一种透明质酸填充剂的制备方法与流程

1.本发明属于材料科学领域，具体地，涉及一种透明质酸填充剂的制备方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，ha)又名玻尿酸，是由d
‑
葡萄糖醛酸和n
‑
乙酰氨基葡萄糖交替排列构成的长链高分子黏多糖，广泛分布于人体各部位，具有良好的亲水性、黏弹性、润滑性和生物相容性，将ha结构进行化学修饰制备的交联透明质酸钠凝胶在医学美容领域应用广泛，市场上常见的用于美容填充的在售产品有：restylane、juv
é
derm等品牌。但是，交联透明质酸钠凝胶填充剂在体内维持时间一般是6
‑
12个月，逐渐被人体吸收，为了保持填充效果需要多次注射。
3.将具有较长降解周期的微球与交联透明质酸钠凝胶载体混合，制备含微球的交联透明质酸填充剂可以解决交联透明质酸钠凝胶填充剂体内维持时间短的问题。此类填充剂注射入人体后，随着交联透明质酸凝胶的降解，微球逐渐暴露并被成纤维细胞包裹，进而纤维增生，形成稳定的无疤痕组织的胶原蛋白(主要为i型)，此种包裹作用将持续至微球完全降解，因此保证了较长的填充效果。
4.目前常用的微球材料有聚己内酯、聚乳酸等，其中，聚己内酯有更好的生物相容性，且降解更缓慢，较聚乳酸微球在注射后不会明显降低ph，因而就有更好的应用前景。聚己内酯(polycaprolactone，pcl)是一种有机高分子聚合物，属于聚合性聚酯。其外观为白色固体粉末，无毒，不溶于水，易溶于多种极性有机溶剂。聚己内酯是经美国食品药品监督局批准的聚酯，具有优异的生物相容性、形状记忆性和生物可降解性，广泛被用于组织工程领域。自上世纪80年代开始就有相应的药物和手术缝线的临床应用(如capronor、synbiosys及monocryl等)。
5.目前微球与交联透明质酸混合使用时，混合效果很难得到保证，微球容易聚集、颗粒不均一、高温灭菌时发生熔合，导致推注过程中堵塞针头、注射至人体引起排异反应。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种透明质酸填充剂的制备方法。
7.具体来说，本发明涉及如下方面：
8.1、一种透明质酸填充剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
9.将干燥的第一透明质酸或其盐与干燥的可降解聚合物微球混合均匀得到起始原料；
10.将所述起始原料使用交联剂进行交联，纯化，制粒得到含有微球的透明质酸凝胶；
11.将所述含有微球的透明质酸凝胶进行纯化，灌装，灭菌得到透明质酸填充剂。
12.2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第一透明质酸或其盐与所述可降解聚合物微球的质量比为1:0.01～1:1。
13.3、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂与第一透明质酸或其盐的质
量比为0.5～4:100。
14.4、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自二缩水甘油醚、二乙烯基砜、1,2,7,8
‑
二环氧辛烷、1,3
‑
二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种或两种以上。
15.5、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述第一透明质酸或其盐的分子量为800～3000kda。
16.6、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述可降解聚合物微球通过以下步骤制备：
17.将可降解聚合物原料溶于有机溶剂，得到第一溶液；
18.将所述第一溶液分散至包含第二透明质酸或其盐和透明质酸酶的第二溶液中，得到微球反应体系；
19.去除所述微球反应体系中的有机溶剂，得到可降解聚合物微球粗品；
20.将所述聚合物微球粗品洗涤、干燥，得到可降解聚合物微球。
21.7、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述可降解聚合物选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙丙交酯、聚丙交酯
‑
己内酯共聚物中的一种，优选所述第一溶液中可降解聚合物的含量为0.5％～12％。
22.8、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃中的一种或两种以上。
