一种超氧阴离子自由基近红外荧光探针及其制备方法和应用

是值得开发的一个亮点。目前检测细胞超氧化物最常用的探针之一是二氢乙锭，利用超氧 化物与二氢乙锭反应形成2-羟基乙二胺阳离子，与dna结合，导致荧光增强，但其响应 条件不适用于活体及离体组织中o2·-的检测。近年来也涌现出很多检测o2·-的荧光探针， 但没有报道能够对其进行精确的定量检测。因此，开发出能够对o2·-进行定量检测的荧光 探针具有重要的意义。


技术实现要素：

8.本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种超氧阴离子自由基近红外荧光探针 mb-so，该探针具有灵敏度高(检测限14nm)、选择性好，响应速度快(30s)的优点。 在pbs缓冲液中，荧光强度与o2·-浓度呈现良好的线性关系(0-10μm)，说明探针适合定量 检测o2·-；探针mb-so还实现了ht-22细胞中o2·-的荧光成像，也实现了小鼠活体水平 内源性o2·-的灵敏检测，且响应快，荧光强度较稳定；特别是可以借助探针mb-so对癫 痫小鼠脑部的o2·-进行荧光成像以及定量检测。
9.本发明的另一目的是提供一种上述近红外荧光探针mb-so的制备方法。
10.本发明的又一发明目的是提供上述近红外荧光探针mb-so在超氧阴离子自由基检测 中的应用。
11.本发明的技术方案如下：
12.一种超氧阴离子自由基近红外荧光探针，其探针的结构式如下所示：
[0013][0014]
本发明提供的近红外o2·-荧光探针mb-so的设计思路如下：(1)以亚甲基蓝(3,7
‑ꢀ
双吩噻嗪-5-鎓氯化物(mb)为探针的荧光母核。mb的吸收和发射峰处于近红外区，已 被用作体内成像研究的理想显像剂(》640nm)。(2)以二苯基膦酰酯为识别基团。该 识别基团对o2·-具有较好的选择性，利用o2·-的高亲核性进攻识别基团形成过氧化物，分 子发生重排后释放出母核。(3)通过氨基甲酸酯键连接荧光母核mb和识别基团二苯基 膦酰酯获得探针mb-so。
[0015]
荧光探针mb-so识别o2·-的原理：探针本身无荧光，由于亚甲蓝(mb)被还原成为 还原态亚甲蓝(lmb)破坏了其共轭结构，从而猝灭其荧光。o2·-具有亲核性，进攻二苯 基次膦酰基，形成过氧化物后发生分子内重排，接着经过酚羟基上的电子迁移发生重 排，释放不稳定结构的lmb，lmb分子内电荷转移生成稳定的mb，恢复其共轭结构， 从而发出近红外荧光。
[0016]
为了验证探针mb-so与o2·-的反应原理：将mb-so溶于无水dmso中，加入ko2后，在37℃条件下孵育20min，除去溶剂后，分离产物，经hrms证实该物质是mb。
[0017]
探针mb-so与o2·-反应原理如下所示。
[0018][0019]
本发明提供的可以选择性识别o2·-的近红外荧光探针mb-so，该探针是以亚甲蓝 (mb)为荧光母核，以二苯基次膦酰氯为识别基团，经过取代、还原、缩合等反应得到 近红外荧光探针mb-so。
[0020]
识别o2·-的近红外荧光探针mb-so的合成路线如下：
[0021][0022]
在一种优选方案中，识别o2·-的近红外荧光探针mb-so的制备方法包括如下步骤：
[0023]
第一步：在三乙胺存在的条件下，4-羟基苄醇与二苯基磷酰氯进行化学反应制备化合 物1；
[0024]
第二步：在碳酸氢钠存在的条件下，化合物mb与连二亚硫酸钠进行化学反应制备中 间体lmb；再向所得中间体lmb中加入三乙胺，继续与三光气和化合物1进行化学反 应，制备荧光探针mb-so。
[0025]
对于本发明而言，在第一步中，在三乙胺存在的作用下，4-羟基苄醇与二苯基磷酰氯 进行化学反应制备化合物1时，4-羟基苄醇与二苯基磷酰氯的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但 不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好 的效果，4-羟基苄醇与二苯基磷酰氯的摩尔比为1:1。
[0026]
对于本发明而言，在第二步中，在碳酸氢钠存在的条件下，化合物mb与连二亚硫 酸钠进行化学反应制备化合物lmb时，化合物mb与碳酸氢钠的摩尔比为1:1～3，可以 但不限于1:1、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.5、1:2.8或1:3，为了获得更好的效果，化合 物mb与碳酸氢钠的摩尔比为1:1。
[0027]
进一步地，化合物mb与连二亚硫酸钠的摩尔比为1:2～4，可以但不局限于1:2、1:2.2、 1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.5或1:4，为了获得更好的效果，化合物mb与连二亚硫酸 钠的摩尔比为1:3。
[0028]
进一步地，化合物mb与三光气的摩尔比为1:0.1～0.6，可以但不局限于1:0.1、1:0.2、 1:0.25、1:0.28、1:0.3、1:0.32、1:0.35、1:0.4、1:0.5或1:0.6，为了获得更好的效果，
化合物1与三光气的摩尔比为1:0.3。
[0029]
进一步地，化合物mb与化合物1的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物mb与化合物1的摩尔比为1:1。
[0030]
本发明提供的近红外荧光探针mb-so可以用于定量检测超氧阴离子自由基(o2·-)，特别用于细胞水平、小鼠活体水平、小鼠海马组织的o2·-检测，是可视化和定量检测细胞、活体中o2·-水平的有效工具。这能够为o2·-在生物体内的生理病理机制及氧化应激水平提供一种可视化的检测方法，为o2·-与癫痫之间的联系提供了强有力的证据，对于揭示人体内o2·-的生理病理机制具有重要意义。
[0031]
采用本发明的技术方案，优势如下:
[0032]
