一种肺腺癌早期筛查的系统及其使用方法和应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种肺腺癌早期筛查的系统及其使用方法和应用。


背景技术：

2.肺癌是发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一。肺腺癌占肺癌总数的50%~70%，起源于支气管粘膜上皮及粘液腺，较易发生于女性或不抽烟者，具低龄化表现，早期一般没有明显的临床症状，易出现远端转移，往往发现即是中晚期。
3.因此，肺腺癌的早期筛查较其它癌种意义更为重大，临床急需一种简便、高灵敏度、高特异性的肺腺癌早期筛查方法。目前，可通过对肺癌高风险人群进行低剂量螺旋ct（ldct）筛查来尽早发现肺癌，并改善预后，以降低肺癌死亡率。然而，ldct检查并不适合日常监测，虽然平均辐射剂量仅为0.61～1.50 msv，但仍存在因辐射而诱发肿瘤的可能性；ldct检查只能发现毫米级的肿瘤，此时肿瘤血管已经生成，甚至已经发生转移；ldct并不能预测预后，无法指导后续治疗。
4.因此，如何提供一种操作简便、灵敏度高的肺腺癌的早期诊断系统，可以提高患者的生存率、预警肿瘤复发并指导后续的治疗，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种肺腺癌早期筛查的系统及其使用方法和应用，通过采集痰液样本，提取细胞rna及反转录肿瘤相关基因片段，最终实现在微流控芯片中检测，灵敏度、特异性高，检测成本较低，操作便捷，应用价值极高。
6.为达此目的，本发明采用如下技术方案：第一方面，本发明提供了一种肺腺癌早期筛查的系统，所述肺腺癌早期筛查的系统包括：样本采集模块：采集肺部组织的痰液样本；核酸提取模块：提取样本中的核酸；目标片段提取模块：对样本核酸进行目标基因的反转录；检测模块：对反转录产物进行检测；其中，所述检测包括使用含有分子信标的微流控芯片进行检测。
7.本发明中，通过上述四个模块的相互配合，可以实现对早期肺腺癌的快速、准确筛查；肺腺癌发源于支气管粘膜上皮或大支气管的粘液腺，痰液是气管和支气管黏液腺及杯状细胞分泌的液体，以其作为检测样本，实现了肺腺癌的极早期诊断，且对检测者几乎没有危害，可以持续监测；样本采集模块可以提取样本中含量极低的rna，灵敏度高，特异性好；通过对目标基因进行反转录并降解原始模板，实现了待测片段的富集，增加了检测结果的灵敏性与准确性；所述微流控芯片可实现多基因的同时检测，耗时较短，使用方便，成本较低，引入分子信标放大了反应的荧光信号，提高了检测的灵敏度，具有实际应用的价值。
8.优选地，所述样本采集模块采集肺部组织的痰液样本后，使用碱溶液对其进行液化，离心收集细胞。
9.肿瘤极早期无实体组织，ldct无法精准检出且存在致癌风险，难以持续监测。本发明中，通过收集痰液中的细胞，可以实现肺腺癌的极早期诊断，并且可以随时取样，持续监控。
10.优选地，所述碱溶液包括naoh溶液。
11.优选地，所述离心收集后，对收集到的细胞进行洗涤，并进行保存。
12.优选地，所述洗涤使用的液体包括生理盐水。
13.优选地，所述保存的温度为2~8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14.优选地，所述核酸提取模块通过异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸。
15.本发明中，采用异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法，可以从数量非常少的细胞中提取rna，增加检测的灵敏度。
16.优选地，所述提取后，使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化。
17.本发明中，在反转录前先使用dna酶对核酸进行消化，可以排除采集及提取过程中对样本造成污染的可能，增加检测的准确性。
18.优选地，所述目标片段提取模块对样本核酸进行反转录。
19.优选地，所述目标基因包括egfr、alk、ros1、kras、braf
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v600e、cmet、ret、her2、fgfr3、erbb2、ccn1、ttf
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1、myc或rb中的任意一种或至少两种的组合。
20.优选地，所述反转录后使用rna酶水解原始rna模板。
21.本发明中，使用rna酶水解原始rna模板，达到了纯化待测基因的目的，获取的待测物纯度更高，检测特异性更好。
22.优选地，所述微流控芯片包括加样孔、连接加样孔与反应孔的微阀以及反应孔，所述反应孔组成辐射状同心圆结构，所述反应孔中含有分子信标。
