bsa;50% 甘油；-20冰箱长期保存。
40.实施例4：ung酶生物学活性验证将实施例3制备得到的rung酶应用于pcr扩增中。首先用核酸提取试剂盒提取肿瘤细胞核酸，并将核酸进行稀释，按如下程序和方法制备反应组： 25μl反应体系中含有pcr反应液（引物+探针）7.5μl、酶混合液5μl(含dutp， datp，dctp，dgtp)、甲/乙流感反应液4μl，模板5μl（100ng），udg酶0.4μl，水3.1μl，同时制备对照组：25μl反应体系中含有pcr反应液（引物+探针）7.5μl、酶混合液5μl(含dutp， datp，dctp，dgtp)、甲/乙流感反应液4μl，模板5μl（100ng），水3.5μl，将反应组和对照组分别置于37℃反应10min后，在pcr仪扩增确定其反应活性，其中pcr反应条件： 94℃预变性2min，热循环30次(94℃变性60s， 55℃退火60s，70℃延伸1min)， 72℃延伸5min，4℃保存。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测其活性，添加ung酶反应组pcr扩增产物没有任何条带，而添加ung酶pcr扩增产物有目的条带，说明反应组具有明显的尿嘧啶-dna糖苷酶特异活性，可以用于pcr实验室中dna防污染中。
41.实施例5：ung酶性能验证，1.将实施例3中所得样品稀释为0.1mg/ml，按如下25ul体系进行精确配置：
42.模板：甲乙流质粒，模板反应液为原质粒稀释5倍，25倍，每个反应重复4次。
43.2. pcr扩增程序按照以下程序进行pcr扩增：50 ℃ 15min；95℃ 5min；95 ℃ 10s，55 ℃ 40s，共进行45个循环；结果表明，与其他产家ung酶相比，本酶的性能良好，在防止核酸污染中起到一定的作用。
44.前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。