本发明提供以亚甲蓝为母核的近红外荧光探针mb-so，该探针具有灵敏度高(检测限14nm)、选择性好，响应速度快(30s)的优点。在pbs缓冲液中，荧光强度与o2·-浓度呈现良好的线性关系(0-10μm)，说明探针适合定量检测o2·-；探针mb-so还实现了ht-22细胞中o2·-的荧光成像，也实现了小鼠活体水平内源性o2·-的灵敏检测，且响应快，荧光强度较稳定；更重要的是，借助探针mb-so对癫痫小鼠脑部的o2·-进行荧光成像以及定量检测。在实验过程中发现，癫痫模型小鼠脑部荧光强度与对照组相比显著增加，癫痫小鼠海马组织中o2·-含量为0.840
±
0.140μmolg-1
protein，对照组小鼠海马组织中的o2·-含量为0.095
±
0.019μmolg-1
protein。提示与对照组相比较，癫痫小鼠脑内的o2·-水平显著升高。由此可知，癫痫小鼠脑组织中的氧化应激水平显著提高，氧化应激参与了癫痫的病理进程。
[0033]
由此可见，该探针是可视化和定量检测细胞、活体中o2·-水平的有效工具。这能够为o2·-在生物体内的生理病理机制及氧化应激水平提供一种可视化的检测方法，为o2·-与癫痫之间的联系提供了强有力的证据，对于揭示人体内o2·-的生理病理机制具有重要意义。
附图说明
[0034]
图1是化合物1的1hnmr图谱；
[0035]
图2是荧光探针mb-so的1hnmr图谱；
[0036]
图3是荧光探针mb-so的
13
cnmr图谱；
[0037]
图4是荧光探针mb-so的hrms图谱，calculatedforc
36h35
n3o4ps(m+h)
+
636.2080；found636.2079；
[0038]
图5是荧光探针mb-so与o2·-反应后的hrms图谱，calculatedforc
16h18
n3s(m)
+
284.1221；found284.1216；
[0039]
图6是荧光探针mb-so与ko2反应后的荧光光谱与uv光谱；其中,(a)mb,mb-so和ko2+mb-so溶于pbs缓冲溶液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中的荧光光谱；其中，最上方的曲线为mb，中间曲线为ko2+mb-so，最下方曲线为mb-so；(b)mb存在或不存在时mb-so的吸收光谱，mb，mb-so和ko2+mb-so溶于pbs缓冲溶液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)的紫外吸收光谱；其中，在波长为600nm处，最上方的曲线为mb，中间曲线为ko2+mb-so，最下方曲线为mb-so；
[0040]
图7是探针mb-so与ko2的荧光响应；mb-so(10μm)与ko2(0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,6,8,10,20,30,40,50和60μm)在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中，37℃孵育
5min的荧光光谱；数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝3)；
[0041]
图8是探针mb-so与不同浓度ko2反应的荧光强度变化；(a)mb-so(10μm)在 pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中与不同浓度的ko2(0-60μm)37℃孵育5min 后，在690nm处的荧光强度变化；(b)37℃孵育5min，产生的荧光强度与pbs缓冲液 中(20mm,ph＝7.4,2％dmso)不同浓度ko2(0to 10μm)的线性关系；数据以均数
±
标准差 (mean
±
sd)表示(n＝3)；
[0042]
图9是探针mb-so与ko2反应的时间；(a)mb-so(10μm)和ko2(40μm)在 pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中37℃下孵育0,0.5,1,5,10,15,20,25和30min 的荧光光谱；(b)pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中mb-so(10μm)与ko2(40μm) 在37℃孵育0,0.5,1,5,10,15,20,25和30min的荧光强度变化；数据以均数
±
标准差(mean
±ꢀ
sd)表示(n＝3).
[0043]
图10是ph对mb-so与ko2的影响；(a)mb-so(10μm)与ko2(40μm)在不同 ph缓冲液中(20mm,ph 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5和9.0,2％ dmso)37℃孵育30min的荧光光谱；其中，在波长为700nm处，曲线由高至低依次代表 ph值为4.0逐渐增加至9.0；(b)mb-so(10μm)与ko2(40μm)在不同ph缓冲液中 (20mm,ph 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5和9.0,2％dmso)37℃孵育5min 的荧光响应；
[0044]
图11是探针mb-so对o
2.-的选择性；(a)在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso) 中，mb-so(10μm)和o2·-及各种活性氧(h2o2(200μm),tbhp(200μm),clo-(200 μm),.oh(200μm),1o2(200μm),、活性氮(no(200μm),onoo-(200μm),no
2-(200 μm),no
3-(200μm)在37℃孵育5min的荧光光谱；(b)mb-so(40μm)对ko2(40μm)、各 种活性氧和活性氮在37℃孵育5min的荧光响应。在每一组中，条形图分别代表690nm 处mb-so对ros、rns和含有40μm ko2的ros/rns混合物的荧光响应；1.mb-so+ ko2(40μm)；2.h2o2(200μm)+ko2(40μm)；3.tbhp(200μm)+ko2(40μm)；4.ocl-(200 μm)+ko2(40μm)；5.
