基于全基因组重测序和KASP技术开发的烟草SNP标记及其应用的制作方法

基于全基因组重测序和kasp技术开发的烟草snp标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于全基因组重测序和kasp技术开发的烟草snp标记及其应用。


背景技术：

2.未来我国乃至世界将面临全球气候变化、土地资源短缺、生态环境污染、人口数量激增等诸多问题，给生物育种带来一系列挑战，亟需通过科技创新，将传统育种技术与现代分子生物技术、信息技术结合，革新育种方法，以满足未来发展对生物优良品种的需求。
3.当前随着测序技术的发展，主要生物物种的参考基因组不断公布，各物种的全基因组重测序、简化基因组测序、转录组测序等基于测序技术开展的研究项目不断取得突破。这些技术的突破反馈到生物育种领域，使得当前生物育种技术正在逐渐摆脱过去依赖观察田间表型变异，借助统计学、遗传学等知识技术，费时费力且效率低下的阶段。借助各类高通量测序和芯片平台的发展，分子标记辅助选择育种技术在作物育种中逐步应用起来，并自上世纪80年代以来，基于dna(脱氧核糖核酸)分子标记在作物商业育种领域潜力被证实，现已在国内外多个育种公司、科研单位广泛采用。
4.根据技术发展水平，dna分子标记可划分为三代。第一代分子标记为基于southern杂交技术的rflp(限制性片段长度多态性)标记，第二代分子标记主要是基于pcr技术为核心发展出的rapd(随机扩增多态性)、ssr(微卫星标记)、aflp(扩增片段长度多态性)、scar(特征序列扩增区域)、sts(特定序列位点)、issr(内部序列重复)和caps(酶切扩增多态性序列)等标记，第三代分子标记主要是snp(单核苷酸多态性)。其中snp标记因数量多、在基因组中分布均匀，易于基因分型，适合规模化高通量检测等优点，在玉米、小麦、棉花、水稻、大豆、油菜等作物育种中已作为最主流的分子标记使用。
5.snp标记分析技术按照研究对象可分为snp标记开发和snp标记检测两类，其中snp标记开发主要是寻找未知snp和对未知snp进行分析，snp标记检测，是对不同材料的snp遗传多样性进行检测，进行基因分型。
6.烟草作为研究植物的模式生物之一，是植物分子研究领域的常用工具，同时作为经济作物对农业经济产生重大价值，鉴于其在科学研究和工业经济中的重要性，美国、日本、中国等多个国家都开展了大规模烟草全基因组测序工作，积累了海量烟草基因组测序数据，为烟草snp标记开发及育种利用奠定了良好基础。近年来，国内科研单位基于est(表达序列标签)、gbs(基因组简约法)、rad(限制性内切酶位点标签)、rnaseq(转录组测序)等手段开发了一些snp标记，但是这些标记在基因组覆盖度方面尚存在一些不足，同时这些标记都为数据分析的结果，缺乏试验验证，并且对所开发的snp标记，并没有提供检测技术支持，在实际应用中受到了诸多限制。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供基于全基因组重测序和kasp技术开发的烟草snp标记及其应用。
8.第一方面，本发明要求保护烟草基因组中如下240个snp位点中的全部或部分在如下任一中的应用：
9.(1)开发烟草snp位点检测试剂盒；此处所说的snp位点即为如下240个snp位点中的全部或部分；
10.(2)对烟草种质资源和/或遗传群体进行基因分型；
11.(3)构建烟草种质资源/品种dna指纹图谱；
12.(4)检测烟草品种纯度和/或真伪度。
13.所述240个snp位点的物理位置是基于烟草品种红花大金元的全基因组序列对比确定的，所述烟草品种红花大金元的全基因组序列的版本号为v1.2；所述240个snp位点是ts001-ts240；
14.ts001位于1号染色体上第8208363位，其脱氧核苷酸为t或c；
15.ts002位于1号染色体上第33067181位，其脱氧核苷酸为g或a；
16.ts003位于1号染色体上第57320321位，其脱氧核苷酸为g或a；
17.ts004位于1号染色体上第81583864位，其脱氧核苷酸为a或c；
18.ts005位于1号染色体上第106322334位，其脱氧核苷酸为g或a；
19.ts006位于1号染色体上第125569732位，其脱氧核苷酸为t或c；
20.ts007位于1号染色体上第146339969位，其脱氧核苷酸为a或g；
21.ts008位于1号染色体上第168939497位，其脱氧核苷酸为a或g；
22.ts009位于1号染色体上第192328872位，其脱氧核苷酸为a或g；
23.ts010位于1号染色体上第218318116位，其脱氧核苷酸为c或t；
24.ts011位于2号染色体上第450633位，其脱氧核苷酸为c或t；
25.ts012位于2号染色体上第27809195位，其脱氧核苷酸为a或t；
26.ts013位于2号染色体上第44225412位，其脱氧核苷酸为c或t；
27.ts014位于2号染色体上第62278727位，其脱氧核苷酸为c或t；
28.ts015位于2号染色体上第83667001位，其脱氧核苷酸为a或g；
29.ts016位于2号染色体上第113116215位，其脱氧核苷酸为g或a；
30.ts017位于2号染色体上第137528012位，其脱氧核苷酸为g或a；
31.ts018位于2号染色体上第169132158位，其脱氧核苷酸为t或c；
32.ts019位于2号染色体上第185483126位，其脱氧核苷酸为g或a；
33.ts020位于2号染色体上第208449625位，其脱氧核苷酸为c或t；
34.ts021位于3号染色体上第70093位，其脱氧核苷酸为t或c；
35.ts022位于3号染色体上第27066915位，其脱氧核苷酸为a或g；
36.ts023位于3号染色体上第54763744位，其脱氧核苷酸为g或a；
37.ts024位于3号染色体上第70866040位，其脱氧核苷酸为a或g；
38.ts025位于3号染色体上第91669016位，其脱氧核苷酸为c或t；
39.ts026位于3号染色体上第116024385位，其脱氧核苷酸为g或a；
40.ts027位于3号染色体上第136069307位，其脱氧核苷酸为t或g；
41.ts028位于3号染色体上第156967681位，其脱氧核苷酸为g或a；
42.ts029位于3号染色体上第173064283位，其脱氧核苷酸为a或g；
43.ts030位于3号染色体上第198017426位，其脱氧核苷酸为t或c；
44.ts031位于4号染色体上第3899155位，其脱氧核苷酸为g或a；
45.ts032位于4号染色体上第15517251位，其脱氧核苷酸为c或t；
46.ts033位于4号染色体上第26648428位，其脱氧核苷酸为c或g；
47.ts034位于4号染色体上第46186327位，其脱氧核苷酸为c或t；
48.ts035位于4号染色体上第63336872位，其脱氧核苷酸为c或g；
49.ts036位于4号染色体上第83168757位，其脱氧核苷酸为a或g；
50.ts037位于4号染色体上第94688224位，其脱氧核苷酸为c或t；
51.ts038位于4号染色体上第105682078位，其脱氧核苷酸为c或t；
52.ts039位于4号染色体上第124010732位，其脱氧核苷酸为c或g；
53.ts040位于4号染色体上第136418400位，其脱氧核苷酸为c或g；
54.ts041位于5号染色体上第818540位，其脱氧核苷酸为g或c；
55.ts042位于5号染色体上第13565159位，其脱氧核苷酸为g或t；
56.ts043位于5号染色体上第27317490位，其脱氧核苷酸为c或t；
57.ts044位于5号染色体上第42181447位，其脱氧核苷酸为g或a；
58.ts045位于5号染色体上第67747378位，其脱氧核苷酸为a或t；
59.ts046位于5号染色体上第80270025位，其脱氧核苷酸为g或t；
60.ts047位于5号染色体上第88119523位，其脱氧核苷酸为a或g；
61.ts048位于5号染色体上第98029128位，其脱氧核苷酸为t或a；
62.ts049位于5号染色体上第127826992位，其脱氧核苷酸为a或t；
63.ts050位于5号染色体上第133049305位，其脱氧核苷酸为a或t；
64.ts051位于6号染色体上第13578189位，其脱氧核苷酸为c或t；
65.ts052位于6号染色体上第25353358位，其脱氧核苷酸为g或a；
66.ts053位于6号染色体上第44245521位，其脱氧核苷酸为t或c；
67.ts054位于6号染色体上第58884603位，其脱氧核苷酸为g或a；
68.ts055位于6号染色体上第72393591位，其脱氧核苷酸为a或g；
69.ts056位于6号染色体上第84232195位，其脱氧核苷酸为c或t；
70.ts057位于6号染色体上第95593235位，其脱氧核苷酸为a或c；
71.ts058位于6号染色体上第115033653位，其脱氧核苷酸为t或a；
72.ts059位于6号染色体上第125125703位，其脱氧核苷酸为a或g；
73.ts060位于6号染色体上第141918758位，其脱氧核苷酸为c或t；
74.ts061位于7号染色体上第4141224位，其脱氧核苷酸为c或t；
75.ts062位于7号染色体上第14082999位，其脱氧核苷酸为c或a；
76.ts063位于7号染色体上第22079279位，其脱氧核苷酸为c或t；
77.ts064位于7号染色体上第36706020位，其脱氧核苷酸为g或t；
78.ts065位于7号染色体上第51446290位，其脱氧核苷酸为t或c；
79.ts066位于7号染色体上第64707494位，其脱氧核苷酸为t或a；
80.ts067位于7号染色体上第79594403位，其脱氧核苷酸为g或a；
81.ts068位于7号染色体上第100880287位，其脱氧核苷酸为c或g；
82.ts069位于7号染色体上第116533979位，其脱氧核苷酸为a或c；
83.ts070位于7号染色体上第134235128位，其脱氧核苷酸为a或t；
84.ts071位于8号染色体上第3230578位，其脱氧核苷酸为g或a；
85.ts072位于8号染色体上第14779614位，其脱氧核苷酸为c或t；
86.ts073位于8号染色体上第34418092位，其脱氧核苷酸为c或a；
87.ts074位于8号染色体上第47428516位，其脱氧核苷酸为g或a；
88.ts075位于8号染色体上第64510378位，其脱氧核苷酸为g或t；
89.ts076位于8号染色体上第77171808位，其脱氧核苷酸为a或c；
90.ts077位于8号染色体上第86364114位，其脱氧核苷酸为t或c；
91.ts078位于8号染色体上第103332416位，其脱氧核苷酸为a或g；
92.ts079位于8号染色体上第119385289位，其脱氧核苷酸为c或g；
93.ts080位于8号染色体上第139629563位，其脱氧核苷酸为c或t；
94.ts081位于9号染色体上第10705780位，其脱氧核苷酸为a或t；
95.ts082位于9号染色体上第25510126位，其脱氧核苷酸为a或g；
96.ts083位于9号染色体上第36791110位，其脱氧核苷酸为c或t；
97.ts084位于9号染色体上第52279521位，其脱氧核苷酸为c或a；
98.ts085位于9号染色体上第66389919位，其脱氧核苷酸为a或g；
99.ts086位于9号染色体上第76596627位，其脱氧核苷酸为t或c；
100.ts087位于9号染色体上第88782369位，其脱氧核苷酸为a或g；
101.ts088位于9号染色体上第101792480位，其脱氧核苷酸为a或g；
102.ts089位于9号染色体上第114504225位，其脱氧核苷酸为a或g；
103.ts090位于9号染色体上第125921087位，其脱氧核苷酸为c或t；
104.ts091位于10号染色体上第8333061位，其脱氧核苷酸为t或g；
105.ts092位于10号染色体上第19900537位，其脱氧核苷酸为t或c；
106.ts093位于10号染色体上第30838441位，其脱氧核苷酸为a或g；
107.ts094位于10号染色体上第48459980位，其脱氧核苷酸为a或t；
108.ts095位于10号染色体上第60720808位，其脱氧核苷酸为a或g；
109.ts096位于10号染色体上第81556459位，其脱氧核苷酸为g或c；
110.ts097位于10号染色体上第91772677位，其脱氧核苷酸为g或a；
111.ts098位于10号染色体上第104792976位，其脱氧核苷酸为g或a；
112.ts099位于10号染色体上第115447057位，其脱氧核苷酸为g或a；
113.ts100位于10号染色体上第127459715位，其脱氧核苷酸为a或g；
114.ts101位于11号染色体上第1849343位，其脱氧核苷酸为c或t；
115.ts102位于11号染色体上第9349425位，其脱氧核苷酸为a或g；
116.ts103位于11号染色体上第21455270位，其脱氧核苷酸为c或t；
117.ts104位于11号染色体上第26997488位，其脱氧核苷酸为c或t；
118.ts105位于11号染色体上第39424005位，其脱氧核苷酸为t或g；
119.ts106位于11号染色体上第54261766位，其脱氧核苷酸为g或t；
120.ts107位于11号染色体上第71261702位，其脱氧核苷酸为t或g；
121.ts108位于11号染色体上第89921212位，其脱氧核苷酸为t或a；
122.ts109位于11号染色体上第108191371位，其脱氧核苷酸为g或a；
123.ts110位于11号染色体上第125710919位，其脱氧核苷酸为c或t；
124.ts111位于12号染色体上第6346289位，其脱氧核苷酸为g或a；
125.ts112位于12号染色体上第19411089位，其脱氧核苷酸为g或c；
126.ts113位于12号染色体上第35572511位，其脱氧核苷酸为c或a；
127.ts114位于12号染色体上第50563895位，其脱氧核苷酸为c或a；
128.ts115位于12号染色体上第64428830位，其脱氧核苷酸为a或g；
129.ts116位于12号染色体上第72201030位，其脱氧核苷酸为c或t；
130.ts117位于12号染色体上第84715140位，其脱氧核苷酸为a或g；
131.ts118位于12号染色体上第96783131位，其脱氧核苷酸为c或t；
132.ts119位于12号染色体上第112836712位，其脱氧核苷酸为c或a；
133.ts120位于12号染色体上第120317419位，其脱氧核苷酸为c或t；
134.ts121位于13号染色体上第2084818位，其脱氧核苷酸为a或g；
135.ts122位于13号染色体上第15919260位，其脱氧核苷酸为a或t；
136.ts123位于13号染色体上第29366753位，其脱氧核苷酸为g或t；
137.ts124位于13号染色体上第42405167位，其脱氧核苷酸为g或a；
138.ts125位于13号染色体上第50730421位，其脱氧核苷酸为t或c；
139.ts126位于13号染色体上第60261050位，其脱氧核苷酸为g或a；
140.ts127位于13号染色体上第71762485位，其脱氧核苷酸为c或a；
141.ts128位于13号染色体上第86588177位，其脱氧核苷酸为c或t；
142.ts129位于13号染色体上第100565007位，其脱氧核苷酸为a或g；
143.ts130位于13号染色体上第111060065位，其脱氧核苷酸为t或g；
144.ts131位于14号染色体上第761393位，其脱氧核苷酸为g或a；
145.ts132位于14号染色体上第10247910位，其脱氧核苷酸为c或t；
146.ts133位于14号染色体上第25145170位，其脱氧核苷酸为g或a；
147.ts134位于14号染色体上第33808789位，其脱氧核苷酸为a或g；
148.ts135位于14号染色体上第43276550位，其脱氧核苷酸为g或a；
149.ts136位于14号染色体上第54717027位，其脱氧核苷酸为t或c；
150.ts137位于14号染色体上第64685001位，其脱氧核苷酸为g或t；
151.ts138位于14号染色体上第76697305位，其脱氧核苷酸为c或t；
152.ts139位于14号染色体上第89419411位，其脱氧核苷酸为a或t；
153.ts140位于14号染色体上第105075736位，其脱氧核苷酸为a或g；
154.ts141位于15号染色体上第151458位，其脱氧核苷酸为t或c；
155.ts142位于15号染色体上第9949166位，其脱氧核苷酸为g或a；
156.ts143位于15号染色体上第20982657位，其脱氧核苷酸为a或g；
157.ts144位于15号染色体上第31321347位，其脱氧核苷酸为g或t；
158.ts145位于15号染色体上第43232491位，其脱氧核苷酸为a或c；
159.ts146位于15号染色体上第49438846位，其脱氧核苷酸为g或c；
160.ts147位于15号染色体上第65072165位，其脱氧核苷酸为c或t；
161.ts148位于15号染色体上第76351185位，其脱氧核苷酸为a或c；
162.ts149位于15号染色体上第89189533位，其脱氧核苷酸为g或a；
163.ts150位于15号染色体上第104194974位，其脱氧核苷酸为t或g；
164.ts151位于16号染色体上第1110051位，其脱氧核苷酸为t或c；
165.ts152位于16号染色体上第10087681位，其脱氧核苷酸为c或t；
166.ts153位于16号染色体上第17842746位，其脱氧核苷酸为c或t；
167.ts154位于16号染色体上第26067906位，其脱氧核苷酸为a或c；
168.ts155位于16号染色体上第34995199位，其脱氧核苷酸为g或a；
169.ts156位于16号染色体上第46203805位，其脱氧核苷酸为t或c；
170.ts157位于16号染色体上第52542790位，其脱氧核苷酸为t或c；
171.ts158位于16号染色体上第62428942位，其脱氧核苷酸为c或g；
172.ts159位于16号染色体上第79498876位，其脱氧核苷酸为c或t；
173.ts160位于16号染色体上第82884529位，其脱氧核苷酸为c或a；
174.ts161位于17号染色体上第3824750位，其脱氧核苷酸为a或g；
175.ts162位于17号染色体上第13454308位，其脱氧核苷酸为c或t；
176.ts163位于17号染色体上第23361027位，其脱氧核苷酸为t或c；
177.ts164位于17号染色体上第30960072位，其脱氧核苷酸为t或a；
178.ts165位于17号染色体上第39785348位，其脱氧核苷酸为g或a；
179.ts166位于17号染色体上第49241377位，其脱氧核苷酸为g或a；
180.ts167位于17号染色体上第56588921位，其脱氧核苷酸为a或g；
181.ts168位于17号染色体上第68788574位，其脱氧核苷酸为t或a；
182.ts169位于17号染色体上第76261437位，其脱氧核苷酸为a或t；
183.ts170位于17号染色体上第86191077位，其脱氧核苷酸为c或t；
184.ts171位于18号染色体上第10666388位，其脱氧核苷酸为t或g；
185.ts172位于18号染色体上第23470800位，其脱氧核苷酸为a或g；
186.ts173位于18号染色体上第30405985位，其脱氧核苷酸为c或t；
187.ts174位于18号染色体上第37097793位，其脱氧核苷酸为c或a；
188.ts175位于18号染色体上第41051715位，其脱氧核苷酸为t或a；
189.ts176位于18号染色体上第49088497位，其脱氧核苷酸为c或a；
190.ts177位于18号染色体上第58652117位，其脱氧核苷酸为g或t；
191.ts178位于18号染色体上第69344463位，其脱氧核苷酸为t或c；
192.ts179位于18号染色体上第77733306位，其脱氧核苷酸为t或a；
