一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株，并进一步公开其发酵产他克莫司的应用。


背景技术：

2.大环内酯类免疫抑制剂是一类具有经体内外研究证明具有显著的免疫抑制作用的大环内酯结构的免疫抑制剂，可被用于治疗器官移植的排异反应和自身免疫相关性疾病等，其代表物质为他克莫司(tacrolimus，fk506)、子囊霉素及其衍生物以及西罗莫司等。他克莫司是从streptomyces tsukubaensis的发酵液中提取得到的一种含哌可酰基的23元大环内酯类化合物，具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，在器官移植和自身免疫系统疾病方面疗效显著。目前，他克莫司不仅是肝脏及肾脏移植后排斥反应的一线药物，还广泛应用于斑秃、牛皮癣、银屑病、类风湿性关节炎及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗,具有广阔的应用前景。他克莫司自从1984年首次发现以来，国内外已对其进行了大量的基础及临床研究。1998年他克莫司进入中国市场后，虽然市场份额迅速上升，但是当前进口原研药仍然占据80％左右的市场。
3.目前，国内微生物发酵法生产他克莫司的技术瓶颈主要是产率低、发酵水平较差或发酵周期较长。如中国专利cn107090477a公开的提高他克莫司产量的发酵方法，其通过在常规的他克莫司发酵过程中加入吸附树脂以及流加补充糊精，发酵170h后他克莫司含量可达1248mg/l，该工艺虽发酵水平较高，但发酵周期却较长，也导致生产成本仍然较高。又如中国专利cn105624068a公开的筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用，主要是一种由筑波链霉菌hdw68发酵制备他克莫司中间体的方法，该发明提供的发酵工艺经1
‑
20吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力可达1100mg/l，但发酵周期却依然维持在6
‑
7天，仍然存在发酵周期较长且培养基较为复杂的问题。又如中国专利cn105176904a公开的基因工程菌株筑波链霉菌l21及其应用，其通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，将他克莫司的发酵单位提高至945mg/l，但基因工程菌株的稳定性有待进一步验证，该发明未详细给出进一步说明。再如中国专利cn109735467a公开的高产他克莫司的链霉菌诱变菌株及其应用，该发明提供的菌株streptomyces tsukubaensis fim
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07
‑
23在1吨发酵罐发酵132h，其发酵产他克莫司能力可达1522mg/l，虽然一定程度上提高了他克莫司的发酵水平，但仍期待更优的发酵能力。
4.基于常压室温等离子体育种技术(artp)是一种微生物基因组快速突变技术，其产生的等离子体富含各种化学活性粒子，对菌株细胞产生遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白质结构的改变等多重作用，细胞启动sos修复机制，在修复过程中产生种类丰富的错配位点，突变率高；且微生物的抗性基因与产物合成基因呈紧密连锁分布，并可通过诱导表达，在很大程度上克服了诱变随机筛选的盲目性和不定向性，具有广谱性、正突变率和增产率高等特点。因此，通过采用artp诱变结合抗自身产物的抗性突变有望选择性提高菌株
产物产量的阳性突变率，从而筛选到符合工业化生产他克莫司的高效菌株。


技术实现要素：

5.为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵产他克莫司的筑波链霉菌株，以解决现有技术中他克莫司的发酵菌株性能不够理想的问题；
6.本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述筑波链霉菌株发酵生产他克莫司的应用。
7.为解决上述技术问题，本发明所述的一种筑波链霉菌株，其分类命名为streptomyces tsukubaensisfim
‑
z
‑
a36，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院院实验大楼5楼，保藏编号为gdmcc no.61806，保藏日期为2021年07月14日。
8.本发明还公开了所述筑波链霉菌株在发酵生产他克莫司中的应用。
9.本发明还公开了一种发酵生产他克莫司的方法，包括将所述筑波链霉菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
10.具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉4.5
‑
5.5wt％、豆粕粉2.5
‑
4.0t％、葡萄糖2.5
‑
5.5wt％、蛋白胨0.6
‑
1.0wt％、碳酸钙0.2
‑
0.5wt％、余量为水，ph7.0
‑
7.8。
11.优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉5wt％、豆粕粉3.5wt％、葡萄糖3.0wt％、蛋白胨0.8wt％、碳酸钙0.3wt％、余量为蒸馏水/纯化水，ph7.0
‑
7.8。
12.具体的，所述发酵培养步骤的条件包括：控制转速80
‑
280rpm，于26
‑
30℃进行发酵培养96
‑
144h。
13.具体的，所述发酵生产他克莫司的方法，还包括将所述筑波链霉菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤；
14.所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0
‑
2.5wt％、豆粕粉1.0
‑
2.0wt％、葡萄糖1.5
‑
2.0wt％、蛋白胨0.3
‑
0.5wt％、碳酸钙0.2
‑
0.5wt％、余量为水，ph7.0
‑
7.8。