23.本发明中，所述微流控芯片的结构示意图如图1所示。所述微流控芯片的使用原理如下：本发明中，样本经由微阀进入反应孔中时，需要克服液体的表面张力。当离心力足够大时，可以抵消掉液体的表面张力，穿过微阀进入反应孔中。样本进入i级反应孔时，流经的微阀的液体管路较粗，需要的离心力较小；样本进入ii级反应孔时，流经的微阀的液体管路较细，需要的离心力较大。因此，将反转录产物加入微流控芯片中间的加样孔中，通过高速离心，反转录产物进入i级反应孔和ii级反应孔的微阀前；再通过超高速离心，样本进入ii级反应孔中。反转录产物识别反应孔中的分子信标并使其发生结构变化，从而产生荧光信号的变化。
24.本发明中，反应孔中分别包含不同分子的信标ha和hb，ha和hb为dna短链，两端含有互补的碱基序列，未激发时互补序列配对结合，呈发夹状结构，ha的互补序列中含有荧光供体和荧光受体，发夹样结构中荧光供体与荧光受体临近，信号被淬灭；当反应体系中存在待测片段时，分子信标发夹结构被破坏，ha和hb首尾相连形成长链，荧光信号被释放，实现了荧光信号的变化及信号级联放大，增加了检测反应的灵敏度与特异性。
25.优选地，所述反应孔包括i级反应孔和ii级反应孔。
26.本发明中，所述i级反应孔和ii级反应孔的数量可根据具体的检测实验进行确定，此处不做限定。
27.优选地，所述i级反应孔中含有与正常序列响应的分子信标，所述ii级反应孔中含有与突变序列响应的分子信标。
28.本发明中，所述i级反应孔中含有正常基因片段响应的ha和hb，当待测样本中基因片段提取正确时，i级反应孔应有荧光信号；所述ii级反应孔中含有突变基因片段响应的ha和hb，当待测样本中含有待测突变基因时，ii级反应孔有荧光信号。理论上肺腺癌早期不可能出现基因100%突变的情况，即正常序列一定存在，因此i级反应孔呈阳性时，证明检测体系正常，样本采集、核酸提取及目标基因提取的过程均正常，可进行后续检测，结果更加准确；ii级反应孔呈阳性时，证明待测基因片段发生了突变，呈阴性则代表基因片段未发生突变。方案设计合理，使用方便。
29.优选地，所述检测模块将反转录产物加入加样孔中，通过离心使反转录产物经由微阀流入反应孔中，进行检测反应。
30.作为优选技术方案，本发明所述肺腺癌早期筛查的系统，包括以下模块：样本采集模块：采集晨起肺深部组织的痰液样本，使用naoh溶液对其进行液化，离心收集细胞，使用生理盐水洗涤后，在2~8℃下保存；核酸提取模块：通过异硫氰酸胍
‑
硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸，并使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化；目标片段提取模块：通过反转录进行目标基因的提取，并使用rna酶水解原始rna模板，所述目标基因包括egfr、alk、ros1、kras、braf
‑
v600e、cmet、ret、her2、fgfr3、erbb2、ccn1、ttf
‑
1、myc或rb中的任意一种或至少两种的组合；检测模块：使用含有分子信标的微流控芯片对反转录产物进行检测；所述微流控芯片包括加样孔、连接加样孔与反应孔的微阀以及反应孔，所述反应孔组成辐射状同心圆结构，所述反应孔中含有分子信标；所述反应孔包括i级反应孔和ii级反应孔；所述i级反应孔中含有与正常序列响应的分子信标，所述ii级反应孔中含有与突变序列响应的分子信标；所述检测模块将反转录产物加入加样孔中，通过离心使反转录产物经由微阀流入反应孔中，进行检测反应。
31.第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的肺腺癌早期筛查的系统以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：采集晨起肺深部组织的痰液样本，液化后离心收集细胞并洗涤保存；通过异硫氰酸胍
‑
硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸，并使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化；通过反转录进行目标基因的提取，并使用rna酶水解原始rna模板；将反转录产物加入微流控芯片的加样孔中，通过离心使反转录产物经由微阀流入反应孔中，进行检测反应，并判断检测结果。
32.本发明中，所述检测方法具有良好的特异性、灵敏度与准确性，操作简单，使用方
便，促进了相关产品的推广与使用。
33.优选地，所述判断包括：根据i级反应孔和ii级反应孔中荧光信号的变化情况，确认检测体系正确，根据基因突变情况进行判断。
34.本发明中，所述判断标准如下：在i级反应孔呈阳性的前提下，ii级反应孔为阴性，则代表相关基因未发生突变，患肺腺癌的概率较小；在i级反应孔呈阳性的前提下，ii级反应孔为阳性，则代表相关基因发生了突变，存在患肺腺癌的概率；i级反应孔呈阴性，表明检测过程存在问题，重新采样再进行检测。