193.ts180位于18号染色体上第84321700位，其脱氧核苷酸为g或a；
194.ts181位于19号染色体上第2073784位，其脱氧核苷酸为t或a；
195.ts182位于19号染色体上第7537621位，其脱氧核苷酸为g或a；
196.ts183位于19号染色体上第13153286位，其脱氧核苷酸为c或t；
197.ts184位于19号染色体上第17723705位，其脱氧核苷酸为c或g；
198.ts185位于19号染色体上第27550742位，其脱氧核苷酸为t或c；
199.ts186位于19号染色体上第32885827位，其脱氧核苷酸为a或g；
200.ts187位于19号染色体上第39636484位，其脱氧核苷酸为g或a；
201.ts188位于19号染色体上第44936247位，其脱氧核苷酸为c或t；
202.ts189位于19号染色体上第57465608位，其脱氧核苷酸为c或t；
203.ts190位于19号染色体上第74639708位，其脱氧核苷酸为c或t；
204.ts191位于20号染色体上第4182297位，其脱氧核苷酸为g或a；
205.ts192位于20号染色体上第13966980位，其脱氧核苷酸为g或a；
206.ts193位于20号染色体上第19609796位，其脱氧核苷酸为g或a；
207.ts194位于20号染色体上第29237378位，其脱氧核苷酸为a或g；
208.ts195位于20号染色体上第36180655位，其脱氧核苷酸为t或g；
209.ts196位于20号染色体上第39861635位，其脱氧核苷酸为g或c；
210.ts197位于20号染色体上第52409493位，其脱氧核苷酸为t或a；
211.ts198位于20号染色体上第56616994位，其脱氧核苷酸为c或t；
212.ts199位于20号染色体上第66112600位，其脱氧核苷酸为g或t；
213.ts200位于20号染色体上第76769655位，其脱氧核苷酸为g或a；
214.ts201位于21号染色体上第1120311位，其脱氧核苷酸为a或g；
215.ts202位于21号染色体上第8841119位，其脱氧核苷酸为t或g；
216.ts203位于21号染色体上第15008035位，其脱氧核苷酸为g或a；
217.ts204位于21号染色体上第21697573位，其脱氧核苷酸为t或g；
218.ts205位于21号染色体上第29569502位，其脱氧核苷酸为c或t；
219.ts206位于21号染色体上第35545304位，其脱氧核苷酸为a或t；
220.ts207位于21号染色体上第43960675位，其脱氧核苷酸为c或t；
221.ts208位于21号染色体上第52269430位，其脱氧核苷酸为a或g；
222.ts209位于21号染色体上第60583608位，其脱氧核苷酸为a或g；
223.ts210位于21号染色体上第72870875位，其脱氧核苷酸为a或c；
224.ts211位于22号染色体上第473170位，其脱氧核苷酸为a或g；
225.ts212位于22号染色体上第8509606位，其脱氧核苷酸为t或c；
226.ts213位于22号染色体上第12853488位，其脱氧核苷酸为t或c；
227.ts214位于22号染色体上第22117353位，其脱氧核苷酸为g或a；
228.ts215位于22号染色体上第26228906位，其脱氧核苷酸为t或a；
229.ts216位于22号染色体上第33899956位，其脱氧核苷酸为c或t；
230.ts217位于22号染色体上第41179872位，其脱氧核苷酸为c或a；
231.ts218位于22号染色体上第47452531位，其脱氧核苷酸为c或g；
232.ts219位于22号染色体上第58059052位，其脱氧核苷酸为t或a；
233.ts220位于22号染色体上第72943832位，其脱氧核苷酸为a或g；
234.ts221位于23号染色体上第79892位，其脱氧核苷酸为c或t；
235.ts222位于23号染色体上第5555730位，其脱氧核苷酸为c或t；
236.ts223位于23号染色体上第13135791位，其脱氧核苷酸为a或g；
237.ts224位于23号染色体上第24118597位，其脱氧核苷酸为a或t；
238.ts225位于23号染色体上第34819441位，其脱氧核苷酸为g或a；
239.ts226位于23号染色体上第42069769位，其脱氧核苷酸为t或c；
240.ts227位于23号染色体上第46079860位，其脱氧核苷酸为g或a；
241.ts228位于23号染色体上第50972058位，其脱氧核苷酸为a或g；
242.ts229位于23号染色体上第58370965位，其脱氧核苷酸为c或t；
243.ts230位于23号染色体上第66245863位，其脱氧核苷酸为a或t；
244.ts231位于24号染色体上第5769442位，其脱氧核苷酸为c或t；
245.ts232位于24号染色体上第16375603位，其脱氧核苷酸为t或c；
246.ts233位于24号染色体上第19508580位，其脱氧核苷酸为g或a；
247.ts234位于24号染色体上第20893673位，其脱氧核苷酸为t或g；
248.ts235位于24号染色体上第27208986位，其脱氧核苷酸为t或c；
249.ts236位于24号染色体上第34358980位，其脱氧核苷酸为c或t；
250.ts237位于24号染色体上第44075839位，其脱氧核苷酸为t或g；
251.ts238位于24号染色体上第49853976位，其脱氧核苷酸为a或g；
252.ts239位于24号染色体上第58945156位，其脱氧核苷酸为t或g；
253.ts240位于24号染色体上第63099098位，其脱氧核苷酸为c或g。
254.进一步地，所述烟草基因组中如下240个snp位点中的全部或部分优选为如下48个snp位点组合：ts003、ts007、ts013、ts019、ts028、ts029、ts033、ts039、ts041、ts048、ts055、ts060、ts062、ts070、ts074、ts079、ts082、ts089、ts093、ts098、ts106、ts108、ts113、ts120、ts122、ts129、ts132、ts138、ts141、ts148、ts152、ts159、ts164、ts169、ts172、ts179、ts183、ts186、ts192、ts194、ts201、ts207、ts212、ts218、ts222、ts230、ts232、ts236。
255.进一步地，所述240个snp位点的单核苷酸多态性以及上下游各50bp序列如表3所示。
256.第二方面，本发明要求保护成套kasp引物。
257.本发明要求保护的成套kasp引物为用于检测前文第一方面中所述240个snp位点中的全部或部分的kasp引物。
258.进一步地，所述成套kasp引物优选为检测如下48个snp位点的成套kasp引物：ts003、ts007、ts013、ts019、ts028、ts029、ts033、ts039、ts041、ts048、ts055、ts060、ts062、ts070、ts074、ts079、ts082、ts089、ts093、ts098、ts106、ts108、ts113、ts120、ts122、ts129、ts132、ts138、ts141、ts148、ts152、ts159、ts164、ts169、ts172、ts179、ts183、ts186、ts192、ts194、ts201、ts207、ts212、ts218、ts222、ts230、ts232、ts236。
259.其中，每个待测snp位点对应的kasp引物均分别包括两条正向引物和一条反向引物；其中两条正向引物分别记作正向引物1和正向引物2；所述正向引物1的5'端连接一种荧光标签序列，所述正向引物2的5'端连接另一种荧光标签序列。
260.用于检测ts001的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.1所示，正向引物2的核苷
酸序列如seq id no.241所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.481所示；
261.用于检测ts002的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.2所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.242所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.482所示；
262.用于检测ts003的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.3所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.243所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.483所示；
263.用于检测ts004的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.4所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.244所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.484所示；
264.用于检测ts005的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.5所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.245所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.485所示；
265.用于检测ts006的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.6所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.246所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.486所示；
266.用于检测ts007的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.7所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.247所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.487所示；
267.用于检测ts008的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.8所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.248所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.488所示；
268.用于检测ts009的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.9所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.249所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.489所示；
269.用于检测ts010的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.10所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.250所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.490所示；
270.用于检测ts011的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.11所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.251所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.491所示；
271.用于检测ts012的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.12所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.252所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.492所示；
272.用于检测ts013的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.13所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.253所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.493所示；
273.用于检测ts014的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.14所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.254所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.494所示；
274.用于检测ts015的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.15所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.255所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.495所示；
275.用于检测ts016的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.16所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.256所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.496所示；
276.用于检测ts017的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.17所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.257所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.497所示；
277.用于检测ts018的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.18所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.258所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.498所示；
278.用于检测ts019的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.19所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.259所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.499所示；
279.用于检测ts020的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.20所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.260所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.500所示；
280.用于检测ts021的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.21所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.261所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.501所示；
281.用于检测ts022的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.22所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.262所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.502所示；
282.用于检测ts023的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.23所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.263所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.503所示；
283.用于检测ts024的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.24所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.264所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.504所示；
284.用于检测ts025的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.25所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.265所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.505所示；
285.用于检测ts026的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.26所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.266所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.506所示；
286.用于检测ts027的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.27所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.267所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.507所示；
287.用于检测ts028的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.28所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.268所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.508所示；