·
oh(200μm)+ko2(40μm)；6.1o2(200μm)+ko2(40μm)；7no (100μm)+ko2(40μm)；8.onoo-(200μm)+ko2(40μm)；9.no
2-(200μm)+ko2(40 μm)；10.no
3-(100μm)+ko2(40μm).数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝3)；
[0045]
图12是探针mb-so对o2·-的选择性；(a)mb-so(10μm)在pbs缓冲液(20mm,ph＝ 7.4,2％dmso)中与o2·-和各种活性硫物种(na2s(1mm),gsh(1mm),gsh(10mm), gssg(1mm),s8(1mm),s2o
32-(1mm),so
32-(1mm),so
42-(1mm),ch3sssch3(1 mm),hcy(1mm),l-cys(1mm),d-cys(1mm)37℃孵育5min的荧光光谱；(b)mb-so(40μm) 与ko2(40μm)和各种活性硫37℃孵育5min的荧光响应。在每一组中，条形图分别代表 690nm处mb-so对rss、rss与40μm ko2的混合物的荧光响应；1.mb-so+ko2(40 μm)；2.na2s(1mm)+ko2(40μm)；3.gsh(1mm)+ko2(40μm)；4.gsh(10mm)+ko
2 (40μm)；5.gssg(1mm)+ko2(40μm)；6s8(1mm)+ko2(40μm)；7.s2o
32-(1mm)+ko
2 (40μm)；8.so
32-(1mm)+ko2(40μm)；9.so
42-(1mm)+ko2(40μm)；10.ch3sssch3(1 mm)+ko2(40μm).11.hcy(1mm)+ko2(40μm)；12.l-cys(1mm)+ko2(40μm)；13. d-cys(1mm)+ko2(40μm).数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝3)；
[0046]
图13是探针mb-so对o2·-的选择性；(a)mb-so(10μm)在pbs缓冲液(20mm,ph ＝7.4,2％dmso)中与o2·-和各种各种离子(na
+
(1mm),k
+
(1mm),cu
2+
(1mm),ca
2+ (1mm),mg
2+
(1mm),zn
2+
(1mm),fe
3+
(1mm),fe
2+
(1mm),co
32-(1mm),hco
3-(1mm), br-(1mm),cl-(1mm),i-(1mm),hpo
42-(1mm),h2po
4-(1mm))37℃孵育5min的荧光光 谱；(b)mb-so(40μm)与ko2(40μm)和各种离子37℃孵育5min的荧光响应；在每一组中， 条形图分别代表690nm处mb-so对各种离子、各种离子与40μm ko2的混合物的荧光 响应。1.mb-so+ko2(40μm)；2.na
+
(1mm)+ko2(40μm)；
(2mm,100μldmso)。腹腔注射lps(0.5mg/ml,100μl生理盐水)6h，随后腹腔注射tiron(2mm,100μl生理盐水)1h，再腹腔注射mb-so(2mm,100μldmso)2h。mb-so孵育0min；1min；5min；10min；20min；30min；40min；50min后拍摄图像。定量测定上述各组小鼠腹部荧光发射强度；数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝3)。
[0054]
图21是内源性o2·-的小鼠腹部荧光成像随时间变化的量化曲线；在图中，最上方的曲线为lps+mb-so，中间曲线为mb-so，最下方曲线为lps+tiron+mb-so；
[0055]
图22是小鼠海马组织切片病理学观察；海马ca1、ca3区病理观察，bar＝20μm；
[0056]
图23是小鼠海马组织切片细胞数量统计；海马ca1、ca3亚区细胞计数；数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝6)；**p《0.001vs(a)column,
*
p《0.001vs(c)column；
[0057]
图24是癫痫小鼠脑部o2·-的荧光成像；mb-so显示活体小鼠脑o
2.-水平的荧光图像；(a)对照组小鼠颅内注射探针mb-so(20mm,10μldmso)。(b)癫痫小鼠颅内注射探针mb-so(20mm,10μldmso)；(c)癫痫小鼠颅内注射tiron(20mm,10μldmso)30min,随后颅内注射探针mb-so(20mm,10μldmso)；定量测定上述各组小鼠大脑的相对荧光强度。数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示(n＝3)；**p《0.001vs.(a)column，
#
p《0.05vs.(b)column；
[0058]
图25是癫痫小鼠海马组织中o2·-的含量测定；海马组织中o2·-含量(试验溶液,1％,w/v)分别为0.20μm,0.24μm,0.31μm,0.35μm,0.26μm,0.35μm。海马匀浆总蛋白浓度(1％,w/v)分别为0.29g/l,0.30g/l,0.39g/l,0.33g/l,0.35g/l,0.37g/l；小鼠海马组织o2·-浓度以μmolg-1
protein表达；小鼠海马o2·-浓度分别为0.67μmolg-1
protein,0.80μmolg-1
protein,0.79μmolg-1
protein,1.06μmolg-1
protein,0.74μmolg-1
protein,and0.95μmolg-1
protein；o2.-平均浓度为0.84
±
0.14μmolg-1
protein；数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示；
[0059]
图26是对照组小鼠海马组织中o2·-的含量测定；海马中o2·-含量(试验溶液,1％,w/v)分别为0.05μm,0.019μm,0.027μm,0.034μm,0.025μm,0.022μm；海马匀浆总蛋白浓度(1％,w/v)分别为0.419g/l、0.262g/l、0.296g/l、0.284g/l、0.282g/l、0.262g/l。小鼠海马组织o2·-浓度以μmolg-1
protein表达；小鼠海马o2·-浓度分别为0.119μmolg-1
protein,0.72μmolg-1
protein,0.091μmolg-1
protein,0.120μmolg-1
protein,0.089μmolg-1
protein,and0.083μmolg-1
protein；o2.-的平均浓度为0.095
±
0.019μmolg-1
protein.
