西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物资源与应用技术领域，具体涉及一株西藏酸奶来源的产gaba的马克斯克鲁维酵母菌株(kluyveromyces marxianus)及其应用。


背景技术：

2.gaba是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于植物、动物以及微生物体内。gaba在人体内是一种抑制性神经递质，主要是调节突触传递，放松神经从而起到助眠以及抗抑郁的作用，另外还具有抗高血压、抗糖尿病以及抗癌的作用(ngo等，molecules,2019, 24:2678)，因此gaba被添加到很多助眠药物以及保健品中。gaba也可作为护肤品的主要成分作用于皮肤细胞，具有平复皱纹的作用(han等，mycobiology,2017,45:199-203)。目前gaba的产生途径主要有微生物合成、植物提取以及化学合成等。化学合成和植物提取存在环境污染和产量低等局限性，因此微生物发酵法合成gaba引起了研究者的关注。
3.目前生产gaba的微生物包括乳酸菌和酵母菌等，其中酵母菌具有抗逆性强，没有噬菌体污染的风险，工业放大培养容易，可同时合成维生素和多糖等多种活性物质、生物安全性好等优点，因此利用酵母菌生产gaba受到研究者的关注。很多野生酵母和工业酵母细胞在适应生态环境进化和应用于工业生产中面对很多胁迫压力，细胞会对此做出应激反应，积累胁迫保护性物质以保护细胞不受伤害，而gaba为一种胁迫保护性物质，有报道在乙酸 (wang等，omics,2013,17:150-159)、高渗透压(ji等，j gen appl microbiol,2017,64:84-89) 和氧化胁迫(coleman等，j biol chem,2001,276:244-250)等条件下假丝酵母和酿酒酵母胞内的gaba含量提高。
4.马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)是经美国fda认证的一种gras(generallyrecognized as safe)级别的微生物，2013年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会批准此酵母为可食用菌种。马克斯克鲁维酵母的耐高温性较强，有的可在52℃下生长，且在30-40℃下的生长速率较快。该酵母可以利用多种碳源，例如葡萄糖、木糖、菊糖、乳糖、半乳糖和阿拉伯糖等作为单一底物进行发酵产生酶、氨基酸、有机化合物和乙醇等产物(王冬梅等生物学杂志，2020,37:1-10)。有研究表明几株天然kluyveromyces marxianus可以利用葡萄糖产生gaba(perpetuini等，j appl microbiol,2020,129:1609-1619)，检测到的最高产量为7.78 mg/l。
5.木糖是自然界中除了葡萄糖之外储量最丰富的单糖，例如木质纤维素类生物质水解可以产生很多木糖，可利用木糖的微生物就可以木质纤维素水解液为底物进行发酵，从而进行工业生产以节约成本，但因此利用能够天然利用木糖的酵母进行活性物质的生产，更加有利于充分利用木质纤维素资源进行生物炼制。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是，提供一株西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k。具体提供一株西藏酸奶来源
可以利用葡萄糖、木糖并在高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导下产gaba的酵母菌株kluyveromycesmarxianus jba-mby-jt140k，该菌株具有产gaba的能力，并且可以响应高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导，具有很大的应用潜力。
7.本发明的次要目的是，提供上述菌株在生产gaba中的应用。
8.本发明的第三个目的是，提供上述菌株利用木质纤维素类生物质生产gaba中的应用。
9.为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
10.一株西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromyces marxianusjba-mby-jt140k，已于2020年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21385。分类名为kluyveromyces marxianus，经检测存活。
11.本发明jba-mby-jt140k菌株的分离、纯化和筛选过程如下：用生理盐水将酸奶样品稀释10倍，涂布于ypd固体培养基平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养1-2天，待平板上长出菌落，挑取菌落到新的ypd培养基平板上划线培养，得到单菌落后挑取单菌落再次划线，重复三次，最后挑取单菌落至ypd液体培养基，置于30℃摇床培养1-2天，用终浓度为30％ (v/v)的甘油保存，得到酵母菌株jba-mby-jt140k。
12.本发明所涉及的kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k的单菌落呈奶油色到淡黄色，边缘光滑，轻微反光，菌落隆起，易挑起，显微镜下的细胞呈现卵形、椭圆形，经过细胞形态特征观察，以及基于真菌基因组中26s rdnad1/d2序列这一分子标记的测序并通过 ncbi数据库blast比对分析，鉴定其为kluyveromyces marxianus相关菌株，并命名为 kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k。其分离自西藏酸奶样品，在30℃条件下可利用葡萄糖和木糖，以及在高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导下可以产生gaba。