15.优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0wt％、豆粕粉1.5wt％、葡萄糖1.5wt％、蛋白胨0.3wt％、碳酸钙0.3wt％、余量为纯化水，ph7.0
‑
7.8。
16.具体的，所述种子液培养步骤的条件包括：控制转速00
‑
280rpm，优选100
‑
250rpm，于26
‑
30℃进行种子液培养20
‑
45h。
17.具体的，所述发酵生产他克莫司的方法，还包括将所述筑波链霉菌株接种于斜面培养基中进行活化的步骤；
18.所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0
‑
3.0wt％、k2hpo4.3h2o 0.02
‑
0.08wt％、mgso4.7h2o 0.02
‑
0.08wt％、nacl 0.02
‑
0.08wt％、kno
3 0.05
‑
0.15wt％、feso4.7h2o 0.01
‑
0.03wt％、琼脂1.8
‑
2.0wt％、余量为水，ph7.0
‑
7.8。
19.优选的，所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0wt％、k2hpo4.3h2o 0.05wt％、mgso4.7h2o 0.05wt％、nacl 0.05wt％、kno
3 0.1wt％、feso4.7h2o 0.02％、琼脂2.0％、余量为纯化水，ph7.0
‑
7.8。
20.具体的，所述斜面培养基活化步骤的条件包括：于26
‑
30℃进行恒温培养7
‑
10d。
21.本发明通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产他克莫司的筑波链霉菌fim
‑
z
‑
a36(streptomyces tsukubaensis)，其能够发酵高产他克莫司，在1t罐发酵实验中，所述筑波链霉菌fim
‑
z
‑
a36发酵产他克莫司的效价高达3138μg/ml，且发酵周期仅为128h，大幅度提高了他克莫司的产量并缩短了他克莫司的发酵周期，更加适宜于工业化发酵生产。而且，本发明筛选的菌株fim
‑
z
‑
a36稳定性良好，连续传代六代其产他克莫司效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
附图说明
22.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
23.图1为诱变实验中artp射流时间与致死率的关系曲线；
24.图2本发明所述菌株fim
‑
z
‑
a36的进化树。
具体实施方式
25.本发明下述实施例中，涉及的培养基包括：
26.分离平板培养基及斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％、k2hpo4.3h2o 0.05％、mgso4.7h2o 0.05％、nacl 0.05％、kno
3 0.1％、feso4.7h2o 0.02％、琼脂2.0％、余量为纯化水，ph7.0
‑
7.8，121℃高压蒸汽灭菌30min；
27.种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％、豆粕粉1.5％、葡萄糖1.5％、蛋白胨0.3％、碳酸钙0.3％、余量为纯化水，ph7.0
‑
7.8，121℃高压蒸汽灭菌30min；
28.发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉5％、豆粕粉3.5％、葡萄糖3.0％、蛋白胨0.8％、碳酸钙0.3％、余量为蒸馏水，ph7.0
‑
7.8，121℃高压蒸汽灭菌30min。
29.本发明下述实施例中，所述他克莫司含量的检测采用高效液相色谱法，其方法：取2ml发酵液离心，用等体积的甲醇萃取2次，合并上清液和萃取液，过有机滤膜后获发酵初提液，取10μl进行hplc检测。色谱条件：kromasil c18(4.6mm
×
250mm,5μm)色谱柱，检测波长277nm，流动相为甲醇：乙腈：水＝70：15：30体积比的甲醇、乙腈和水的混合溶液，流速1.0ml/min，柱温40℃。以他克莫司标准品为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积
×
标准液浓度
×
稀释倍数计算效价，发酵效价取3次平均值。
30.实施例1诱变菌株fim
‑
z
‑
a36的获得
31.以保存的遗传性状相对稳定的筑波链霉菌fim
‑
07
‑
23行自然分纯得fim
‑
07
‑
23单菌落，并转接至斜面培养基上，于恒温培养箱中培养10天，且培养温度为28℃；之后用生理盐水洗下斜面培养基上的孢子，玻璃珠打散，经纱布过滤，制成106个/ml的孢子悬液。
32.用移液枪吸取10μl得到的孢子悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110w、工作气流量10l/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理5s、10s、15s、30s、45s、60s、75s、90s，将处理后的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图1所示)。从图1中可以看出，诱变处理剂量与菌株fim
‑
07
‑
23菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高；
33.根据上述致死率曲线，选择10s、30s、75s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株
fim
‑
07
‑
23的孢子悬液进行等离子体诱变；并将前述三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀，得诱变孢子悬液，备用。
34.将上述所得孢子悬液分别涂布于含他克莫司的平板培养基中，其中，平板培养基中他克莫司浓度分别为2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l；于28℃培养10天后，观察不同平板上的菌落生长情况，结果如下表1所示，未长出菌落的平板培养基中对应他克莫司最低作用浓度为抗自身代谢产物他克莫司最小抑菌浓度，则由表1确定抗他克莫司最小抑菌浓度为4g/l。
