一种支气管肺泡灌洗液中外泌体miR-654-5p的应用

一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的应用
技术领域
1.本发明涉及重症肺炎分子检测技术领域，具体地，涉及一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的应用。


背景技术：

2.重症肺炎是一种严重甚至致死性的重症感染性疾病，感染起源于肺部，可快速进展进而出现呼吸衰竭。该病多为快速进展性疾病，临床上重症肺炎及其并发的全身炎症反应综合征、多脏器功能衰竭等严重威胁患者的生命。重症肺炎至今仍无普遍认同的定义，需入住icu患者可认为是重症肺炎。目前一般认为，如果肺炎患者的病情严重到需要通气支持(急性呼吸衰竭、严重气体交换障碍伴高碳酸血症或持续低氧血症)、循环支持(血流动力学障碍、外周低灌注)及加强监护治疗(肺炎引起的脓毒症或基础疾病所致的其他器官功能障碍)时可称为重症肺炎。
3.目前可以通过对患者精神状态、体格检查、动脉气血分析检查、血常规检查和影像学检查等方面来综合判断患者是否患有重症肺炎。许多非特异性指标可能与重症肺炎的严重程度相关，如c反应蛋白(crp)、降钙素原(pct)等。但是这类指标特异性差，不能精准地反应重症肺炎的严重程度。
4.外泌体是大小约50-150nm的由磷脂双分子层包围形成的细胞外囊泡，可由上皮细胞、巨噬细胞和内皮细胞等多种细胞产生，存在于多种生物体液如血液、痰液、尿液、支气管肺泡灌洗液、胸水、腹水和滑膜液中。外泌体表面具有丰富的特异性标记物如白细胞分化抗原cd9、cd63、cd81、热休克70蛋白、肿瘤敏感基因101、alg-2互动蛋白x和主要组织相容性复合物mhcⅰ和ⅱ分子。缺氧、炎症等病理因素可引起外泌体中rna和蛋白质等成分的改变，进而对应激反应和免疫应答产生影响。微核糖核酸(micro ribonucleic acid,mirna)在体液和细胞中广泛存在，与细胞增殖、分化以及疾病的发生发展有关，外泌体的磷脂双分子层可能对其有保护作用，使其不易被降解，从而保持稳定并发挥生物学作用，因此外泌体mirna相较于游离形式的mirna更稳定而不易降解(范韵鑫.慢阻肺肺泡巨噬细胞来源外泌体对气道上皮细胞增殖能力的影响及机制研究[d].中国人民解放军海军军医大学,2020.)。
[0005]
现有技术公开了早期肺腺癌特异性外泌体mirna及其应用，该mirna适用于辅助筛查早期肿瘤，为肺腺癌病人赢得治疗时机。但目前还未有针对于重症肺炎的外泌体mirna检测方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供外泌体mir-654-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用。本发明基于检测支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的表达水平，实现快速特异性识别重症肺炎患者的检测。
[0007]
本发明的第一个目的是提供外泌体mir-654-5p在制备重症肺炎的检测产品中的应用。
[0008]
本发明的第二个目的是提供一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的表达水平用于制备重症肺炎诊断的检测产品。
[0009]
本发明的第三个目的是提供一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的检测引物用于制备重症肺炎的检测产品。
[0010]
本发明的第四个目的是提供一种重症肺炎的检测试剂盒。
[0011]
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
[0012]
本发明通过超速离心法提取待检样本中的外泌体，富集外泌体rna，参照takara公司的mirnafirststrand synthesis操作说明书，对逆转录合成所述外泌体rna的cdna。设计外泌体mir-654-5p的特异性引物hsa-mir-654-5p，配制rt-qpcr反应体系，通过2-δδct
法计算各样本对应mir-654-5p表达水平，并确定所述样本是否来源于重症肺炎患者。
[0013]
因此，本发明要求保护以下内容：
[0014]
一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的应用，所述外泌体mir-654-5p用于制备重症肺炎的检测产品。
[0015]
优选地，所述外泌体mir-654-5p核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0016]
一种检测支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的表达水平的产品在制备检测重症肺炎诊断的产品中的应用。
[0017]
优选地，所述外泌体mir-654-5p核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0018]
一种支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的检测引物用于制备重症肺炎的检测产品的应用。
[0019]
优选地，所述外泌体mir-654-5p的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0020]
优选地，所述检测引物核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0021]