23.9、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述微球反应体系中透明质酸的含量为0.1mg/g～10mg/g，优选为1mg/g～10mg/g，优选所述微球反应体系中透明质酸的分子量为500～3000kda，进一步优选为600～2200kda。
24.10、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述微球反应体系中透明质酸酶的含量为10～800iu/ml，优选为100～650iu/ml。
25.11、根据项6所述的制备方法，其特征在于，将所述第一溶液分散至包含透明质酸和透明质酸酶的第二溶液中的方式为超声波雾化喷射，优选将所述第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为1～200μm。
26.12、根据项6所述的制备方法，其特征在于，去除所述微球反应体系中的溶剂的步骤中，通过加热的方式实现溶剂的去除，其中加热温度为25～50℃。
27.13、根据项1
‑
12中任一项所述的方法制备得到的透明质酸填充剂。
28.相对于现有技术，本发明的透明质酸填充剂具有以下有益效果：
29.1、本发明将微球与透明质酸或其盐在干粉状态下混合，可以在较短时间内将物料混匀，避免了因ha遇水形成凝胶团导致的混合不均匀、不彻底的状况，有效避免微球聚集，并缩短混合均匀的时间。
30.2、本发明制备的含有微球的透明质酸填充剂可以适用湿热灭菌，且灭菌后微球不变形、不聚集、不熔合，解决了目前该类产品因上述问题只能射线灭菌的弊端。
31.3、本发明制备得到的透明质酸填充剂将微球交联包封在交联透明质酸凝胶中，微球会随着交联透明质酸的降解缓慢释放，有效延长了微球发挥胶原刺激剂作用的时间，其填充效果可长达2～4年。
附图说明
32.图1为实施例1得到的透明质酸填充剂灭菌前后显微镜照片。
33.图2为对比例2得到的透明质酸填充剂灭菌前后显微镜照片。
具体实施方式
34.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
35.除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
36.本发明提供一种透明质酸填充剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
37.将干燥的第一透明质酸或其盐与干燥的可降解聚合物微球混合均匀得到起始原料；
38.将所述起始原料使用交联剂进行交联，纯化，制粒得到含有微球的透明质酸凝胶；
39.将所述含有微球的透明质酸凝胶进行纯化，灌装，灭菌得到透明质酸填充剂。
40.在一个具体的实施方式中，所述第一透明质酸或其盐与所述可降解聚合物微球的质量比为1:0.01～1:1。例如可以为1:0.01、1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1。
41.在一个具体的实施方式中，所述交联剂与第一透明质酸或其盐的质量比为0.5～4:100，例如可以为0.5:100、1:100、2:100、3:100、4:100。
42.在一个具体的实施方式中，所述交联剂选自二缩水甘油醚、二乙烯基砜、1,2,7,8
‑
二环氧辛烷、1,3
‑
二环氧丁烷和三偏磷酸钠中的一种或两种以上。
43.其中，透明质酸，又称玻尿酸，分子式是(c
14
h
21
no
11
)n，是d
‑
葡萄糖醛酸及n
‑
乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖。透明质酸是一种酸性粘多糖，目前透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。
44.在一个具体的实施方式中，所述第一透明质酸或其盐的分子量为800～3000kda，例如可以为800kda、1000kda、1200kda、1500kda、1800kda、2000kda、2200kda、2500kda、2800kda、3000kda。
45.本发明的可降解聚合物微球粒径需要具备比较集中的粒度分布，例如需要控制平均粒径
±
10μm的微球占比达90％以上，这样能够保证所制备得到的透明质酸填充剂更加均一，易于使用。至于聚合物微球的平均粒径可以根据需要选择不同的尺寸，例如可以为3～60μm。可降解聚合物微球还需要有比较高的纯度，不含其它杂质。而传统的乳化
‑