288.用于检测ts029的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.29所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.269所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.509所示；
289.用于检测ts030的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.30所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.270所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.510所示；
290.用于检测ts031的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.31所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.271所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.511所示；
291.用于检测ts032的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.32所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.272所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.512所示；
292.用于检测ts033的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.33所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.273所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.513所示；
293.用于检测ts034的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.34所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.274所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.514所示；
294.用于检测ts035的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.35所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.275所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.515所示；
295.用于检测ts036的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.36所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.276所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.516所示；
296.用于检测ts037的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.37所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.277所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.517所示；
297.用于检测ts038的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.38所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.278所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.518所示；
298.用于检测ts039的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.39所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.279所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.519所示；
299.用于检测ts040的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.40所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.280所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.520所示；
300.用于检测ts041的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.41所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.281所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.521所示；
301.用于检测ts042的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.42所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.282所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.522所示；
302.用于检测ts043的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.43所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.283所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.523所示；
303.用于检测ts044的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.44所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.284所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.524所示；
304.用于检测ts045的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.45所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.285所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.525所示；
305.用于检测ts046的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.46所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.286所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.526所示；
306.用于检测ts047的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.47所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.287所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.527所示；
307.用于检测ts048的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.48所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.288所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.528所示；
308.用于检测ts049的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.49所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.289所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.529所示；
309.用于检测ts050的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.50所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.290所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.530所示；
310.用于检测ts051的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.51所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.291所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.531所示；
311.用于检测ts052的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.52所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.292所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.532所示；
312.用于检测ts053的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.53所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.293所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.533所示；
313.用于检测ts054的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.54所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.294所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.534所示；
314.用于检测ts055的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.55所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.295所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.535所示；
315.用于检测ts056的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.56所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.296所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.536所示；
316.用于检测ts057的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.57所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.297所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.537所示；
317.用于检测ts058的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.58所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.298所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.538所示；
318.用于检测ts059的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.59所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.299所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.539所示；
319.用于检测ts060的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.60所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.300所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.540所示；
320.用于检测ts061的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.61所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.301所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.541所示；
321.用于检测ts062的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.62所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.302所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.542所示；
322.用于检测ts063的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.63所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.303所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.543所示；
323.用于检测ts064的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.64所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.304所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.544所示；
324.用于检测ts065的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.65所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.305所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.545所示；
325.用于检测ts066的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.66所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.306所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.546所示；
326.用于检测ts067的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.67所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.307所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.547所示；
327.用于检测ts068的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.68所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.308所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.548所示；
328.用于检测ts069的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.69所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.309所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.549所示；
329.用于检测ts070的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.70所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.310所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.550所示；
330.用于检测ts071的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.71所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.311所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.551所示；
331.用于检测ts072的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.72所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.312所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.552所示；
332.用于检测ts073的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.73所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.313所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.553所示；
333.用于检测ts074的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.74所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.314所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.554所示；
334.用于检测ts075的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.75所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.315所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.555所示；