具体实施方式
[0060]
通过以下实施例并结合附图对本发明的近红外荧光探针mb-so作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
[0061]
一、实施方法
[0062]
1.1溶液的配制
[0063]
探针mb-so溶液的配制：称取3.36mg探针mb-so，溶于1.32mldmso中，得到10mm的探针溶液以备用。
[0064]
荧光母核mb溶液的配置：称取3.2mg亚甲蓝(mb)，溶于1mldmso中，得到10mm的探针溶液以备用。
[0065]
o2·-溶液配制：无水dmso(9ml)中连续通氮气30min，在氮气条件下，加入ko2(3.2mg)，超声5min，配成终浓度为5mm的溶液，将其稀释成1.0mm-100μm的溶液备用(母液
及稀释液现配现用)。
[0066]
na2s(作为h2s的来源)储备液的配制：向含5mg edta的20mm pbs(10ml,ph ＝7.4)溶液中连续通氮气15min。在氮气条件下，将na2s
·
9h2o(24.0mg,0.1mmol)溶于溶 液中，得到10mm na2s储备液，将其稀释成1.0mm-100μm的溶液备用。na2s
·
9h2o 储备液需要现用现配。
[0067]
l-半胱氨酸(l-cys)储备液的配制：将l-cys(12.1mg,0.1mmol)溶于20mm pbs(10 ml,ph＝7.4)溶液中得到10.0mm的储备液，将储备液稀释成1.0mm和100μm的溶 液备用。d-cys同上。
[0068]
高半胱氨酸(hcy)储备液的配制：hcy(13.50mg,0.1mmol)溶于20mm pbs(10 ml,ph＝7.4)中得到10.0mm的储备液,将储备液稀释成1.0mm和100μm的溶液备用。
[0069]
谷胱甘肽(gsh)储备液的配制：gsh(30.70mg,0.1mmol)溶于20mm pbs(10ml,ph ＝7.4)中得到10.0mm储备液，将储备液稀释成1.0mm的溶液备用。gssg， ch3sssch3，s8，na2s2o3，na2so3，na2so4储备液配制方法同上。
[0070]
其它干扰性物质储存液的配制：ser，pro，val，arg，leu，gly，tyr，phe，met， his，trp，thr，ala，glu，gln，asn，na
+
，mg
2+
，ca
2+
，k
+
，al
3+
，fe
3+
，f-，br-， i-，clo-，scn-，h2po
4-，no
3-，co
32-，hco
3-，ch3coo-，no
2-等参照文献，按照类似 的方法，溶剂使用双蒸水，配制成10.0mm的储存液，避光保存于4℃冰箱中。
[0071]
·
oh通过feⅱ(edta)与h2o2之间的fenton反应获得。no从3-(氨基丙基)1-3
‑ꢀ
羟基-3-异丙基-2-氧代-1-三氮烯(noc-5,50μm/ml)产生。
[0072]
1.2细胞
[0073]
种属和品系：小鼠海马神经元细胞株ht-22。来源：上海盖宁生物科技有限公司。
[0074]
1.3实验动物
[0075]
种属和品系：健康昆明小鼠，体重20-25g。来源：徐州医学科大学实验动物中心。
[0076]
二、实施例
[0077]
2.1近红外荧光探针mb-so的合成
[0078]
以4-羟基苄醇为起始原料，与二苯基膦酰氯发生取代反应生成化合物1；亚甲蓝(mb) 在碳酸氢钠的作用下，与连二亚硫酸钠反应生成还原产物lmb，lmb中间体与化合物1 在三乙胺的作用下，与三光气发生缩合反应得到探针mb-so，其合成路线如下所示。
[0079][0080]
2.1.1化合物1的合成
[0081]
将4-羟基苄醇(124.1mg，1mmol)和0.5ml三乙胺加入至20ml四氢呋喃溶液中， 氮气保护，在25℃条件下反应20min后降至0℃，向所得反应液中滴加二苯基磷酰氯 (236.6mg，1mmol)，反应30min后，升至室温反应24h。反应结束后，加入水15 ml，二氯甲烷(3
×
5ml)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩得到粗 品。粗品通过柱层析纯化(silica,pe:ea,10:1v/v)，得到白色固体226.4mg，产率为 70％。tlc(silica,pe:ea,2:1v/v):rf＝0.5。1h nmr(400mhz,dmso):δ7.88-7.93(m, 4h),7.60-7.64(m,2h),7.52-7.57(m,4h),7.23(s,4h),5.17(t,j＝4.0hz,1h),4.40(d,j＝8.0hz, 2h).如图1所示。
[0082]
2.1.2目标探针mb-so的合成
[0083]
将亚甲基蓝(271.6mg,0.73mmol)中加入7ml二氯甲烷和7ml水，在氩气保护下， 将连二亚硫酸钠(0.38g,2.2mmol)和碳酸氢钠(122.5mg,1.46mmol)缓慢加入到上述 混合溶液中，室温反应20min，直至水相变为黄色。分离有机层，水层用二氯甲烷(2
×
5 ml)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，有机相直接用于下一步反应。
[0084]
在0℃和氮气保护下，将上述含有化合物lmb的有机相快速加入三乙胺(124μl, 0.87mmol)中。将三光气(87.1mg,0.23mmol)溶于二氯甲烷缓慢滴加至上述混合溶液 中，滴加完毕后，反应30min。然后向溶液中加入化合物1(175mg,0.73mmol)和三乙 胺(101μl,0.73mmol)，0℃反应过夜。反应结束后，减压浓缩，加入水20ml，用乙 酸乙酯(3