更优选地，所述产品为检测试剂和/或检测试剂盒。
[0022]
本发明还要求一种重症肺炎的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有权利要求1中所述外泌体mir-654-5p的表达水平检测试剂。
[0023]
优选地，所述表达水平检测试剂为核苷酸序列如seq id no:2所示的检测引物。
[0024]
优选地，所述检测试剂盒还包括rt-qpcr的试剂。
[0025]
优选地，所示rt-qpcr的试剂为takara公司的mirna firststrand synthesis试剂盒和premix ex taq
tm
[0026]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027]
本发明利用rt-qpcr方法，结合软件进行多重分析，利用支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p，能够提高检测重症肺炎患者的可靠性和准确性；
[0028]
(1)支气管肺泡灌洗液的内容物受肺组织病理生理改变的影响最为直接，采用支气管肺泡灌洗液中的外泌体，特异性强；(2)rt-qpcr检测方法可高效识别重症肺炎患者，灵敏度高；(3)采用现代分子生物学前端技术检测mir-654-5p的表达水平，高效快速；(4)引物与靶序列特异性结合，提高rt-qpcr扩增结果精准度，能够可靠检测重症肺炎患者，准确性高。
附图说明
[0029]
图1为rt-qpcr方法检测支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p表达水平的方法
流程图。
[0030]
图2支气管肺泡灌洗液中外泌体中mir-654-5p表达诊断重症肺炎的受试者工作特征(roc)曲线。
[0031]
图3balf中外泌体mir-654-5p与临床常用血清生物标志物hscrp、pct水平诊断效果的比较。
具体实施方式
[0032]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033]
实施例1引物设计
[0034]
1、获得rt-qpcr特异引物的实验方法
[0035]
登录网站http://www.mirbase.org/index.shtml，获得mirbase:》hsa-mir-654-5p mimat0003330，核苷酸序列如seq id no:1所示的mature sequence hsa-mir-654-5p，进一步得到灵敏度高、特异性好和扩增效率高的引物。
[0036]
外泌体mir-654-5p的成熟序列(seq id no:1)：
[0037]5’‑
uggugggccgcagaacaugugc-3’；
[0038]
2、获得rt-qpcr特异引物的实验结果
[0039]
从上述实验中确定的rt-qpcr的特异引物组合，采用takara公司的mirna firststrand synthesis试剂盒分别得到了u6 forward primer、u6 reverse primer和mrq3’prime。
[0040]
以及外泌体mir-654-5p的特异引物(seq id no:2)：
[0041]5’‑
tggtgggccgcagaacatg-3’；
[0042]
实施例2构建检测重症肺炎的试剂盒
[0043]
一、成分
[0044]
(1)实施例1中获得的引物组合(采用takara公司的mirna firststrand synthesis试剂盒分别得到了u6 forward primer、u6 reverse primer和mrq3’prime，以及外泌体mir-654-5p的特异引物(seq id no:2)：5
’‑
tggtgggccgcagaacatg-3’)；
[0045]
(2)ddh2o；
[0046]
(3)premix ex taq
tm
；
[0047]
(4)takara公司的mirna firststrand synthesis试剂盒。
[0048]
二、使用方法
[0049]
图1为本发明试剂盒的使用方法，具体使用步骤为：
[0050]
1、待检支气管肺泡灌洗液中外泌体的提取。
[0051]
步骤1：收集支气管肺泡灌洗液，采用离心力为300
×
g，离心时间为10min的参数进行离心，之后去除残留的细胞，收集上清液。
[0052]
步骤2：将步骤1得到的上清液转移至新的离心管中，采用离心力为14000
×
g，离心时间为30min的参数进行离心，之后去除细胞、细菌及凋亡小体等，收集上清液。
[0053]
步骤3：将步骤2得到的上清液转移到超速离心管，采用离心力为100000
×
g，离心时间为90min，的参数进行超速离心，弃去上清，加入无菌pbs重悬沉淀，得到外泌体，置于-80℃保存备用或立即使用。
[0054]
2、提取外泌体rna
[0055]
步骤1：提取外泌体样本，向样本中加入trizol，补足1ml；保持15～30℃，静置5min；
[0056]
步骤2：取出步骤1中的样品，加入氯仿200μl，涡旋振荡混匀15s，在室温下静置5min；4℃，采用离心力为12000
×
g，离心时间为15min的参数进行超速离心；离心后分3层，收取上层无色透明的rna层备用；
[0057]
步骤3：收集步骤2中的上清液，转移到新的无rna酶ep管中，加入异丙醇来沉淀rna分子，异丙醇体积与步骤2中的上清液相同；保持15～30℃，静置5min；4℃，采用离心力为12000
×
g，离心时间为10min的参数进行超速离心，离心管底部呈现胶状沉淀；
[0058]
步骤4：弃去步骤3中的上清液，在加入1ml 75％的乙醇于离心管底部的胶状沉淀中，涡旋震荡后，4℃，采用离心力为12000
