一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪及其测序方法

1.本发明涉及基因测序技术领域，特别是涉及一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪及其测序方法。


背景技术：

2.目前，固态纳米孔测序技术已经广泛应用在基因测序上，该固态纳米孔测序技术使待测dna链通过纳米孔芯片的纳米孔，纳米孔采集待测dna上的碱基信号从而实现dna测序。
3.同时，固态纳米孔测序技术也存在着诸多挑战。主要有：一、时间分辨率，在电场的作用下，dna过孔速度太快难以采集足够的有效数据点；二、空间分辨率，相邻碱基距离仅为0.34nm，要实现单碱基分辨率纳米孔厚度必需小于0.34nm，并且需要确保仅有单条dna链通过纳米孔，防止其他dna链对碱基数据信息采集的干扰，与此同时，需要帮助单条dna链在其链长范围内找到纳米孔位置，使dna链能够顺利穿过纳米孔，实现碱基信号采集。
4.目前现有通过施加外部控制的方式来控制dna的过孔速度的方式有使用光镊、磁镊等系统。但是这些方式均存在一定的问题：光镊系统需要依赖复杂的光学系统，且一次只能控制单个dna分子，不能实现并行检测；利用磁镊难以避免音叉震动对检测信号产生的严重干扰。若通过改变dna过孔时的实验条件来减缓过孔速度；例如温度、电解质粘度、驱动电压、离子浓度以及纳米孔表面电荷密度等就会带来其它一些问题。若增加离子浓度会使噪声显著增加或检测信号的幅值变小；若向溶液中添加甘油来增加溶液的浓度的方法，在减缓dna分子运动的同时也减缓了离子的运动，这也会使得阻断电流的信号变小；在对纳米孔进行修饰的方法中，dna与纳米孔的强相互作用会导致纳米孔的堵塞。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于避免现有技术中的不足之处而提供一种基于核酸纳米核酸水解酶的纳米孔测序仪，该纳米孔测序仪能有效地减慢相邻碱基的测序时间，具有测序精度高和便于操作的优点。
6.本发明的目的之一通过以下技术方案实现：
7.提供一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪，包括电源、液池、放置在所述液池内的基板，所述基板上开设有凹槽，所述凹槽的底部钻有贯穿所述基板的通孔，所述凹槽的底部面积大于所述通孔的孔径，所述凹槽的开口覆盖有纳米孔芯片，所述纳米孔芯片的纳米孔位于所述凹槽的槽口上，所述基板背向所述凹槽的一侧设有电磁铁，所述电磁铁靠近所述通孔，所述凹槽内放置有带磁性的纳米核酸水解酶，所述纳米核酸水解酶被所述电磁铁吸引而固定在所述凹槽的底部，所述电源的负极插入或靠近所述通孔，所述电源的正极靠近所述纳米孔。
8.上述纳米孔测序仪的原理：在电场力作用下，池液中的待测dna受通孔限制，只有待测dna单链从通孔进入到凹槽并被凹槽内的纳米核酸水解酶剪切，切下的碱基按序通过
下方的纳米孔，实现dna测序，其中切下的碱基能滞留在纳米核酸水解酶内，有效避免了相邻碱基的干扰，大大提高测序的精确度；由于剪切碱基与测试碱基分开操作，纳米孔能精确地检测单个碱基，不受相邻碱基信号干扰，提高了检测的精确度；且由于通孔的限定作用以及电场力的驱动作用，无需其他设备即可保证dna单链过孔，不但减少其他dna单链的影响，还简化了测序操作，提高了测序的效率。
9.电场力驱动单根dna通过凹槽较小侧的孔，该dna单链与纳米核酸水解酶反应，剪切出的单个碱基在电场力作用下依次通过纳米孔芯片，此时第一次检测到信号表示孔内存在dna单链；一段时间后，在较短时间间隔内检测到许多不同且更弱的信号，此时的信号可以反映dna单链的序列。
10.在一些实施方式中，所述纳米孔芯片是石墨烯纳米孔芯片或二硫化钼纳米孔芯片。
11.在一些实施方式中，所述基板包括硅层和沉积在所述硅层两侧面上的氮化硅层。
12.在一些实施方式中，所述纳米核酸水解酶是fe4o3/sio2@aunp。
13.在一些实施方式中，所述纳米核酸水解酶的粒径是100nm～500nm。
14.在一些实施方式中，所述通孔的孔径是5nm～20nm。
15.在一些实施方式中，所述纳米孔的孔径是1nm～5nm。
16.在一些实施方式中，带磁性的纳米核酸水解酶通过以下方式放置到所述凹槽内：将基板平方，使凹槽的开口朝上，凹槽的开口上方连通有水平走向的流道，通孔的外端朝向电磁铁；往流道注入纳米核酸水解酶溶液，使纳米核酸水解酶溶液在流道内以一定的流速流动，在电磁铁的吸引力下，纳米核酸水解酶溶液中的单个纳米核酸水解酶掉入所述凹槽内。由于凹槽的槽口较小，只有在电磁铁的作用下，才能确保纳米核酸水解酶能有效地落入到凹槽内，该方式能有效地保证了纳米核酸水解酶落入到凹槽内。
17.在一些实施方式中，所述凹槽的底部向内收窄以形成卡位。
18.本发明的一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪的有益效果：
19.(1)本发明通过调整了凹槽与通孔的位置，池液中的待测dna在通孔的限制下，只有待测dna单链从通孔进入到凹槽并被凹槽内的纳米核酸水解酶剪切，无需其他设备即可保证dna单链过孔，不但减少其他dna单链的影响，还简化了测序操作，提高了测序的效率。