固化法制备的微球通常使用吐温、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等乳化剂，所得微球不易洗涤，不可避免的存在乳化剂残留的问题，无法满足制备透明质酸填充剂的要求。在一个优选的实施方式中，所述可降解聚合物微球通过以下步骤制备：
46.将可降解聚合物原料溶于有机溶剂，得到第一溶液；
47.将所述第一溶液分散至包含第二透明质酸或其盐和透明质酸酶的第二溶液中，得到微球反应体系；
48.去除所述微球反应体系中的有机溶剂，得到可降解聚合物微球粗品；
49.将所述聚合物微球粗品洗涤、干燥，得到可降解聚合物微球。
50.其中，本文所用的“可降解聚合物”是在使用期内能保证性能不变，但废弃后能在自然环境下迅速降解的高分子材料。其目的在于保护环境，防止公害。
51.在一个具体的实施方式中，所述可降解聚合物选自聚乳酸、聚己内酯、聚乙丙交酯、聚丙交酯
‑
己内酯共聚物中的一种。
52.聚乳酸，又称聚丙交酯，是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，是一种新型的生物降解材料。聚乳酸的热稳定性好，加工温度170～230℃，有好的抗溶剂性，可用多种方式进行加工，如挤压、纺丝、双轴拉伸，注射吹塑。由聚乳酸制成的产品除能生物降解外，生物相容性、光泽度、透明性、手感和耐热性好。
53.聚己内酯是一种有机高分子聚合物，化学式为(c6h
10
o2)n，具有在芳香化合物、酮类和极性溶剂中很好地溶解的性质。是由ε
‑
己内酯在金属有机化合物(如四苯基锡)做催化剂，二羟基或三羟基做引发剂条件下开环聚合而成，属于聚合型聚酯，其分子量与歧化度随原料的种类和用量不同而异。
54.聚乙交酯或聚乙醇酸(pga)是一种生物可降解性的,热塑性的聚合物而且是最简单的线性脂肪族聚酯。它从乙醇酸通过缩聚或开环聚合制备。pga自从1954年以来作为一种坚韧的纤维聚酯为人所熟知。由于它的水解不稳定性，它的使用还限制在低级的范畴。目前聚乙交酯和它的共聚物聚乙丙交酯和聚乙己内酯,和聚(乙交脂
‑
co
‑
三亚甲基碳酸酯)正广泛用于合成的可吸收缝线材料，在生物医学领域具有极高价值。
55.所述有机溶剂可以选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃中的一种或两种以上。
56.在一个具体的实施方式中，所述第一溶液中可降解聚合物的含量为0.5％～12％，例如可以为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％。
57.本发明所述的第二溶液为包含第二透明质酸和透明质酸酶的水溶液。
58.透明质酸酶(hyaluronidase，haase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸的酶类的总称。透明质酸酶是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶，能够作用于透明质酸糖链的β
‑
1，3或β
‑
1，4糖苷键来降解透明质酸。此外还在一定程度上能够降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。haase首次发现于1929年，duran reynals等在哺乳动物睾丸及其他组织提取物中发现了一种可促进疫苗、染料、毒素等扩散的“扩散因子”，并于1940年被chain等正式命名为透明质酸酶。
59.由于透明质酸具有一定的粘度，可以改变水相第二溶液的表面张力，在将有机相第一溶液分散到水相第二溶液中时，透明质酸溶液(即第二溶液)充当连续相，可以使第一溶液充分分散，具有稳定的乳化作用，避免了传统乳化剂如吐温、聚乙烯醇、聚乙烯吡络烷酮等的使用。而透明质酸酶的加入可以在制备方法进行的同时将透明质酸降解，逐渐降低连续相粘度，混悬液不起泡，易洗涤。
60.本发明所述的第二溶液在配制完成后，透明质酸酶对透明质酸不断进行降解，因此，所述第二溶液中透明质酸的含量及分子量都在不断减小。所以需要控制微球反应体系
(即第一溶液分散到第二溶液中之后形成的体系)中透明质酸的含量、分子量，以及透明质酸酶的含量。
61.在一个具体的实施方式中，所述微球反应体系中第二透明质酸或其盐的含量为0.1mg/g～10mg/g，即在制备可降解聚合物微球起始时，所述第二溶液中第二透明质酸或其盐的含量保持在0.1mg/g～10mg/g之间，例如可以为0.1mg/g、0.5mg/g、1mg/g、2mg/g、3mg/g、4mg/g、5mg/g、6mg/g、7mg/g、8mg/g、9mg/g、10mg/g，优选为1mg/g～10mg/g。