335.用于检测ts076的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.76所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.316所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.556所示；
336.用于检测ts077的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.77所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.317所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.557所示；
337.用于检测ts078的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.78所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.318所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.558所示；
338.用于检测ts079的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.79所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.319所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.559所示；
339.用于检测ts080的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.80所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.320所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.560所示；
340.用于检测ts081的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.81所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.321所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.561所示；
341.用于检测ts082的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.82所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.322所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.562所示；
342.用于检测ts083的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.83所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.323所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.563所示；
343.用于检测ts084的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.84所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.324所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.564所示；
344.用于检测ts085的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.85所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.325所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.565所示；
345.用于检测ts086的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.86所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.326所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.566所示；
346.用于检测ts087的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.87所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.327所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.567所示；
347.用于检测ts088的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.88所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.328所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.568所示；
348.用于检测ts089的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.89所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.329所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.569所示；
349.用于检测ts090的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.90所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.330所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.570所示；
350.用于检测ts091的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.91所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.331所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.571所示；
351.用于检测ts092的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.92所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.332所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.572所示；
352.用于检测ts093的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.93所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.333所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.573所示；
353.用于检测ts094的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.94所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.334所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.574所示；
354.用于检测ts095的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.95所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.335所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.575所示；
355.用于检测ts096的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.96所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.336所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.576所示；
356.用于检测ts097的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.97所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.337所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.577所示；
357.用于检测ts098的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.98所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.338所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.578所示；
358.用于检测ts099的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.99所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.339所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.579所示；
359.用于检测ts100的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.100所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.340所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.580所示；
360.用于检测ts101的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.101所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.341所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.581所示；
361.用于检测ts102的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.102所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.342所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.582所示；
362.用于检测ts103的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.103所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.343所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.583所示；
363.用于检测ts104的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.104所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.344所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.584所示；
364.用于检测ts105的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.105所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.345所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.585所示；
365.用于检测ts106的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.106所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.346所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.586所示；
366.用于检测ts107的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.107所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.347所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.587所示；
367.用于检测ts108的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.108所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.348所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.588所示；
368.用于检测ts109的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.109所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.349所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.589所示；
369.用于检测ts110的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.110所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.350所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.590所示；
370.用于检测ts111的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.111所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.351所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.591所示；
371.用于检测ts112的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.112所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.352所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.592所示；
372.用于检测ts113的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.113所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.353所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.593所示；
373.用于检测ts114的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.114所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.354所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.594所示；
374.用于检测ts115的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.115所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.355所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.595所示；
375.用于检测ts116的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.116所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.356所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.596所示；
376.用于检测ts117的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.117所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.357所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.597所示；
377.用于检测ts118的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.118所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.358所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.598所示；
378.用于检测ts119的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.119所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.359所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.599所示；
379.用于检测ts120的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.120所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.360所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.600所示；
380.用于检测ts121的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.121所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.361所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.601所示；