×
20ml)萃取。粗品通过柱层析(ch2cl2:ch3oh＝100:1-20:1)纯化，得到蓝 白色固体50.6mg。产率为10％。tlc(silica,ch2cl2:ch3oh,30:1v/v):rf＝0.5.如图2、 3和4所示。
[0085]
2.2近红外荧光探针mb-so识别o2·-原理
[0086]
mb-so(6.35mg,0.01mmol)溶于dmso中，加入含有ko2的dmso溶液中，37℃下 反应120min，乙酸乙酯萃取，减压蒸馏，分离产物，通过高分辨质谱确认反应产物，从 而确认探针mb-so与o2·-的反应原理，如图5所示。
[0087]
2.3近红外荧光探针mb-so对o2·-的检测性能研究
[0088]
将探针mb-so用dmso溶解，加入ko2的dmso溶液(以ko2作为o2·-来源)， 在pbs缓冲液(20mm,ph＝7.4,2％dmso)中，于37℃下孵育，测定其荧光强度。每 组数据至少平行三次，结果以mean
±
sd表示。
[0089]
测试条件：荧光测量实验均在室温下用日立f4600荧光分光光度计测定。激发波长 为590nm，激发狭缝宽度10nm，发射狭缝宽度10nm，扫描速度1200nm/min，发射光 谱范围在650-850nm。光电倍增管的电压设为900v。
[0090]
2.4近红外荧光探针mb-so对o2·-的检测限的测定
[0091]
探针mb-so自身的荧光强度测定10次，计算10次测定的荧光强度的标准偏差，再 将探针与ko2(0-10μm)反应，得到ko2浓度与荧光强度的线性方程。检测限的计算公式 为：3σ/k。k代表荧光强度与ko2浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。
[0092]
2.5紫外光谱的测定
[0093]
uv光谱采用uv-2401pc紫外-可见分光光度计测定。将探针mb-so加入石英比色 皿中，加入20mm磷酸盐缓冲液将其稀释后，加入与ko2(40μm)孵育，进行全波长扫 描，测定其吸收光谱。
[0094]
2.6ht-22细胞的复苏、培养、传代和冻存
[0095]
2.6.1ht-22细胞的复苏
[0096]
在液氮罐中迅速取出细胞冻存管，放入37℃温水中，以“o”形画圈快速晃动冻存 管，使细胞冻存液在1-2min内融化。待细胞冻存液融化后，冻存管外部喷洒75％酒精消 毒，在超净台内转移到15ml无菌离心管内，补加2ml dmem高糖完全培养基，封口 后，放入离心机中，设置800rpm离心3min，消毒后拿入超净台内，倒掉上清液。用2 ml dmem高糖完全培养基加入离心管内，用巴氏吸管轻轻吹打，混匀细胞。在细胞培 养瓶中加入dmem高糖完全培养基4ml，用巴氏吸管将细胞悬液转移至细胞培养瓶 中。为了使细胞分散均匀，将细胞瓶以“十”字形水平轻轻晃动，可在显微镜下进行观 察，混匀后置于37℃，5％co2培养箱中培养，第二天待细胞完全贴壁后进行半量换 液。
[0097]
2.6.2ht-22细胞的培养
[0098]
ht-22细胞为贴壁生长细胞，在含有10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml 链霉素的dmem高糖培养基中，置于37℃，5％co2培养箱中进行培养。当细胞生长至 80％以上进行传代操作，所有操作均在超净台中完成，培养时注意细胞密度和状态。
[0099]
2.7探针mb-so的细胞毒性实验
[0100]
采用mtt法测定探针mb-so的细胞毒性。取对数生长期的ht-22细胞以3-5
×
10
4 cells/ml的密度接种于96孔板中，每孔100μl，将培养板在培养箱中培养(37℃，5％ co2)。细胞培养瓶在倒置荧光显微镜下观察，待ht-22细胞完全贴壁后，可进行实验。 实验准备：将探针mb-so储存液用dmem高糖培养基稀释不同浓度(0μm，5μm，10 μm，15μm，20μm)，待用。用1ml注射器吸弃孔中培养基，向每孔中加入100μl不 同浓度的探针，每个浓度设置6个复孔，继续培养24h。在相同处理条件下，以没有添 加探针的作为对照孔，用空白孔(培养基+mtt)校准吸光度值，每个孔中加入10μlmtt 染料(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，5mg/ml，溶于pbs缓冲液中)， 继续在37℃条件下孵育4h。随后除去剩余的mtt溶液，并向各孔中加入150μl的 dmso以溶解甲瓒结晶。摇床震荡10min后，用酶标仪测量570nm的吸光度。利用相同 的方法，检测了探针mb-so(10μm)在0h、6h、12h、18h、24h内的细胞存活率，每孔加 入相同浓度的探针培养液。每个样品重复三次，整个实验重复三次。各组细胞存活率计 算公式为：细胞相对存活率＝(实验孔od值-空白孔od值)/(对照孔od值-空白孔od 值)
×
100％。最终处理数据，绘制曲线。
腹腔注射生理盐水0.2ml，单独观察小鼠行为进行记录。
[0117]
模型组：健康成年昆明小鼠18只，实验前一周使动物适应实验环境，置于自然昼夜 节律光照条件下分笼群养，温度为(22
±
2)℃，湿度为50
±
10％，自由摄食饮水。每只小 鼠按50mg/kg ptz(5mg/ml,0.2ml)溶液进行腹腔注射，单独观察小鼠行为60min，记 录小鼠癫痫发作情况，并基于racine标准评估发作级别
[76]
。每隔一天注射一次，连续五 次二级以上发作即为点燃成功。
[0118]
动物行为学判定
[0119]
0级：无反应，突然的行为停止或者凝视