62.在一个具体的实施方式中，所述微球反应体系中第二透明质酸或其盐的分子量为500～3000kda，即在制备可降解聚合物微球起始时，所述微球反应体系中第二透明质酸或其盐的分子量为500～3000kda，例如可以为500kda、600kda、700kda、800kda、900kda、1000kda、1500kda、2000kda、2500kda、3000kda，优选为600～2200kda。
63.在一个具体的实施方式中，所述微球反应体系中透明质酸酶的含量为10～800iu/ml，例如可以为优选为10iu/ml、50iu/ml、100iu/ml、200iu/ml、300iu/ml、400iu/ml、500iu/ml、600iu/ml、700iu/ml、800iu/ml，优选为100～650iu/ml。
64.将所述第一溶液分散至包含第二透明质酸或其盐和透明质酸酶的第二溶液中的步骤中可以采用现有技术中任何已知的方式，比如滴加、超声波雾化等。
65.在一个优选的实施方式中，将所述第一溶液分散至包含第二透明质酸或其盐和透明质酸酶的第二溶液中的步骤中，将所述第一溶液采用超声波雾化喷射的方式分散至第二溶液中。其中，超声波雾化喷射可以通过超声波雾化器实现。
66.在一个具体的实施方式中，将所述第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为1～200μm，例如可以为1μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm、200μm。
67.去除所述微球反应体系中的溶剂的步骤中，可以采用自然挥发，也可以通过加热的方式实现溶剂的去除，其中加热温度为25～50℃。
68.上述制备方法得到的的可降解聚合物微球颗粒均一且分散，粒度分布非常集中，易于洗涤。
69.本发明制备的透明质酸填充剂可以适用湿热灭菌，且灭菌后微球不变形、不聚集、不熔合，解决了目前该类产品因上述问题只能射线灭菌的弊端。有效延长了微球发挥胶原刺激剂作用的时间，其填充效果可长达2～4年。
70.实施例
71.下述实施例中所用透明质酸及透明质酸酶均来自华熙生物科技股份有限公司。
72.实施例1
73.(1)聚己内酯微球的制备
74.称取聚己内酯1g(60kda)，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。称取0.1g透明质酸(透明质酸的分子量为1000kda)作为第二透明质酸溶于100g水中(透明质酸含量为1mg/g)，加入10000iu的透明质酸酶，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米。在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤2次，上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为38μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占91％。
75.(2)透明质酸填充剂的制备
76.称取1g透明质酸(2000kda)作为第一透明质酸，步骤(1)中制备的聚己内酯微球0.2g，混合均匀(ha：pcl＝1:0.2)，加入到7g 1％的氢氧化钠溶液中(其中交联剂1，4
‑
丁二醇二缩水甘油醚bdde含量为0.51％)混合均匀，进行联，交联剂与第一透明质酸或其盐的质量比为3.6:100。控制温度30℃，反应20h得到含有微球的透明质酸凝胶。后将含有微球的透明质酸凝胶切块，使用磷酸盐氯化钠缓冲液纯化，制粒，灌封，湿热灭菌得透明质酸填充剂。
77.实施例2
‑478.实施例2
‑
4与实施例1的不同在于，聚己内酯微球的质量不同，其他反应条件和实施例1相同。具体地，在实施例2中，聚己内酯微球的质量为0.05g；在实施例3中，聚己内酯微球的质量为0.01g；在实施例4中，聚己内酯微球的质量为1g。具体地，主要反应参数如表1所示。
79.实施例5
‑680.实施例5与实施例1的不同在于，第一透明质酸的分子量为800kda，其他反应条件和实施例1相同；在实施例6中，交联剂与第一透明质酸或其盐的质量比为1:100。具体地，主要反应参数如表1所示。
81.实施例7
82.实施例7与实施例1的不同在于，微球的制备方法不同。
83.实施例7
‑
1、7
‑
2、7
‑
3与实施例1的不同在于，反应开始时第二溶液中透明质酸含量不同，其他反应条件和实施例1相同。具体地，实施例7
‑
1中，反应开始时第二溶液中透明质酸含量为5mg/g；在实施例7
‑