381.用于检测ts122的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.122所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.362所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.602所示；
382.用于检测ts123的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.123所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.363所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.603所示；
383.用于检测ts124的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.124所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.364所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.604所示；
384.用于检测ts125的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.125所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.365所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.605所示；
385.用于检测ts126的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.126所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.366所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.606所示；
386.用于检测ts127的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.127所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.367所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.607所示；
387.用于检测ts128的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.128所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.368所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.608所示；
388.用于检测ts129的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.129所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.369所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.609所示；
389.用于检测ts130的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.130所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.370所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.610所示；
390.用于检测ts131的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.131所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.371所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.611所示；
391.用于检测ts132的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.132所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.372所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.612所示；
392.用于检测ts133的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.133所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.373所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.613所示；
393.用于检测ts134的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.134所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.374所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.614所示；
394.用于检测ts135的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.135所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.375所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.615所示；
395.用于检测ts136的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.136所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.376所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.616所示；
396.用于检测ts137的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.137所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.377所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.617所示；
397.用于检测ts138的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.138所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.378所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.618所示；
398.用于检测ts139的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.139所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.379所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.619所示；
399.用于检测ts140的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.140所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.380所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.620所示；
400.用于检测ts141的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.141所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.381所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.621所示；
401.用于检测ts142的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.142所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.382所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.622所示；
402.用于检测ts143的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.143所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.383所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.623所示；
403.用于检测ts144的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.144所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.384所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.624所示；
404.用于检测ts145的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.145所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.385所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.625所示；
405.用于检测ts146的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.146所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.386所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.626所示；
406.用于检测ts147的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.147所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.387所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.627所示；
407.用于检测ts148的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.148所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.388所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.628所示；
408.用于检测ts149的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.149所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.389所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.629所示；
409.用于检测ts150的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.150所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.390所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.630所示；
410.用于检测ts151的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.151所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.391所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.631所示；
411.用于检测ts152的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.152所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.392所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.632所示；
412.用于检测ts153的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.153所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.393所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.633所示；
413.用于检测ts154的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.154所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.394所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.634所示；
414.用于检测ts155的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.155所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.395所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.635所示；
415.用于检测ts156的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.156所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.396所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.636所示；
416.用于检测ts157的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.157所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.397所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.637所示；
417.用于检测ts158的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.158所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.398所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.638所示；
418.用于检测ts159的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.159所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.399所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.639所示；
419.用于检测ts160的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.160所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.400所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.640所示；
420.用于检测ts161的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.161所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.401所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.641所示；
421.用于检测ts162的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.162所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.402所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.642所示；
422.用于检测ts163的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.163所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.403所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.643所示；
423.用于检测ts164的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.164所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.404所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.644所示；
424.用于检测ts165的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.165所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.405所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.645所示；
425.用于检测ts166的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.166所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.406所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.646所示；
426.用于检测ts167的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.167所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.407所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.647所示；