[0120]
1级：嘴角，面部或者眼睛抽动，多动，不安
[0121]
2级：点头，头部和肌肉痉挛
[0122]
3级：单侧或双侧肢体痉挛
[0123]
4级：前肢痉挛性发作
[0124]
5级：伴有跌倒的全身痉挛性发作
[0125]
实验过程中，用相机拍摄小鼠发作过程。
[0126]
3.1.2癫痫小鼠脑部成像
[0127]
造模结束后6h内，将探针mb-so注射至小鼠海马组织部位，利用活体成像仪对小 鼠脑部进行成像。小鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.1ml)，待小鼠麻醉后，将其头部固定 于小鼠专用脑立体定位仪上，耳杆放置于小鼠外耳道。减去头部毛发，碘伏消毒。沿矢 状缝切开小鼠头皮约1cm切口，暴露颅骨前囟和正中线后定标。参照第二版《the mousebrain in stereootaxic coordinates》预定进针坐标：前囟后方1.74mm处，两侧旁开1.5 mm，用仪器配套的骨钻钻出小孔，微量注射器进针深度2.06mm。对照组与模型组以相 同方式注射探针mb-so(20mm,10μl)，以0.5μl/min的速度匀速将探针注射至海马组织 中，留针10min，缓慢出针。立即于活体成像仪中进行成像，拍摄完毕后，头皮表面碘 伏消毒后进行缝合，适当涂抹抗生素阿莫西林粉末防止小鼠感染。
[0128]
采用night owl iilb 983小动物活体成像仪进行成像。成像条件：激发波长630 nm，发射波长700nm。采用indigo软件进行图像和数据分析。
[0129]
3.1.3小鼠取材
[0130]
造模结束后，随机选取癫痫小鼠及对照小鼠进行取材。用10％水合氯醛溶液作为麻 醉剂，腹腔注射水合氯醛将小鼠麻醉后，用剪刀剪开腹部皮下组织打开腹腔，沿着腹部 剪至胸腔，暴露出膈肌，用剪刀尖锐处将膈肌划开一个小口，造成气胸，暴露出跳动的 心脏，注射器吸取100ml生理盐水，从小鼠心尖处将注射器针头轻插入左心室到升主动 脉，用止血钳夹住，同时剪开右心耳，对其进行灌注冲洗体循环，注意控制流速先慢后 快，直到心脏右心耳处流出无色液体。换用4％多聚甲醛溶液约100ml继续灌注，小鼠 尾巴立即翘起，四肢转动至逐渐僵硬，灌注完成。剪刀断头取脑，用镊子小心剥离脑组 织，将其浸入4％多聚甲醛溶液中固定，放置于4℃冰箱待用。
[0131]
3.1.4he染色
[0132]
(1)将固定后的标本切块，用酒精梯度处理进行脱水。顺序为50％酒精1h，70％酒 精1h，80％酒精过夜，第二天早上无水酒精1h，90％酒精1h，无水酒精50min，二甲 苯1h，二甲苯1h，标本脱水完毕。
[0133]
(2)进行石蜡包埋，整个操作在包埋机中进行。将蜡块高温溶解后，倒入模具中，浸 入标本，待蜡油冷却后取出蜡块，放入冰箱冷冻24h，取出蜡块进行冠状切片，至海马 组织，厚度约3μm。
[0134]
(3)常规用二甲苯脱蜡溶液，再经乙醇溶液至水洗：依次顺序为二甲苯ⅰ10min、二 甲苯ⅱ10min、无水乙醇ⅰ5min、无水乙醇ⅱ5min、95％酒精5min、90％酒精5min、 80％酒精5min、70％酒精5min、蒸馏水洗。
[0135]
(4)切片放入苏木素溶液染色5min,用蒸馏水洗；1％盐酸酒精分化数秒，再次蒸馏 水洗；0.6％氨水反蓝，蒸馏水洗。
[0136]
(5)将切片放入伊红染色液中2min。
[0137]
(6)脱水封片，将切片依次放入95％酒精ⅰ5min、95％酒精ⅱ5min、无水乙醇ⅰ5 min、无水乙醇ⅱ5min、二甲苯ⅰ5min、二甲苯ⅱ5min中，脱水至透明。
[0138]
(7)切片晾干后，显微镜观察，中性树胶封片。
[0139]
(8)显微镜观察，图像采集，将切片进行全景扫描，caseviewer观察各组小鼠海马 ca1,ca3,dg区神经细胞的染色情况进行分析。
[0140]
3.1.5癫痫小鼠海马组织中o2·-的含量检测
[0141]
小鼠颈部脱臼后，用剪刀断头，利用镊子小心剥开头颅取出大脑，在冰板分离海马 组织。将海马组织称重分别加入9体积(w/v)的100mm的pbs溶液后，立刻匀浆，4℃ 离心12000rpm/min，以上所有操作均在冰浴条件下进行。
[0142]
取癫痫海马组织上清液，用内标法(ko2为内标物，x，x+0.1，x+0.2，x+0.4， x+0.5μm)，取对照小鼠海马组织上清液，用内标法(ko2为内标物，x，x+0.05， x+0.1，x+0.15，x+0.2μm)，测定海马组织o2·-含量。用bca试剂盒测定海马组织总 蛋白浓度。40μl的5％癫痫小鼠海马组织匀浆上清液(终浓度为1％，v/v)加入ep管中， 再加入136μl的pbs缓冲液和双蒸水(20，19.8，19.6，19.2和19.0μl)，接着加入0， 0.2，0.4，0.8和1.0μl的ko2原液(100μm)作为内标，紧接着加入4μl 500μm的探 针(终浓度为10μm)。在37℃下孵育5min，测定荧光强度。零点是通过加入2μl，50 mm(终浓度为500μm)钛铁试剂配得的(钛铁试剂清除组织中内源性o2·-)。对照组方 法同上。1％匀浆中o2·-浓度通过标准曲线计算得到。海马中的o2·-含量以μmol g-1
protein 表示，每个样本至少平行测定三次(mean
±
sd)。
[0143]
小鼠海马组织总蛋白的测定：采用bca说明书上的方法进行测定。用0.5mg/ml标 准蛋白，加生理盐水配制标曲蛋白浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的溶液(n＝3)。取10％上清液，稀释至20倍后进行测定。bca工作液的配制(现 配现用)：试剂a、试剂b(50:1，v/v),预计标曲加样品量，充分混匀。每孔加200μl bca工作液。室温孵育20-30min。用酶标仪测定a