2中，反应开始时第二溶液中透明质酸含量为10mg/g；在实施例7
‑
3中，反应开始时第二溶液中透明质酸含量为20mg/g。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定实施例7
‑
1、7
‑
2、7
‑
3制备的聚己内酯微球平均粒径分别为40μm，52μm，133μm；其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球分别占87％，88％，81％。具体地，主要反应参数如表1所示。
84.实施例7
‑
4、7
‑
5与实施例1的不同在于，反应开始时第二溶液中透明质酸分子量不同，其他反应条件和实施例1相同。具体地，在实施例7
‑
4中，反应开始时第二溶液中透明质酸分子量为3000kda；在实施例7
‑
5中，反应开始时第二溶液中透明质酸分子量为2000kda。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定实施例7
‑
4、7
‑
5制备的聚己内酯微球平均粒径分别为42μm，40μm；其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球分别占83％，88％。具体地，主要反应参数如表1所示。
85.实施例7
‑
6、7
‑
7、7
‑
8与实施例1的不同在于，第二溶液中透明质酸酶的含量不同，其他反应条件和实施例1相同。具体地，在实施例7
‑
6中，第二溶液中透明质酸酶的含量为800iu/ml；在实施例7
‑
7中，第二溶液中透明质酸酶的含量为10iu/ml；在实施例7
‑
8中，第二溶液中透明质酸酶的含量为1000iu/ml。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定实施例7
‑
6、7
‑
7、7
‑
8制备的聚己内酯微球平均粒径分别为74μm，26μm，90μm；其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球分别占77％，80％，55％。具体地，主要反应参数如表1所示。
86.实施例7
‑
9与实施例1的不同在于，微球的分散方式不同，其他反应条件和实施例1相同。具体地，配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经分液漏斗滴加至第二溶液中，保证全部第一溶液在10min滴加结束，在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗
品使用纯化水洗涤至上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为46μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占48％。具体地，主要反应参数如表1所示。
87.实施例7
‑
10与实施例1的不同在于，制备微球的可降解聚合物原料为左旋聚乳酸，其他反应条件和实施例1相同。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为39μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占90％。具体地，主要反应参数如表1所示。
88.实施例7
‑
11与实施例1的不同在于，微球的制备方法不同，其他反应条件和实施例1相同。
89.具体的，称取聚己内酯1g，溶于10ml三氯甲烷中，得第一溶液。称取0.1g透明质酸(透明质酸的分子量为1000kda)溶于100g水中(透明质酸含量为1mg/g)，加入10000iu的透明质酸酶，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米。在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤2次，上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为44μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占86％。具体地，主要反应参数如表1所示。
90.实施例7
‑
12与实施例1的不同在于，微球的制备方法不同，其他反应条件和实施例1相同。