×
g，离心时间为5min的参数进行超速离心，两次洗涤后，把ep管倒置在滤纸上直至乙醇挥发完全；
[0059]
步骤5：在步骤4的样本中，加入15μl碧云天生物公司制备的depc水，溶解rna沉淀，用移液器吹打沉淀，保持55～60℃，静置10min促进rna溶解；
[0060]
步骤6：rna质量和浓度采用nanodprop2000超微量分光光度计进行测定。
[0061]
3、cdna的合成
[0062]
参照takara公司的mirna firststrand synthesis操作说明书，逆转录提取到的外泌体rna，从而合成所需的cdna。
[0063]
4、rt-qpcr实验所需试剂和具体操作参数
[0064]
(1)试剂：0.5μl cdna、12.5μlpremix ex taq
tm
、0.5μl 10μm的上游引物、0.5μl 10μm的下游引物和11μl ddh2o。
[0065]
(2)扩增程序：变性95℃10s；qpcr反应95℃5s，60℃20s，
×
40循环；溶解曲线95℃60s，55℃30s，95℃，30s。
[0066]
5、扩增产物分析
[0067]
每个样设置三个复孔，读取各个样本的ct值，通过2-δδct
计算各样本对应mir-654-5p表达水平。
[0068]
6、统计学分析，选定诊断界值
[0069]
使用medcalc 19.6.0统计分析软件，分析和处理通过2-δδct
计算所得的mir-654-5p相对表达量，确定0.841为最佳诊断标准。即初步判断受检人为重症肺炎患者，需密切监测或进行影像学检查时，其mir-654-5p相对表达量大于0.841。
[0070]
实施例3通过外泌体mir-654-5p识别重症肺炎的诊断效果分析
[0071]
一、实验方法
[0072]
采集7名无呼吸道感染患者和28名重症肺炎患者的支气管肺泡灌洗液样品，使用实施例2的试剂盒检测样品。
[0073]
二、实验结果
[0074]
图2为支气管肺泡灌洗液中外泌体中mir-654-5p表达诊断重症肺炎的受试者工作
特征(roc)曲线，可以用来评价外泌体mir-654-5p对重症肺炎的诊断效果。结果显示，支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p的表达水平诊断重症肺炎的受试者工作特征曲线下面积(auc)为0.857，95％置信区间(95％ci)为0.688～0.955，标准误为0.067，p＝0.001；当临界值取0.841时，灵敏度为85.71％，特异度为100％。
[0075]
实施例4检测效果与临床常用生物标志物诊断效果的比较
[0076]
一、实验方法
[0077]
使用外周静脉穿刺采血方法获取患者外周血标本，选用日立600型全自动生化分析仪检测患者的血生化指标降钙素原(pct)和超敏c反应蛋白(hscrp)。
[0078]
使用实施例2的试剂盒检测患者支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p表达量.
[0079]
采用roc曲线比较所述三种生物标志物的诊断效果。
[0080]
二、实验结果
[0081]
结果显示，生物标志物为降钙素原的曲线下面积为0.643，标准误为0.182，95％置信区间为0.455～0.804。生物标志物为超敏c反应蛋白的曲线下面积为0.777，标准误为0.156，95％置信区间为0.595～0.904。生物标志物为mir-654-5p的曲线下面积为0.857标准误为0.067，95％置信区间为0.688～0.955。生物标志物为三者联合的曲线下面积为0.911，标准误为0.054，95％置信区间为0.756～0.982。
[0082]
其中三者联合的具体操作如下所示：
[0083]
采用medcalc软件实现多个指标联合诊断的受试者工作特征曲线分析。
[0084]
步骤1：定义变量、建立表格：如第一列(testa)为降钙素原的值；第二列(testb)为超敏c反应蛋白的值；第三列(test)为mir-654-5p的值，为数值变量；disease为疾病状态，0为无病，1为有病，即患有重症肺炎。
[0085]
步骤2：将数据导入medcalc
[0086]
步骤3：logistic回归
[0087]
点击statistics——regression——logistic regression在logistic regression对话框中，在dependent variable框选择disease，在independent variable框中第一、二、三行分别选择testa、testb和testc。在logistic regression结果对话框中，save predicted probabilities，就把概率保存到数据集中了
[0088]
步骤4：此时数据框中多了一logregr_pred1，即testa、testb和testc通过logistic产生的预测概率值，综合反应testa、testb和testc的诊断能力，用logregr_pred1绘制的受试者工作特征曲线即为三者的联合诊断。
[0089]
图3为支气管肺泡灌洗液中外泌体mir-654-5p与临床常用血清生物标志物超敏c反应蛋白和降钙素原水平诊断效果的受试者工作特征曲线。
[0090]
结合图3和实验结果可以看出，支气管肺泡灌洗液中的外泌体mir-654-5p具有较高的诊断效果，其曲线下面积值为0.857，高于临床常用的降钙素原和超敏c反应蛋白。多指标联合诊断的曲线下面积为0.911，大于其他单项指标检测。
[0091]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护
范围之内。