562
，绘制标曲，利用标曲计算蛋白的 总浓度。
[0144]
荧光测试条件：激发波长为590nm，狭缝5.0nm，5.0nm，电压800v，扫描范围 500-850nm，扫描速度1200nm/min
[0145]
3.2数据处理
[0146]
数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，使用spss软件进行统计分析。多组间比较 采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way anova)。p＜0.05表示差异有统计学意 义。
[0147]
三、效果验证
[0148]
3近红外探针mb-so对o2·-的检测性能研究
[0149]
3.1荧光探针mb-so与o2·-反应的荧光光谱与紫外光谱
[0150]
首先，我们检测探针mb-so与o2·-反应后的荧光光谱与uv光谱发生的变化。从图 6a可知，探针mb-so本身没有荧光，与o2·-(40μm)反应后产生明显的荧光，其最大 发射波长为690nm。这与荧光母核mb的荧光光谱一致。由图6b可知，探针几乎无紫外 吸收，与o2·-反应完后最大紫外吸收峰在670nm，与文献报道的亚甲蓝(mb)紫外吸收 峰一致。探针mb-so与o2·-反应之后主产物的高分辨如图5所示，与mb(284.1221)的 分子量相同，结合荧光光谱及紫外吸收光谱，可以验证探针mb-so的识别机理。
[0151]
3.2荧光探针mb-so与o2·-反应的线性关系以及检测限
[0152]
为了考察探针mb-so是否适用于生物样本中o2·-的定量检测，mb-so与不同浓度 的o2·-(0-60μm)孵育，探讨荧光强度与o2·-浓度之间的关系。在上述优化条件下，探针 mb-so与o2·-反应的荧光光谱如图7所示，未加入o2·-之前，探针几乎无荧光；而当探针 mb-so与不同浓度的o2·-(0-60μm)孵育后，在690nm处的荧光强度随着o2·-浓度的增 强而逐渐增强(35倍)。mb-so与o2·-的反应比例为1:4时，荧光强度达到峰值，反应 趋于饱和。并且o2·-在0-10μm范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系(图8)。在pbs 缓冲液中，探针mb-so检测o2·-的检测限为14nm，其检测灵敏度高于已报道的大部分 荧光探针。上述结果显示探针mb-so具有较好的检测灵敏度，能够定量检测复杂生物体 内o2·-含量。
[0153]
3.3荧光探针mb-so与o2·-的反应时间
[0154]
如图9所示，探针mb-so加入o2·-后立即响应，荧光强度在30s左右达到峰值。随 着时间的增加，荧光强度稳定。反应时间30min内，荧光强度未见减弱。以上结果说明 探针mb-so与o2·-响应迅速，而且荧光强度稳定。
[0155]
3.4荧光探针mb-so与o2·-反应ph的影响
[0156]
为了研究ph对探针mb-so检测o2·-的影响，将探针mb-so和o2·-在不同ph条件 下孵育。如图10所示，mb-so在ph 4.0-9.0的范围内具有良好的荧光响应。结果表明， 探针mb-so适用于生理条件下(ph 7.4)o2·-的定量检测。
[0157]
3.5荧光探针mb-so检测o2·-的选择性
[0158]
由于生物背景的复杂性，探针mb-so需要具有较高的选择性，来实现对o2·-的精确 检测。如图11所示，探针mb-so与o2·-孵育会产生较强的荧光响应，但与其他活性氧和 活性氮物质(如h2o2、tbhp、clo-、
.
oh、1o2、no、onoo-、no
2-、no
3-、)均不能引 起探针的荧光响应。随后我们进一步验证活性硫、氨基酸、无机盐是否影响探针mb-so 与o2·-发生荧光响应，结果表明探针与干扰物质一起孵育时，均不能引起探针的荧光响应。 如图12、13、14所示，探针与含硫物质(na2s、gsh、gsh、gssg、s8、s2o
32-、so
32-、 so
42-、ch3sssch3、hcy、l-cys、d-cys)，无机盐离子(na
+
、k
+
、cu
2+
、ca
2+
、mg
2+
、 zn
2+
、fe
3+
、fe
2+
、co
32-、hco
3-、br-、cl-、i-、hpo
42-、h2po
4-),氨基酸(thr、phe、 ser、glu、gly、lys、arg、his、tyr、val、ala、pro)孵育，均未见荧光响应。由上述结 果可知，探针mb-so可以在复杂的生理环境中特异性识别o2·-。
[0159]
4细胞水平o2·-荧光成像
[0160]
在细胞成像之前，需要进行mtt测定以评估探针对细胞的毒性。本专利以小鼠海马 神经元ht-22为检测的细胞株。如图15所示，不同浓度的探针(0μm,5μm,10μm,15μm,20 μm)与ht-22细胞孵育24h，细胞存活率仍在90％左右(p《0.05)，说明探针mb-so毒 性很低，而且在10μm浓度下，不会影响细胞的正常形态。
[0161]
接下来，检测了探针mb-so(10μm)在0h、6h、12h、18h、24h内的细胞存活率， 结果显示(图16)探针mb-so在10μm的浓度下，与细胞孵育0-24h，不会影响细胞的 正常状态，存活率达到90％左右。
[0162]