91.具体的，称取聚己内酯1g，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。称取0.1g透明质酸(透明质酸的分子量为1000kda)溶于100g水中(透明质酸含量为1mg/g)，加入65000iu的透明质酸酶，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米，在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤至上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为60μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占86％。具体地，主要反应参数如表1所示。
92.实施例7
‑
13与实施例1的不同在于，微球的制备方法不同，其他反应条件和实施例1相同。
93.具体的，称取聚己内酯1g，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。称取0.1g透明质酸(透明质酸的分子量为200kda)溶于100g水中(透明质酸含量为1mg/g)，加入10000iu的透明质酸酶，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米，在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤至上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为56μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占62％。具体地，主要反应参数如表1所示。
94.对比例1
95.对比例1与实施例1的不同在于，步骤(2)中透明质酸填充剂的制备步骤中将第一
透明质酸和聚己内酯微球在溶液中混合后进行交联，步骤(1)的操作条件与实施例1相同。
96.具体地，步骤(2)透明质酸填充剂的制备
97.称取1g透明质酸(60kda)作为第一透明质酸，加入到7g 1％的氢氧化钠溶液中(其中交联剂1，4
‑
丁二醇二缩水甘油醚bdde含量为0.51％)，混合均匀后加入步骤(1)中制备的聚己内酯微球0.2g(ha：pcl＝5：1)，混合均匀，进行交联。控制温度30℃，反应20h得到含有微球的透明质酸凝胶。后将含有微球的透明质酸凝胶切块，使用磷酸盐氯化钠缓冲液纯化，制粒，灌封，湿热灭菌得透明质酸填充剂。
98.对比例2
99.对比例1与实施例1的不同在于，步骤(2)中透明质酸填充剂的制备步骤中将第一透明质酸进行交联反应后再加入聚己内酯微球，步骤(1)的操作条件与实施例1相同。
100.具体地，步骤(2)透明质酸填充剂的制备
101.称取1g透明质酸(60kda)作为第一透明质酸，加入到7g 1％的氢氧化钠溶液中(其中交联剂1，4
‑
丁二醇二缩水甘油醚bdde含量为0.51％)，混合均匀，进行交联反应，控制温度30℃，反应20h。得到透明质酸凝胶。后将透明质酸凝胶切块，使用磷酸盐氯化钠缓冲液纯化，制粒，然后加入步骤(1)中制备的聚己内酯微球0.2g，混合均匀(ha：pcl＝5：1)。后将含有微球的透明质酸凝胶切块，使用磷酸盐氯化钠缓冲液纯化，制粒，灌封，湿热灭菌得透明质酸填充剂。
102.对比例3
103.对比例1与实施例1的不同在于，微球制备过程中，第二溶液中不含有透明质酸。
104.具体的反应步骤如下：
105.称取聚己内酯1g，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。将10000iu的透明质酸酶溶于100g水中，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米。在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤1次，上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为173μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占42％。具体地，主要反应参数如表1所示。
106.对比例4
107.对比例4与实施例1的不同在于，微球制备过程中，第二溶液中不含有透明质酸酶。
108.具体的反应步骤如下：