35.表1他克莫司浓度对菌株fim
‑
07
‑
23孢子生长的影响
36.他克莫司(μg/ml)200025003000350040004500菌落生长情况++++++
‑‑‑
37.注:+有菌落生长,
‑
无菌落生长。
38.将上述所得诱变孢子悬液进行梯度稀释，稀释度分别为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6，选取10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于含自身代谢产物他克莫司4g/l的抗性分离平板上，于28℃避光培养10d。
39.将各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面培养基中培养10天后，以1％的接种量接种于种子培养基中，于28℃、230r/min条件下培养24h后得种子液；以5％的接种量将种子液接种于发酵培养基中，并于28℃、230r/min条件下培养4
‑
7d，得发酵液。
40.取所得发酵液适量，加入等体积的乙醇萃取2次，合并上清液和萃取液，过有机滤膜后获发酵初提液，利用高效液相色谱法测定他克莫司的产量，并确定本实施例发酵液中产物的结构正确。
41.通过此方法即筛选出产他克莫司量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株fim
‑
z
‑
a36，且菌株fim
‑
z
‑
a36于甘油中保存。
42.实施例2菌株fim
‑
z
‑
a36的鉴定
43.生理生化特性鉴定
44.将获得的菌株fim
‑
z
‑
a36在分离培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，28℃培养7
‑
20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。
45.得到该菌株fim
‑
z
‑
a36的主要形态及生理生化特性如下：成熟孢子链有5
‑
10个孢子，孢子形状呈椭圆形状，(0.4
‑
0.6)
×
(0.6
‑
0.7)μm。在平板上菌落圆形，菌落培养10d直径约5
‑
6mm，表面光滑，白色或浅灰色至灰色，在isp4培养基生长丰茂，气生菌丝灰白色,基内菌丝贫乏。随着培养时间的延长，菌落由白色或浅灰变成灰白色或灰色；可利用糊精、葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖、山梨醇，不利用蔗糖、乳糖、棉籽糖；在明胶培养基上能使明胶液化，胨化牛奶；不利用纤维素；硝酸盐还原阴性；此菌株为高耗氧菌，最适生长温度为25
‑
30℃，最适生长ph为6.5
‑
8.5；在摇床转速为200
‑
250r/min，培养4
‑
7d时，他克莫司产量最高，发酵过程中溶氧对他克莫司的产生具有显著作用。
46.分子生物学鉴定
47.对菌株fim
‑
z
‑
a36的16srdna序列进行测序，并将所测的菌株的16srdna序列与genbank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16s rrna基因序列，系统进化分析用clustal
‑
x软件进行比对，生成的比对文件用treecon软件邻接法进行系统进化分析，拓扑
分析为1000次重复取样的结果；通过16srdna序列分析表明，菌株fim
‑
z
‑
a36与筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)的序列同源性为100％。
48.综合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株fim
‑
z
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a36为筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)菌属，其分类命名为筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)fim
‑
z
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a36，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院院实验大楼5楼，保藏编号为gdmcc no.61806，保藏日期为2021年07月14日。
49.实施例3诱变菌株fim
‑
z
‑
a36的遗传稳定性验证
50.菌种传代：将上述筛选的高产他克莫司的菌株fim
‑
z
‑
a36转接至斜面培养基上，于28℃恒温培养10d，获得生长良好的fim
‑
z
‑
a36原代斜面(f0)，并对该菌株连续培养传代，于28℃恒温培养10d，分别获得生长良好的f1、f2、f3、f4、f5、f6斜面。
51.制备fim
‑
z
‑
a36种子液：将上述菌株fim
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z
‑
a36所得的新鲜菌苔用生理盐水洗下制备孢子悬液，按0.5％接种量接种于种子培养基(500ml三角瓶内装70ml种子培养基)中，于28℃、200r/min条件下培养24h，得fim
‑
z
‑
a36种子液。
52.发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500ml三角瓶内装100ml发酵培养基)中，于28℃、230r/min条件下发酵培养144h，之后将所得发酵液进行检测。
53.以生长良好的原代菌株(f0)为对照，其发酵相对效价为100％，结果如表2所示。
54.表2传代对菌株fim
‑
z
‑
a36产他克莫司的影响
55.菌株代数f1f2f3f4f5f6相对效价(％)101.6100.899.398.798.295.6
56.由表2可知，本发明筛选的菌株fim
‑
z
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a36传六代发酵水平无明显影响，其产他克莫司效价基本稳定，维持在同一较高水平，从而表明菌株fim