之后考察了mb-so能否实现o2·-的细胞荧光成像。将ht-22细胞与探针mb-so在 37℃下孵育20min，几乎没有荧光响应(图17，a)。脂多糖(lps，lipopolysaccharide) 和佛波酯(pma，phorbol-12-myristate-13-acetate)可刺激细胞产生活性氧，因此，将细 胞与lps或者pma孵育，以此来诱导细胞内源性o2·-的产生。将细胞提前1h孵育lps 后，再与探针孵育20min，可观察到明亮的红色荧光(图17，b)。将细胞提前30min孵 育pma后，再与探针孵育20min，也可观察到红色荧光(图17，c)。随后，将细胞与 lps孵育1h后，再用钛铁试剂(tiron：o2·-清除剂)孵育20min，再与探针孵育，荧光 强度显著降低(图17，d)。最后，将细胞与pma孵育1h后，用钛铁试剂孵育20min， 再与探针孵育，同样可观察到荧光强度显著降低(图17，e)。实验结果说明图17(b，c) 中的红色荧光是由内源性o2·-引起的。上述结果表明，探针mb-so能够实现细胞内源性 o2·-的荧光成像。由图18可知，细胞在整个拍摄过程中形态良好。
[0163]
5活体水平o2·-荧光成像
[0164]
本专利进一步研究了探针mb-so在小鼠体内进行o2·-检测的可行性。将昆明小鼠随 机分组。对照组：小鼠腹腔注射探针mb-so。第二组:小鼠腹腔注射lps后，再腹腔注射 mb-so。第三组：小鼠腹腔注射pma后，腹腔注射探针mb-so。第四组(抑制剂组)： 腹腔注射lps后，再腹腔注射钛铁试剂(tiron，o2·-清除剂)，最后腹腔注射探针mb-so。 第五组(抑制剂组)：腹腔注射pma后，再腹腔注射钛铁试剂(tiron，o2·-清除剂)，最 后腹腔注射探针mb-so。使用night owl iilb 983小动物活体成像系统进行荧光成像。 实验结果表明，只注射探针的小鼠，几乎未见荧光(图19，a)。与对照组相比较，腹腔 注射lps或者pma后再注射探针，可见荧光强度显著增加(13倍，12.3倍)(图19，b， c)。这说明探针mb-so可以检测小鼠体内的o2·-。当小鼠腹腔注射lps或pma后，腹 腔注射钛铁试剂(tiron)，再注射探针，荧光强度显著降低(图19，d，e)。由此说明， 图19(b,c)中的明亮荧光是由lps或pma诱导的内源性o2·-引起的荧光信号。说明探 针mb-so具有较高的检测灵敏度，可以检测活体水平内源性o2·-。
[0165]
之后，本专利又继续考察了内源性o2·-与探针反应时间对荧光强度的影响。小鼠腹腔 注射lps，6h后腹腔注射探针mb-so，并于不同时间点(0,1,5,10,20,30,40,50min)记 录荧光图像(图20，图21)。实验结果表明，小鼠腹部1min左右即可见明亮的荧光，15min 内下降较为缓慢，荧光强度趋于稳定的状态。上述结果说明在活体水平，探针mb-so与 o2·-反应较快，且荧光信号稳定，有利于活体水平的o2·-检测。
[0166]
6探针mb-so检测癫痫小鼠海马组织中的o2·-水平
[0167]
6.1戊四唑点燃癫痫小鼠海马组织he染色结果
[0168]
由以下结果(图22)可观察到对照组小鼠海马ca1区细胞呈带状分布，排列紧密， 形态正常，神经元包核清晰可见，未见异常结构。ptz点燃癫痫小鼠海马ca1区与对照 组相比，形态变化不明显，但细胞数量上具有统计学差异(p《0.05)。对照组小鼠海马 ca3区细胞同样清晰可见，未见神经元凋亡，排列较整齐。ptz点燃癫痫小鼠海马ca3 区细胞数量与对照组小鼠海马相比明显减少(图23)，具有统计学差异(p《0.05)，且 部分胞体变形，细胞排列分散，出现神经元凋亡。该结果与文献中ptz点燃模型结果一 致，海马组织区域神经元细
化应激参与了癫痫的病理进程。
[0175]
表1鼠海马组织o
2.-含量(n＝6)
[0176][0177]a用探针mb-so测定癫痫小鼠海马o
2.-水平；
[0178]b用探针mb-so测定对照组小鼠海马o2.-水平；
[0179]
数据以均数
±
标准差表示.**p《0.001vs sample b。
[0180]
本发明以亚甲蓝为母核的近红外荧光探针mb-so，该探针具有灵敏度高(检测限 14nm)、选择性好，响应速度快(30s)的优点。在pbs缓冲液中，荧光强度与o2·-浓度 呈现良好的线性关系(0-10μm)，说明探针适合定量检测o2·-；探针mb-so还实现了ht-22 细胞中o2·-的荧光成像，也实现了小鼠活体水平内源性o2·-的灵敏检测，且响应快，荧光 强度较稳定；更重要的是，借助探针mb-so对癫痫小鼠脑部的o2·-进行荧光成像以及定 量检测。结果表明，癫痫模型小鼠脑部荧光强度与对照组相比显著增加，癫痫小鼠海马组 织中o2·-含量为0.840
±
0.140μmol g-1
protein，对照组小鼠海马组织中的o2·-含量为0.095
±ꢀ
0.019μmol g-1
protein。提示与对照组相比较，癫痫小鼠脑内的o2·-水平显著升高。说明癫 痫小鼠脑组织中的氧化应激水平显著提高，氧化应激参与了癫痫的病理进程。
[0181]
由此可见，该探针是可视化和定量检测细胞、活体中o2·-水平的有效工具。这能够为 o2·-在生物体内的生理病理机制及氧化应激水平提供一种可视化的检测方法，为o2·-与癫 痫之间的联系提供了强有力的证据，对于揭示人体内o2·-的生理病理机制具有重要意义。
[0182]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本 发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所 记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。