427.用于检测ts168的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.168所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.408所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.648所示；
428.用于检测ts169的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.169所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.409所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.649所示；
429.用于检测ts170的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.170所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.410所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.650所示；
430.用于检测ts171的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.171所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.411所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.651所示；
431.用于检测ts172的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.172所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.412所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.652所示；
432.用于检测ts173的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.173所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.413所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.653所示；
433.用于检测ts174的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.174所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.414所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.654所示；
434.用于检测ts175的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.175所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.415所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.655所示；
435.用于检测ts176的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.176所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.416所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.656所示；
436.用于检测ts177的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.177所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.417所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.657所示；
437.用于检测ts178的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.178所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.418所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.658所示；
438.用于检测ts179的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.179所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.419所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.659所示；
439.用于检测ts180的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.180所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.420所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.660所示；
440.用于检测ts181的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.181所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.421所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.661所示；
441.用于检测ts182的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.182所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.422所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.662所示；
442.用于检测ts183的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.183所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.423所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.663所示；
443.用于检测ts184的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.184所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.424所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.664所示；
444.用于检测ts185的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.185所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.425所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.665所示；
445.用于检测ts186的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.186所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.426所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.666所示；
446.用于检测ts187的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.187所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.427所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.667所示；
447.用于检测ts188的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.188所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.428所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.668所示；
448.用于检测ts189的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.189所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.429所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.669所示；
449.用于检测ts190的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.190所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.430所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.670所示；
450.用于检测ts191的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.191所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.431所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.671所示；
451.用于检测ts192的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.192所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.432所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.672所示；
452.用于检测ts193的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.193所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.433所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.673所示；
453.用于检测ts194的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.194所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.434所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.674所示；
454.用于检测ts195的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.195所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.435所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.675所示；
455.用于检测ts196的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.196所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.436所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.676所示；
456.用于检测ts197的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.197所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.437所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.677所示；
457.用于检测ts198的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.198所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.438所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.678所示；
458.用于检测ts199的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.199所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.439所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.679所示；
459.用于检测ts200的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.200所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.440所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.680所示；
460.用于检测ts201的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.201所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.441所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.681所示；
461.用于检测ts202的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.202所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.442所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.682所示；
462.用于检测ts203的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.203所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.443所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.683所示；
463.用于检测ts204的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.204所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.444所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.684所示；
464.用于检测ts205的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.205所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.445所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.685所示；
465.用于检测ts206的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.206所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.446所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.686所示；
466.用于检测ts207的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.207所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.447所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.687所示；
467.用于检测ts208的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.208所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.448所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.688所示；
468.用于检测ts209的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.209所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.449所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.689所示；
469.用于检测ts210的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.210所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.450所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.690所示；
470.用于检测ts211的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.211所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.451所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.691所示；
471.用于检测ts212的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.212所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.452所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.692所示；
472.用于检测ts213的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.213所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.453所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.693所示；