109.称取聚己内酯1g，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。称取0.1g透明质酸(透明质酸的分子量为1000kda)溶于100g水中(透明质酸含量为1mg/g)。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米。在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品洗涤使用纯化水4次，上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为39μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占85％。具体地，主要反应参数如表1所示。
110.对比例5
111.对比例5与实施例1的不同在于，微球制备过程中，第二溶液中不含有透明质酸而是含有聚乙烯醇。
112.具体的反应步骤如下：
113.称取聚己内酯1g，溶于10ml二氯甲烷中，得第一溶液。将聚乙烯醇溶于100g水中，加入10000iu的透明质酸酶，得到第二溶液。配置好第二溶液后，立刻将第一溶液经超声波雾化器喷射至第二溶液中，调整第一溶液采用超声波雾化形成的液滴颗粒的直径为100微米。在此过程中，第二溶液同时进行搅拌加热，其中设定反应温度为42℃，直至有机溶剂完全挥发时，得到聚己内酯微球粗品。将所得到的聚己内酯微球粗品使用纯化水洗涤6次，上清液清澈、无粘性、不起泡，干燥得聚己内酯微球。使用winner 2008型激光粒度分析仪测定聚己内酯微球的平均粒径为40μm，其中粒径为平均粒径
±
10μm的微球占48％。具体地，主要反应参数如表1所示。
114.具体地，上述各实施例和对比例的具体条件如表1所示：
115.表1不同实施例和对比例的反应条件
116.117.118.[0119][0120]
[0121]
试验例
[0122]
试验例1混合均匀度试验
[0123]
取适量混合后样品，置载玻片上，用盖玻片轻轻压平，置1000lx照度下观察，无物料聚集即视为混合均匀。
[0124]
在将第一透明质酸与聚合物微球混合的原料混合阶段，记录各实施例及对比例物料混匀时间。混合时间结果如表2所示。
[0125]
表2各实施和对比例的物料混匀时间
[0126]
[0127][0128]
由上表可见，本发明方法将pcl微球与ha粉末在干粉状态下混合，可以在较短时间内将物料混匀，避免了因ha遇水形成凝胶团导致的混合不均匀、不彻底的状况。
[0129]
试验例2推注针头堵塞情况
[0130]
为了模拟医生使用填充剂时的推注顺滑程度，取实施例及对比例各取50支，由5名志愿者分别推注每种产品各10支，记录发生针头(27g)堵塞数量，并计算针头堵塞率，并测定推挤力。结果如表3所示。
[0131]
表3针头堵塞情况和推挤力
[0132]
[0133][0134]
由上表可见，本发明方法所得产品发生堵塞针头的概率远远小于实施例，说明本发明方法可以有效将微球材料均匀分散并有效固定，避免了因微球聚集、熔合导致的针头堵塞及及术后不良反应的发生率。
[0135]
试验例3稳定性试验
[0136]
为了考察制备得到的透明质酸填充剂产品稳定性，取每种产品各30支置60℃稳定性试验箱内，放置3月，观察产品状态并将产品均匀分散在水中，观察微球逸出情况。试验结果如表4所示。
[0137]
表4稳定性实验结果
[0138]
[0139][0140]
上述实验结果表明，本发明方法所得产品中微球被均匀分散并被有效固定、包封，因此可以保证凝胶的均匀性及稳定性。
[0141]
试验例4透明质酸填充剂形态表征
[0142]
将实施例1和对比例2制备的透明质酸填充剂使用显微镜进行表征各自灭菌前后状态，结果分别如图1和图2所示。由图1和图2可以看出，通过交联反应，聚己内酯微球被有效固定在交联ha凝胶中，几乎无裸漏的聚己内酯微球，因此在湿热灭菌过程中，微球未发生聚集、熔合现象，微球形态保持良好。而交联反应后混入微球的对比例2，灭菌过程则出现了
明显的微球熔合现象，这也在针头堵塞情况上得到了体现。
[0143]
综上，本发明方法中，将微球材料与ha在干粉状态下混合均匀，可以在较短时间内将物料混匀，避免了因ha遇水形成凝胶团块导致的混合不均匀、不彻底的状况；通过交联反应将微球材料固定在交联ha凝胶颗粒中，有效避免了pcl微球裸露导致的聚集以及灭菌过程中的熔合，减少推注过程堵塞针头及术后不良反应的发生率，增加产品的稳定性与安全性。本发明方法所得产品灭菌后pcl微球不变形、不聚集、不熔合，解决了目前该类产品因上述问题只能射线灭菌的弊端。此外，本发明方法将微球交联包封在交联ha凝胶，微球会随着交联ha的降解缓慢释放，有效延长了聚己内酯微球发挥胶原刺激剂作用的时间，其填充效果可长达2～4年。本发明所得产品采用医药级透明质酸或其盐，各项指标均满足国家及行业相关标准，是一种非常理想的组织填充剂与胶原刺激剂。