20.(2)本发明采用了带磁性的纳米核酸水解酶和电磁铁，在电磁铁的吸引下，纳米核酸水解酶能挂设起来并能贴着通孔的开口，便于保持纳米核酸水解酶的剪切效果。
21.(3)本发明的测序仪使切下的碱基能滞留在纳米核酸水解酶内，有效避免了相邻碱基的干扰，大大提高测序的精确度；由于剪切碱基与测试碱基分开操作，纳米孔能精确地检测单个碱基，不受相邻碱基信号干扰，提高了检测的精确度。
22.本发明的目的之二通过以下技术方案实现：
23.提供一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪的测序方法，采用上述的基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪，其测序方法包括以下步骤，
24.s1、将基板平放在液池内，使凹槽上的纳米孔芯片朝下，使通孔朝上，电磁铁吸引凹槽内的纳米核酸水解酶以使纳米核酸水解酶贴住凹槽的底部；将待测dna注入液池内；
25.s2、开启电源，在电场力下，池液中的待测dna单链从通孔进入凹槽，凹槽内的纳米核酸水解酶从待测dna单链的开始端按序剪切进入的待测dna单链，切下的碱基按序通过纳
米孔芯片的纳米孔，实现dna测序。
26.本发明的一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪的测序方法有益效果：
27.本发明的测序方法通过开启电源，即可实现测序，无需其他捕获待测dna单链的操作，容易操作，具有效率高的优点。
附图说明
28.利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
29.图1是本发明的一种基于纳米核酸酶的纳米孔测序仪的工作状态示意图。
30.图2是本发明的纳米核酸水解酶放置到凹槽中的工作状态示意图。
31.附图标记：
32.电源1；液池2；基板3；凹槽4；通孔5；纳米孔芯片6；槽口7；电磁铁8；纳米核酸水解酶9；负极10；正极11；流道12；卡位13；待测dna单链14；碱基15；纳米孔16
具体实施方式
33.结合以下实施例和附图对本发明作进一步描述。
34.实施例
35.本实施例公开的一种基于纳米核酸酶的纳米孔16测序仪，图1-图2所示，包括电源1、液池2、放置在所述液池2内的基板3，所述基板3上开设有凹槽4，所述凹槽4的底部钻有贯穿所述基板3的通孔5，所述凹槽4的底部面积大于所述通孔5的孔径，所述凹槽4的开口覆盖有纳米孔芯片6，所述纳米孔芯片6的纳米孔16位于所述凹槽4的槽口7上，所述基板3背向所述凹槽4的一侧设有电磁铁8，所述电磁铁8靠近所述通孔5，所述凹槽4内放置有带磁性的纳米核酸水解酶9，所述纳米核酸水解酶9被所述电磁铁8吸引而固定在所述凹槽4的底部，所述电源1的负极10插入或靠近所述通孔5，所述电源1的正极11靠近所述纳米孔16。使用时，在电磁铁8的吸引下，纳米核酸水解酶9被吸住并贴着凹槽4的槽底，电源1产生电场力，使得待测dna单链14进入通孔5，然后被纳米核酸水解酶9剪切，接着从纳米孔16释放出来，纳米孔同时采集了碱基15的信息。
36.本实施例中，所述纳米孔芯片6是石墨烯纳米孔芯片6或二硫化钼纳米孔芯片6。
37.本实施例中，所述基板3包括硅层和沉积在所述硅层两侧面上的氮化硅层。
38.本实施例中，所述纳米核酸水解酶9是核酸酶fe4o3/sio2@aunp，fe4o3/sio2@aunp的稳定性较好，并且容易获得，且能与电磁铁8产生较好的磁吸作用。
39.本实施例中，所述纳米核酸水解酶9的粒径是100nm～500nm。这样尺寸的纳米核酸水解酶有效保持了核酸酶量。
40.本实施例中，所述通孔5的孔径是5nm～20nm。本实施例中，所述纳米孔16的孔径是1nm～5nm。
41.本实施例中，所述纳米核酸水解酶9通过以下方式放置到所述凹槽4内：将基板3平方，使凹槽4的开口朝上，凹槽4的开口上方连通有流道12，通孔5的外端朝向电磁铁8；往流道12注入纳米核酸水解酶9溶液，使纳米核酸水解酶9溶液在流道12内以一定的流速流动，
在电磁铁8的吸引力下，纳米核酸水解酶9溶液中的单个纳米核酸水解酶9掉入所述凹槽4内。由于凹槽4的槽口7较小，只有在电磁铁8的作用下，才能确保纳米核酸水解酶9能有效地落入到凹槽4内，且只有在溶液流动，才能使纳米核酸水解酶9流经凹槽4的槽口7，进而落入到凹槽4内。
42.本实施例中，所述凹槽4的底部向内收窄以形成卡位13。该卡位13能有效地辅助定位纳米核酸水解酶9。
43.上述一种基于纳米核酸酶的纳米孔16测序仪的测序方法，其特征在于：其测序方法包括以下步骤，
44.s1、将基板3平放在液池2内，使凹槽4上的纳米孔芯片6朝下，通孔5朝上，电磁铁8吸引凹槽4内的纳米核酸水解酶9以使纳米核酸水解酶9贴住凹槽4的底部，将待测dna注入液池2内；
45.s2、开启电源1，在电场力下，池液中的待测dna单链14从通孔5进入凹槽4，凹槽4内的纳米核酸水解酶9按序剪切进入的待测dna单链14，切下的碱基15按序通过纳米孔芯片6的纳米孔16，实现dna测序。
46.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。