473.用于检测ts214的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.214所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.454所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.694所示；
474.用于检测ts215的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.215所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.455所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.695所示；
475.用于检测ts216的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.216所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.456所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.696所示；
476.用于检测ts217的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.217所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.457所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.697所示；
477.用于检测ts218的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.218所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.458所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.698所示；
478.用于检测ts219的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.219所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.459所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.699所示；
479.用于检测ts220的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.220所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.460所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.700所示；
480.用于检测ts221的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.221所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.461所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.701所示；
481.用于检测ts222的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.222所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.462所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.702所示；
482.用于检测ts223的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.223所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.463所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.703所示；
483.用于检测ts224的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.224所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.464所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.704所示；
484.用于检测ts225的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.225所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.465所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.705所示；
485.用于检测ts226的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.226所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.466所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.706所示；
486.用于检测ts227的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.227所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.467所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.707所示；
487.用于检测ts228的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.228所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.468所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.708所示；
488.用于检测ts229的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.229所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.469所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.709所示；
489.用于检测ts230的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.230所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.470所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.710所示；
490.用于检测ts231的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.231所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.471所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.711所示；
491.用于检测ts232的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.232所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.472所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.712所示；
492.用于检测ts233的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.233所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.473所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.713所示；
493.用于检测ts234的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.234所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.474所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.714所示；
494.用于检测ts235的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.235所示，正向引物2的核
苷酸序列如seq id no.475所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.715所示；
495.用于检测ts236的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.236所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.476所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.716所示；
496.用于检测ts237的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.237所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.477所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.717所示；
497.用于检测ts238的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.238所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.478所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.718所示；
498.用于检测ts239的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.239所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.479所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.719所示；
499.用于检测ts240的正向引物1的核苷酸序列如seq id no.240所示，正向引物2的核苷酸序列如seq id no.480所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.720所示。
500.进一步地，所述正向引物1的5'端连接的荧光标签序列为fam荧光标签序列；所述正向引物2的5'端连接的荧光标签序列为hex荧光标签序列。
501.更进一步地，所述fam荧光标签序列如seq id no.721所示；所述hex荧光标签序列如seq id no.722所示。
502.本发明中，将上述成套kasp引物记为tasnp kasp primermix。
503.第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面所述的成套kasp引物tasnp kasp primermix的试剂盒。进一步地，所述试剂或试剂盒中还可含有kasp 2
×
mastermix，mgcl2和ddh2o。
504.所述试剂或试剂盒中kasp 2
×
mastermix含有荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b。
505.所述荧光探针a的核苷酸序列与所述正向引物1的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团a；所述淬灭探针a的核苷酸序列与所述标签序列a的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。
506.所述荧光探针b的核苷酸序列与所述正向引物2的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团b；所述淬灭探针b的核苷酸序列与所述标签序列b的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。
507.在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团a为fam；所述荧光基团b为hxe；所述淬灭基团为bhq。
508.第四方面，本发明要求保护前文第二方面所述的成套kasp引物或前文第三方面所述的试剂盒在如下任一中的应用：
509.(1)开发烟草snp位点检测试剂盒；此处所说的snp位点即为如下240个snp位点中的全部或部分；
510.(2)对烟草种质资源和/或遗传群体进行基因分型；
511.(3)构建烟草种质资源/品种dna指纹图谱；
512.(4)检测烟草品种纯度和/或真伪度。
513.第五方面，本发明要求保护如下任一方法：
514.方法a：一种对烟草种质资源和/或遗传群体进行基因分型的方法，包括如下步骤：
515.(a1)分别提取供试烟草种质资源和/或遗传群体中所有烟草样品的基因组dna；
516.(a2)对供试烟草样品dna，按前文所述240个snp位点，依次配制pcr反应体系，进行pcr扩增；
517.(a3)利用kasp荧光检测仪检测所述供试烟草样品dna的pcr扩增产物在前文所述240个snp位点的fam和hex荧光值，计算获得所述供试烟草样品在所述240个snp位点的基因分型结果(即检测snp位点处的具体的核苷酸，下同)。单个snp位点数据记录为xx、yy或xy，其中x、y为该位点的单核苷酸多态性，具体为a、t、g或c，按此顺序排列。缺失或者无效数据记录为
‑‑
。一个样品的xy以及
‑‑
基因型所占比例之和如果高于10％，不予采用。
518.方法b：一种构建烟草种质资源/品种dna指纹图谱的方法，包括如下步骤(b1)：
519.(b1)提取用于构建dna指纹图谱的所有烟草种质资源/品种的基因组dna，检测前文所述240个snp位点的基因型，完成对供试烟草种质资源/品种的基因分型，对供试的每个烟草种质资源/品种在所述240个snp位点上基因型按照位点编号顺序组合排列，形成特异序列，该特异序列即可作为烟草种质资源/品种dna指纹图谱。
520.进一步地，在步骤(b1)基础上还可包括如下步骤(b2)：
521.(b2)从前文所述的240个snp位点中按照每条染色体2个snp位点的原则，从1号染色体至24号染色体依次优选出ts003、ts007、ts013、ts019、ts028、ts029、ts033、ts039、ts041、ts048、ts055、ts060、ts062、ts070、ts074、ts079、ts082、ts089、ts093、ts098、ts106、ts108、ts113、ts120、ts122、ts129、ts132、ts138、ts141、ts148、ts152、ts159、ts164、ts169、ts172、ts179、ts183、ts186、ts192、ts194、ts201、ts207、ts212、ts218、ts222、ts230、ts232、ts236共48个snp位点作为构建烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心特征snp位点。
522.进一步地，在步骤(b2)基础上还可包括如下步骤(b3)：
523.(b3)针对所述的48个核心特征snp位点，按照如下将基因型组合转化为计算机字符串标签：
524.首先按照由同一染色体上snp位点进行组合规则，把48个核心特征snp位点分成24对snp位点组合。每个snp位点的基因分型结果由xx、yy、xy或
‑‑
组成，其中x、y为该位点的单核苷酸，如a、t、g、c，按此顺序排列。每对snp位点组合中两个snp位点，按照在染色体上物理位置由小到大依次排列，则每对snp位点基因型组合有aaaa、aatt、aagg、aacc、ttaa、tttt、ttgg、ttcc、ggaa、ggtt、gggg、ggcc、ccaa、cctt、ccgg、cccc这些纯合基因型组合及包含xy或者
‑‑
类型的基因型组合。
525.随后对每对snp位点纯合基因型组合按照aaaa对应字符'0'、aatt对应字符'1'、aagg对应字符'2'、aacc对应字符'3'、ttaa对应字符'4'、tttt对应字符'5'、ttgg对应字符'6'、ttcc对应字符'7'、ggaa对应字符'8'、ggtt对应字符'9'、gggg对应字符'a'、ggcc对应字符'b'、ccaa对应字符'c'、cctt对应字符'd'、ccgg对应字符'e'、cccc对应字符'f'进行转换。对包含xy或者
‑‑
类型的基因型组合定义为“无意义组合”，统一转换为字符'n'。依次按照染色体编号对24对snp位点组合进行转换。
526.根据上述规则，使得所述烟草种质资源/品种dna指纹图谱中48个核心特征分子snp位点基因型组合，转换成了由24个字符组成的字符串，该字符串作为所述烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码。一个有意义烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码包含字符'n'不超过3个。
527.进一步地，在步骤(b3)基础上还可包括如下步骤(b4)：
528.(b4)为避免亲缘关系相近烟草种质资源/品种核心码相同情况，在定义了所述烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码的基础上，结合前文所述240个snp位点基因型数据，新增加了附加码和注释码区段，格式为：核心码-附加码-注释码，其中核心码为步骤(b3)定义的24个字符组成的字符串，附加码为字符0～9、a～f和n中的1个，注释码为字符0～9组成的长度为6的字符串。
529.附加码为前文所述240个snp位点中除48个核心特征snp位点外的任意可以区别供试烟草种质资源/品种的两个snp位点组合基因型编码，编码规则参考(b3)进行。
530.注释码由附加码所对应的两个snp位点的序号中的阿拉伯数值组成。如两个供试烟草种质资源/品种z1和z2核心码形同，但前文所述240个snp位点中还有包含tsxxx和tsyyy(对应表2中的“序号”一栏)等少数几个snp位点基因型不同，则注释码为'xxxyyy'。
531.进一步地，在步骤(b4)基础上还可包括如下步骤(b5)：
532.(b5)将构建的烟草种质资源/品种dna指纹图谱核心码、以及核心码-附加码-注释码字符转化为扫码枪、手机等设备终端易于识别的二维码或条形码，以对烟草种质资源/品种进行智能化识别和管理。
533.方法c：一种检测烟草品种纯度和/或真伪度的方法，包括如下步骤：
534.(c1)准备待测烟草品种和标准对照烟草品种种子各50粒以上，催芽播种，待幼苗长出4片真叶时，取单株幼苗等量组织，随后按照所述待测烟草品种和所述标准对照烟草品种分成两组混合制样，提取基因组dna；