35.作为优选技术方案，本发明所述肺腺癌早期筛查的系统以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括以下步骤：（1）采集晨起肺深部组织的痰液样本，液化后离心收集细胞并洗涤保存；（2）通过异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸，并使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化；（3）通过反转录进行目标基因的提取，并使用rna酶水解原始rna模板；（4）将反转录产物加入微流控芯片的加样孔中，通过离心使反转录产物经由微阀流入反应孔中，进行检测反应，并判断检测结果，所述判断标准如下：在i级反应孔呈阳性的前提下，ii级反应孔为阴性，则代表相关基因未发生突变，患肺腺癌的概率较小；在i级反应孔呈阳性的前提下，ii级反应孔为阳性，则代表相关基因发生了突变，存在患肺腺癌的概率；i级反应孔呈阴性，表明检测过程存在问题，重新采样再进行检测。
36.第三方面，本发明提供了第一方面所述的肺腺癌早期筛查的系统在制备肺腺癌早期筛查装置中的应用。
37.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：（1）本发明选取痰液作为检测样本，实现了肺腺癌的极早期诊断，且取材对检测者几乎无危害，并可以持续监测，克服了ldct无法在极早期精准检出且有致癌风险的弊端；（2）采用异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法进行rna的提取，可以从非常少的细胞中提取rna，且用时较短；（3）检测前对目的片段进行反转录，可以富集待测物，用rna酶水解原始rna模板可以纯化待测基因，获得的待测物纯度高，检测特异性好；（4）检测在微流控芯片中进行，仅需两步离心即可实现多基因的同时检测，省时省力；还对正常基因片段进行了同步检测，可以排除操作失误，提高检测的准确性；（5）通过分子信标的杂交链式反应进行检测，一个目标片段即可激发链式反应，产生荧光信号并放大，检测灵敏度高；检测时间短，操作简单，成本低，易于推广。
附图说明
38.图1为微流控芯片的结构示意图，图中，1
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加样孔，2
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微阀，3
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i级反应孔，4
‑
ii级反应孔。
具体实施方式
39.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
40.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
41.材料：待测样本来自离体样本；细胞裂解液为自行配置，含有4 m异硫氰酸胍、25 mm柠檬酸钠（ph7.0）、0.5%十二烷基肌氨酸钠、0.1 m β
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巯基乙醇和3 u/μl rnase
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free dnase，使用depc水配置；核酸纯化柱购自杭州新景生物试剂开发有限公司；buffer 1为自行配置，配置含有0.01 m乙二胺四乙酸和0.1 m三羟甲基氨基甲烷的溶液，再加入体积分数为60%的无水乙醇；buffer 2为自行配置，配置含有2 m乙酸铵和0.1 m三羟甲基氨基甲烷的溶液，再加入体积分数为70%的无水乙醇；转录酶、ntps、缓冲液和rna酶a购自菲鹏生物股份有限公司；rna酶抑制剂购自赛默飞中国。
42.实施例1本实施例提供一种肺腺癌早期筛查的系统，所述肺腺癌早期筛查的系统包括：样本采集模块：采集晨起肺深部组织的痰液样本，使用naoh溶液对其进行液化，离心收集细胞，使用生理盐水洗涤后，在4℃下保存；核酸提取模块：通过异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸，并使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化；目标片段提取模块：通过反转录进行目标基因的提取，并使用rna酶水解原始rna模板，所述目标基因包括egfr的2种常见突变：19外显子del l746~a750缺失和19外显子del l747~p753插入缺失；检测模块：使用含有分子信标的微流控芯片对反转录产物进行检测；所述微流控芯片的结构示意图如图1所示，包括加样孔1、连接加样孔1与反应孔的微阀2以及反应孔，所述反应孔组成辐射状同心圆结构，所述反应孔中含有分子信标；所述反应孔包括i级反应孔3和ii级反应孔4；所述i级反应孔3中含有与正常序列响应的分子信标，所述ii级反应孔4中含有与突变序列响应的分子信标；所述分子信标的序列如seq id no.1~6所示。