‑
z
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a36具有较好的遗传稳定特性。
57.实施例4诱变菌株fim
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a36发酵生产他克莫司
58.摇瓶种子培养：将上述菌株fim
‑
z
‑
a36新鲜菌苔用生理盐水洗下制备孢子悬液，按0.5％接种量接种于种子培养基(1000ml三角瓶内装200ml种子培养基)中，于28℃、200r/min条件下培养24h，得摇瓶种子液。
59.种子罐种子培养：将摇瓶种子液按0.5％量接种于种子培养基(100l罐内装60l种子培养基)中，于培养温度28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：1vvm、搅拌速度为100
‑
200r/min条件下培养36h，得种子罐种子液。
60.发酵罐发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(1吨罐内装700l发酵培养基)中，于培养温度26
‑
28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：0.8
‑
1.5vvm、搅拌速度为80
‑
200r/min，过程控制溶氧不低于30％，发酵培养128h，放罐将所得发酵液进行检测。
61.检测结果显示，本实施例中他克莫司产量为3115μg/ml，进一步测定其发酵液中，他克莫司纯度为91.6％，主杂子囊霉素、二氢他克含量分别为0.83％、0.91％。证明了本发明筛选菌株不仅可以高效发酵他克莫司，且发酵液中他克莫司纯度优，主杂含量低，利于他克莫司的下游提纯。
62.实施例5诱变菌株fim
‑
z
‑
a36发酵生产他克莫司
63.摇瓶种子培养：将上述菌株fim
‑
z
‑
a36新鲜菌苔用生理盐水洗下制备孢子悬液，按0.5％接种量接种于种子培养基(1000ml三角瓶内装200ml种子培养基)中，于28℃、200r/min条件下培养24h，得摇瓶种子液。
64.种子罐种子培养：将摇瓶种子液按0.5％量接种于种子培养基(100l罐内装60l种子培养基)中，于培养温度28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：1vvm、搅拌速度为100
‑
250r/min条件下培养36h，得种子罐种子液。
65.发酵罐发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(1吨罐内装700l发酵培养基)中，于培养温度26
‑
28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：0.8
‑
1.5vvm、搅拌速度为80
‑
250r/min，过程控制溶氧不低于30％，发酵培养128h，放罐将所得发酵液进行检测。
66.检测结果显示，本实施例中他克莫司产量为3109μg/ml；进一步测定其发酵液中，他克莫司纯度为90.8％，主杂子囊霉素、二氢他克含量分别为0.92％、0.98％。进一步证明，本发明筛选菌株不仅可以高效发酵他克莫司，且发酵液中他克莫司纯度优，主杂含量低，有利于他克莫司的下游提纯。
67.实施例6诱变菌株fim
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z
‑
a36发酵生产他克莫司
68.摇瓶种子培养：将上述菌株fim
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z
‑
a36新鲜菌苔用生理盐水洗下制备孢子悬液，按0.5％接种量接种于种子培养基(1000ml三角瓶内装200ml种子培养基)中，于28℃、200r/min条件下培养24h，得摇瓶种子液。
69.种子罐种子培养：将摇瓶种子液按0.5％量接种于种子培养基(100l罐内装60l种子培养基)中，于培养温度28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：1vvm、搅拌速度为100
‑
230r/min条件下培养36h，得种子罐种子液。
70.发酵罐发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(1吨罐内装700l发酵培养基)中，于培养温度28℃、罐压0.05mpa、空气流量1：0.8
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1.5vvm、搅拌速度为80
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220r/min，过程控制溶氧不低于30％，发酵培养128h，放罐将所得发酵液进行检测。
71.检测结果显示，本实施例中他克莫司产量为3138μg/ml；进一步测定其发酵液中，他克莫司纯度为92.3％，主杂子囊霉素、二氢他克含量分别为0.70％、0.79％。进一步证明，本发明筛选菌株不仅可以高效发酵他克莫司，且发酵液中他克莫司纯度优，主杂含量低，更利于他克莫司的下游提纯。
72.综上，本发明诱变菌种fim
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z
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a36在1吨罐发酵产他克莫司最高可达3138μg/ml，发酵周期仅为128h，且发酵液中他克莫司纯度不低于90％，可有效控制主要杂质含量，有利于他克莫司的下游提纯。可见，本发明筛选的突变菌株筑波链霉菌fim
‑
z
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a36(streptomyces tsukubaensis)能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
73.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。