535.(c2)检测前文所述240个snp位点的基因型，从而获得所述待测烟草品种和所述标准对照烟草品种在所述240个snp位点上的基因型数据。当所述标准对照烟草品种样品在某snp位点的基因型为xx、yy时，该位点为有效位点，如该位点基因型为xy或者
‑‑
类型时，该位点为无效位点。所述标准对照烟草品种样品无效位点所占比例如果高于10％，不予采用，试验无效。
536.(c3)针对所述标准对照烟草品种样品在前文所述240个snp位点中的有效位点，对比所述待测烟草品种和所述标准对照烟草品种基因型差异，结果有两种：基因型相同或者不同。
537.(c4)品种纯度(p)的数值以％表示，按公式(1)计算：
[0538][0539]
公式中：
[0540]
p——品种纯度；
[0541]
s1——所述标准对照烟草品种有效位点数目；
[0542]
s2——所述标准对照烟草品种有效位点中，所述待测烟草品种与所述标准对照烟草品种基因型不同位点数目。
[0543]
(c5)当所述待测烟草品种纯度≤95％时，则判定为所述待测烟草品种与标准对照品种为“不同品种”，当所述待测烟草品种纯度》95％且《100％时，判定所述待测烟草品种为所述标准对照品种的“近似品种或疑同品种”，当所述待测烟草品种纯度为100％时，判定所述待测烟草品种与所述标准对照品种为同一品种。
[0544]
在上述各方面中，所述烟草品种均为常规种，类型可以选自烤烟、晒烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟、药烟等各类型普通烟草(nicotina tabacum l.)品种。
[0545]
在本发明的具体实施方式中，所述烟草具体选自表1中所示的150份烟草。
[0546]
进一步地，在前文第五方面所述方法中，均可采用前文第二方面中所述成套kasp引物或第三方面中所述试剂盒完成对所述240个snp位点的基因型检测。
[0547]
本发明基于贵州省烟草科学研究院开展的烟草全基因组重测序工作获得的超过百万个snp变异位点数据，对这些变异位点数据进一步分析，利用kasp技术平台，鉴定筛选出240个snp标记及配套kasp引物，覆盖了烟草24条染色体。本发明为烟草生物学研究提供了一套可信、便于后期利用的snp标记，这套snp标记和检测引物，可用于烟草snp检测试剂盒开发、烟草品种dna指纹图谱构建、烟草种质资源和遗传群体基因分型，烟草种质资源/品种dna指纹图谱构建、烟草品种纯度/真伪度检测等。
附图说明
[0548]
图1为本发明烟草snp标记筛选过程数据记录。
[0549]
图2为240个snp标记在烟草染色体/连锁群上的分布。
[0550]
图3为kasp实验检测结果说明示例图。
具体实施方式
[0551]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0552]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0553]
实施例1、筛选和开发烟草240个snp标记和kasp引物
[0554]
基于贵州省烟草科学研究院已完成的150份烟草种质资源/品种(表1)材料全基因组重测序snp变异数据(由贵州省烟草科学研究院提供，文件名称为tobacco.vcf,标记数目为1216749)，结合数理统计分析和kasp试验验证，筛选出覆盖烟草24个染色体，每条染色体上10个且分布相对均匀，可以区分上述材料240个snp标记及配套kasp引物。筛选和开发snp标记和kasp引物的具体步骤如下：
[0555]
(1)数据格式整理，将重测序变异结果文件(vcf格式)利用vcftools软件转化成plink软件可以读取的ped和map文件，执行语句：
[0556]
vcftools
‑‑
vcf tobacco.vcf
‑‑
plink
‑‑
noweb
‑‑
out tobacco_plink
[0557]
利用plink(v1.07)软件和perl语言脚本format.pl将数据格式转化为含有snp矩阵数据的txt格式，每行为1个snp标记，第1列为snp标记名称，第2列为染色体编号，第3列为标记在染色体的物理位置，第4列往后每列为1个烟草品种材料。
[0558]
执行语句：
[0559]
plink
‑‑
file tobacco_plink
‑‑
transpose
‑‑
recode
‑‑
out tobacco_geno
[0560]
perl format.pl tobacco_geno.tped》tobacco_geno_format.txt
[0561]
(2)利用perl语言脚本stat_minnor_morjor.pl对tobacco_geno_format.txt中每行的snp多态性指数(pic)，缺失率(missingrate，mr)、位点杂合频率(heterozygous frequency，hf)进行统计。
[0562]
执行语句：
[0563]
perl stat_minor_mojor.pl tobacco_geno_format.txt》tobacco_geno_stat.txt
[0564]
(3)数据质控：
[0565]
剔除哈迪温伯格平衡校验hwe大于0.05的snp位点；
[0566]
剔除最小等位位点频率maf大于0.05的snp位点；
[0567]
剔除pic小于0.2或大于0.45的snp位点；
[0568]
剔除mr大于0.1的snp位点；
[0569]
剔除hf大于0.1的snp位点；
[0570]
其中剔除hwe和maf不符合要求的snp位点可以使用plink软件(参照plink v1.07帮助文档)。
[0571]
该步骤数据质控后保留的标记数目为1179154。
[0572]
(4)利用plink软件，对通过步骤(2)的snp位点进行单倍体型分析(haplotype block estimation)，根据分析结果对snp位点进行命名，命定规则c+数字+hb+数字+s+数字，如c1hb14s146，表示第1号染色体/连锁群，第14个单倍型块(haplotype block)，第146个snp标记。
[0573]
(5)参考张军利博士的snp_primer_pipeline(https://github.com/pinbo/snp_primer_pipeline)对步骤(4)的snp位点进行kasp引物设计，该步骤结束后保留snp标记数目为217621。
[0574]
(6)结合步骤(3)-(5)，从每条染色体人工优选30个以上snp标记，标准为：
[0575]
步骤(5)有设计出kasp引物的标记；
[0576]
优选位于cds(基因编码区)的标记；
[0577]
每个单倍型块上最多2个标记；
[0578]
标记在染色体上分布距离相对均匀。
[0579]
(7)从150份烟草种质资源/品种中随机挑选24份，对步骤(6)挑选出的snp位点基因型和合成的kasp引物有效性进行试验验证，150份烟草种质资源/品种材料见表1(保存于贵州省烟草科学研究院烟草种质资源库，各材料介绍可参考著作贵州烟草品种资源(卷一、卷二)，实验体系参照英国lgc公司技术文档(具体可参考实施例2)。如果随机挑选24份烟草种质资源/品种在某snp位点kasp试验基因分型成功，且基因型和重测序结果一致，则表明该snp位点真实存在，且设计的kasp引物可用。
[0580]
(8)根据(7)结果，再次重复人工优选-合成引物-实验验证等操作。最终共挑选出1362个snp标记进行了kasp试验验证，结果表明736个标记为可用标记。每个染色体挑选标记和可用标记数目如图1所示。
[0581]
(9)利用步骤(8)中1362个snp标记对150份烟草种质资源/品种(表1)进行基因分型，整理实验数据，优选240个snp标记，用于烟草生物学相关研究。优选标准为：
[0582]
每条染色体按照长度平均划分成10个区段，尽可能每个区段挑选1个标记；
[0583]
在每个区段内尽可能选择1个位于cds区的标记；
[0584]
相邻标记间距离不处于一个单倍型块内；
[0585]
240个标记可以将150份烟草种质资源/品种完全区别出来，任意两品种间纯合snp差异数目最小为2。
[0586]
本发明所得240个snp标记的位置基因型信息如表2所示。其中，snp标记位点的物理位置是基于中国烟草基因组计划测序的烟草品种红花大金元参考基因组v1.2版本进行的标注。
[0587]
表1、150份烟草种质资源/品种
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
[0592][0593]
注：表中除xz编号的烟草种质资源/品种介绍参考专著贵州烟草品种资源(卷一)(卷二)，xz编号的烟草种质资源/品种为今年新收集的烟草种质，以上所有种质均保存在贵州省烟草科学研究院种质资源库。
[0594]
表2、240个snp位点相关信息
[0595]
[0596]
[0597]
[0598]
[0599]
[0600]
[0601][0602]
为进一步明确上述标记的特征，每个snp标记位点碱基类型加上下游各50bp序列如表3所示。
[0603]
表3、每个snp标记位点碱基类型加上下游各50bp序列
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
[0608]
[0609]
[0610]
[0611][0612]
240个snp标记在烟草染色体/连锁群上的分布如图2所示。
[0613]
本发明开发的用于检测上述240个snp标记的kasp引物，每个所属snp标记对应的kasp引物分别包括两条正向引物和一条反向引物。其中正向引物1序列5'端连接fam荧光标签序列5'-gaaggtgaccaagttcatgct-3'(seq id no.721)，正向引物2序列5'端连接hex荧光标签序列，5'-gaaggtcggagtcaacggatt-3'(seq id no.722)。本发明每个标记对应引物如表4所示。
[0614]
表4、本发明每个标记对应引物
[0615]
[0616]
[0617]
[0618]
[0619][0620]
注：表中序列与表2和表3相对应。
[0621]
本发明针对烟草240个snp标记(见表2和表3)，提供了对应的检测试剂盒。试剂盒包含所述的240套引物(见表4)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中正向引物1和正向引物2已经分别添加fam荧光序列和hex荧光序列，产品记为tasnp kasp primermix。
[0622]
试剂盒还包含英国lgc公司的产品kasp 2
×
mastermix，产品目录号kbs-1016-002。其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg
2+
等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，其5’端连接一个fam荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接一个hex荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0623]
试剂盒同时配有mgcl2和ddh2o，其中所述mgcl2为北京沃凯生物科技有限公司产品，产品cas号为7786-30-3，ddh2o为高压灭菌双蒸水。
[0624]
实施例2、烟草种质资源/品种基因分型
[0625]
本发明参照英国lgc公司技术文档，结合实际操作，提供了采用步骤一中240个snp标记(表2和表3)，对烟草种质资源或者遗传群体材料(具体为表1中的150份烟草材料)进行基因分型的方法体系，包括以下步骤：
[0626]
(1)烟草待测样本dna的提取：取待试烟草品种幼苗或者叶片200mg～300mg置于1.5ml离心管，加液氮充分研磨，每管加入65℃预热的700μl ctab提取液；将离心管置于65℃水浴30min～1h，期间每隔10min左右轻轻晃动离心管；水浴完成后冷却2min，加入0.5ml的氯仿-异戊醇混合液，剧烈震荡混匀，12000rmp离心5～10min；取离心管中上清液到新的离心管中，加入2倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃沉淀30min以上，12000rmp离心10min，弃上清；用75％乙醇洗涤2次，12000rmp离心3min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于50μl
去离子水或者te中，检测浓度，将浓度稀释到100ng/μl，立即使用或者置于-20℃保存。
[0627]
本步骤仅为推荐方法，其他能达到同样效果的方法也可采用。
[0628]
(2)针对240个snp标记(表2和表3)，依次添加kasp mastermix，tasnp kasp primermix，配制pcr反应体系，进行pcr扩增。其中，tasnp kasp primermix由5'端连接了荧光标签fam的正向引物1、5'端连接了荧光标签hex的正向引物2、反向引物组成，三者与ddh2o按照体积比12:12:30:46混合使用。
[0629]
其中，pcr反应体系如表5所示。pcr反应条件如表6所示。
[0630]
表5、pcr反应体系
[0631][0632]
表6、pcr反应条件
[0633][0634]
pcr反应：1)将稀释好的dna分装到200μl的96孔板，用rinin的8孔排枪(型号pipet-lite xls 0.5-10ul lts)吸取2μl到384孔pcr板中，离心到底部待用(厂商axygen)；2)将kaspmastermix，tasnp kasp primermix，ddh2o等按2:0.0448:1.9552(干法)或2:0.0448:0(湿法)的比例混合成pcr-mix；3)将pcr-mix按每个反应4μl(干法)，2μl(湿法)分装到每个反应孔中，然后离心到底部，用硅胶盖或封口膜封口；4)按照前文反应程序在384孔pcr仪(型号veriti
tm
384-well thermal cycler)完成反应。
[0635]
(3)荧光检测与基因分型：将pcr完成的384孔板移出，待冷却后揭去硅胶盖或封口膜，置于snp分型检测仪(型号fluostar omega snp)上检测fam和hex荧光值，利用klustercaller软件分析基因分型结果，获得基因型。
[0636]
单个snp标记位点基因分型结果，数据记录为“xx”或“xy”“yy”，“xx”与“yy”表示纯合，“xy”表示杂合，其中x、y为该位点的单核苷酸，如a、t、g、c。如某个snp标记出现无法确定单核苷酸a、t、g、c情形，则为无效数据，无效数据记录为
“‑‑”
。
[0637]
图3为kasp实验检测结果示例图。黑色(ntc)；红色(yy)；蓝色(xx)；绿色(xy)。粉色(
‑‑
)。
[0638]
一个标记的无效数据所占比例高于10％，该标记为无效标记，一个样本的无效数
据所占比例高于10％，该样本为无效样本，不予采用。
[0639]
(4)150份烟草种质资源/品种(表1)材料在所述240个标记位点上的基因分型，结果如表7所示。
[0640]
表7、150份烟草种质资源/品种材料基因分型结果
[0641]
[0642]
[0643]
[0644]
[0645]
[0646]
[0647]
[0648]
[0649]
[0650]
[0651]
[0652]
[0653][0654]
注：表中240个snp标记分型结果表示为一个由字符
‘a’‘
t
’‘g’‘c’‘‑’
组成，且长度为480的字符串，将该字符串按照长度为2分割成240份，每份表示为一个snp位点的基因型，各位点顺序按照表2中位点序号从小到大依次排列。
[0655]
实施例3、150份烟草种质资源/品种dna指纹图谱核心码构建
[0656]
本发明利用提出的烟草种质资源/品种指纹图谱方法，对贵州省烟草科学研究院保存的150份烟草种质资源(表1)构建了指纹图谱，并绘制了其核心码，包括以下步骤：
[0657]
(1)按照实施例2的步骤，完成150份烟草种质资源/品种(表1)在所述240个snp标记(表2和表3)位点上的基因分型，结果如表7所示，表7中各材料对应的240个snp位点基因分型结果即为其指纹图谱表示方式之一。
[0658]
(2)提取150份材料在ts003、ts007、ts013、ts019、ts028、ts029、ts033、ts039、
ts041、ts048、ts055、ts060、ts062、ts070、ts074、ts079、ts082、ts089、ts093、ts098、ts106、ts108、ts113、ts120、ts122、ts129、ts132、ts138、ts141、ts148、ts152、ts159、ts164、ts169、ts172、ts179、ts183、ts186、ts192、ts194、ts201、ts207、ts212、ts218、ts222、ts230、ts232、ts236共48个核心特征snp位点上的基因型。
[0659]
(3)将单个烟草种质资源/品种材料在(2)中48个位点的基因型，按照由同一染色体上snp位点进行组合规则，把48个核心特征snp标记位点分成24对snp位点组合。每个snp位点的基因分型结果由xx、yy、xy或
‑‑
组成，其中x、y为该位点的单核苷酸，如a、t、g、c，按此顺序排列。每对snp位点组合中两个snp位点，按照在染色体上物理位置由小到大依次排列，则每对snp位点基因型组合有aaaa、aatt、aagg、aacc、ttaa、tttt、ttgg、ttcc、ggaa、ggtt、gggg、ggcc、ccaa、cctt、ccgg、cccc等纯合基因型组合及包含xy或者
‑‑
类型的基因型组合。
[0660]
随后对每对snp位点纯合基因型组合按照aaaa对应字符'0'、aatt对应字符'1'、aagg对应字符'2'、aacc对应字符'3'、ttaa对应字符'4'、tttt对应字符'5'、ttgg对应字符'6'、ttcc对应字符'7'、ggaa对应字符'8'、ggtt对应字符'9'、gggg对应字符'a'、ggcc对应字符'b'、ccaa对应字符'c'、cctt对应字符'd'、ccgg对应字符'e'、cccc对应字符'f'进行转换。对包含xy或者
‑‑
类型的基因型组合定义为“无意义组合”，统一转换为字符'n'。依次按照染色体编号对24对snp位点组合进行转换。
[0661]
结束后，使得所述烟草种质资源/品种dna指纹图谱中48个核心特征snp位点基因型组合，转换成了由24个字符组成的字符串，该字符串作为所述烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码。
[0662]
(4)依次获得所述150份烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码，该核心码可以转化成二维码(表8)，作为相应烟草种质资源/品种的特征，用于种质资源/品种交流、售卖过程真伪度检验基础标准。
[0663]
表8、150份烟草种质资源/品种dna指纹图谱的核心码以及核心码转化成的二维码
[0664]
[0665]
[0666]
[0667]
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[0669]
[0670]
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[0676]
[0677]
[0678]
[0679][0680]
本发明基于150份烟草全基因组重测序数据，利用前期探索的数据分析方法，挖掘获得了超过百万个snp位点，对这些位点进一步分析，利用kasp技术平台，鉴定筛选出240个snp标记及配套kasp引物，覆盖了烟草24条染色体/连锁群。本发明为烟草生物学研究提供了一套可信、便于后期利用的snp标记，这套snp标记和检测引物，除了可用于烟草snp检测试剂盒开发、烟草品种dna指纹图谱构建、烟草种质资源和遗传群体基因分型，还可用于烟
草品种纯度/真伪度检测等。
[0681]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。