43.seq id no.1：gcttctcttaattccttgatagcgcaaagtcgctatcaaggaattaag；
seqidno.2：cgctatcaaggaattaagagaagccttaattccttgatagcgactttg；seqidno.3：gcttctgatgttttgatagcgacgcaaagtcgtcgctatcaaaacatc；seqidno.4：cgtcgctatcaaaacatctccgaagatgttttgatagcgacgactttg；seqidno.5：gcttcttggcttattccttgatagcaaagtctatcaaggaataagcca；seqidno.6：ctatcaaggaataagccaacaaggtggcttattccttgatagactttg。
44.其中，seqidno.1~2为i级反应孔3的ha和hb，2种检测可以共用；seqidno.3~4为ii级反应孔4的ha和hb，用来检测19外显子dell746~a750缺失；seqidno.5~6为ii级反应孔4的ha和hb，用来检测19外显子dell747~p753插入缺失。
45.所述检测模块将反转录产物加入加样孔1中，通过离心使反转录产物经由微阀2流入反应孔中，进行检测反应。
46.实施例2本实施例使用实施例1制备的肺腺癌早期筛查的系统，对待测样本进行检测，步骤如下：（1）采集晨起肺深部组织的痰液样本，液化后离心收集细胞并洗涤保存：在50ml的痰液收集管中加入40ml1m的naoh溶液，志愿者晨起漱口后，咳深部痰7~8口（约5~10ml）至收集管中，反复振摇收集管直到痰液中无粘稠痰块且呈均匀的液相，在4℃下2500g离心15min，弃上清，沉淀用生理盐水洗2遍，以0.2ml生理盐水重悬。
47.（2）通过异硫氰酸胍
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硅胶膜纯化的方法提取样本中的核酸，并使用不含rna酶的dna酶对所述核酸进行消化：向上步所得的0.2ml样品中加入0.4ml的细胞裂解液，轻微吹打，室温放置10min；向裂解产物中加入1ml乙醇，将样本混合液转移至核酸纯化柱（主要成分为二氧化硅和聚丙烯）中，13000rpm离心30s，弃去滤液；核酸纯化柱经buffer1和buffer2洗涤后，用无rna酶的水洗脱。
48.（3）通过反转录进行目标基因的提取，并使用rna酶水解原始rna模板：反转录使用的引物序列如seqidno.7所示。
49.seqidno.7：ggactctggatcccagaa。
50.反转录体系如下：组分体积（μl）缓冲液2dntps1引物1转录酶1rna模板4rna酶抑制剂1depc水10总体积20反转录程序如下：
70℃，10 min；45℃，20min；70℃，5min。
51.将反转录产物置于冰上，加入2 μl rnase a水解原始rna模板，37℃消化5 min，使用nano drop检测od260/280为1.78，符合要求，进行后续的检测。
52.（4）将反转录产物加入微流控芯片的加样孔1中，通过离心使反转录产物经由微阀2流入反应孔中，进行检测反应，并判断检测结果：将反转录纯化后的dna片段稀释至100 μl后，加入微流控芯片中间的样本孔，一个芯片中只加入一个样本；将微流控芯片以加样孔1为中心，10000 g高速离心5 min，样本进入i级反应孔3和ii级反应孔4的微阀2前；静置30 min后，用荧光探测仪检测i级反应孔3；将微流控芯片以加样孔1为中心，60000 g超高速离心10 min，样本进入ii级反应孔4；静置30 min后，用荧光探测仪检测ii级反应孔4，根据如下标准判断：在i级反应孔3呈阳性的前提下，ii级反应孔4为阴性，则代表相关基因未发生突变，患肺腺癌的概率较小；在i级反应孔3呈阳性的前提下，ii级反应孔4为阳性，则代表相关基因发生了突变，存在患肺腺癌的概率；i级反应孔3呈阴性，表明检测过程存在问题，重新采样再进行检测。
53.上述样本的650 nm下荧光光谱检测结果如表1所示。
54.表1由表1可以看出，i级反应孔3均为阳性，证明反应体系正常，样本采集、核酸提取及目标基因提取的过程均正常，可进行后续检测；ii级反应孔4中，检测19外显子del l747~p753插入缺失的反应孔呈阳性，检测19外显子del l746~a750缺失的反应孔呈阴性，证明该样本发生的突变是19外显子del l747~p753插入缺失。
55.综上所述，本发明提供了一种肺腺癌早期筛查的系统，所述肺腺癌早期筛查的系统设计科学合理，操作简便，配合相应的使用方法，可以对样本进行肺腺癌的极早期诊断，灵敏度高，特异性好，检测结果准确，检测成本低，用时较短，具有极高的应用价值。
56.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。