13.作为本发明的一个实施方案，该菌株具有如seq id no.1所示的序列。
14.为达到上述次要目的，本发明的解决方案是：
15.一株如上述的西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromyces marxianusjba-mby-jt140k在生产gaba中的应用。
16.作为本发明的一个实施方案，西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromycesmarxianus jba-mby-jt140k利用葡萄糖和木糖作为碳源生产gaba。
17.作为本发明的一个实施方案，西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromycesmarxianus jba-mby-jt140k在高温、乙醇或乙酸胁迫诱导下生产gaba。
18.作为本发明的一个实施方案，高温为30-37℃，更优选为37℃，此温度下可积累大量的 gaba。
19.作为本发明的一个实施方案，乙醇的浓度为3-5％(v/v)，更优选为3％(v/v)，此浓度下可积累大量的gaba。
20.作为本发明的一个实施方案，乙酸的浓度为3-5g/l，更优选为3g/l，此浓度下可积累大量的gaba。
21.为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：
22.一株上述的西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromyces marxianusjba-mby-jt140k在利用木质纤维素类生物质生产gaba中的应用。
23.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
24.第一、本发明从西藏酸奶中分离筛选到一株产gaba的kluyveromyces marxianus菌株，经过显色法观察和超高效液相色谱-四极杆质谱仪(waters,usa)测定，精确度可靠可信，从而揭示其生产gaba的能力，该菌株细胞内检测到大量gaba的积累，表明该菌株生产的 gaba用于食品生产的潜力和开发价值。
25.第二、本发明的kluyveromyces marxianus菌株经液体活化，并在37℃条件下以葡萄糖和木糖为碳源的发酵培养基，发酵2天时即可积累大量的gaba。
26.第三、本发明的kluyveromyces marxianus菌株在37℃高温、3％(v/v)乙醇或3g/l乙酸胁迫诱导下生产gaba。
附图说明
27.图1为本发明的实施例1中菌株在400倍显微镜下的细胞形态示意图。
28.图2为本发明的实施例3中菌株以不同浓度的葡萄糖和木糖为碳源发酵48h的生长状况。
29.图3为本发明的实施例3中菌株以不同浓度的葡萄糖和木糖为碳源发酵48h生产gaba 的产量。
30.图4为本发明的实施例4中菌株发酵液经高温、乙醇或乙酸诱导的发酵48h的生长状况。
31.图5为本发明的实施例4中菌株发酵液经高温、乙醇或乙酸诱导发酵48h生产gaba的产量。
32.图6为本发明的实施例5中菌株以木糖为碳源或乙醇诱导发酵48h胞内积累的gaba的含量。
33.该马克斯克鲁维酵母菌株kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k，已于2020年12 月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.21385。
具体实施方式
34.本发明提供了一株西藏酸奶来源的马克斯克鲁维酵母菌株及其应用。
35.本发明通过从西藏地区采集的酸奶样品中分离纯化并鉴定了一株马克斯克鲁维酵母菌株 kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k，该菌株可以利用木糖和葡萄糖生产gaba，并在高温、乙醇或乙酸等多种环境条件下胞外gaba分泌提高(即kluyveromyces marxianus利用木糖和葡萄糖，且外源添加高温、乙醇或乙酸诱导gaba释放到胞外)，展现了其良好的开发应用潜力。
36.以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
37.实施例1、酵母菌株的筛选与生物学鉴定
38.1)酵母菌株的筛选
39.用生理盐水将酸奶样品稀释10倍，涂布于ypd固体培养基平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养1-2天，待平板上长出菌落，挑取菌落到新的ypd培养基平板上划线培养，得到单菌落后挑取单菌落再次划线，重复三次，最后挑取单菌落至ypd液体培养基，置于30℃摇
床培养1-2天，用终浓度为30％(v/v)的甘油保存，得到酵母菌株。
40.2)kluyveromyces marxianus菌株的鉴定
41.本实施例的培养基配方如下(灭菌条件均为115℃，20min)，
42.gaba生产菌株筛选固体培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂 20g，溴甲酚绿0.001g，乙醛酸0.02g，琥珀酸0.02g。
43.ypd液体培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g。高压灭菌。
44.ypd固体培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。高压灭菌。
45.ypd发酵培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20/40g。高压灭菌。
46.ypx发酵培养基(1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖20/40g。高压灭菌。
47.通过将该酵母菌株在ypd平板中培养大约2天后，在400x显微镜下观察其细胞状态；细胞呈卵形、椭圆形，细胞大小为(3.1-4.2
×
1.3-2.3)μm。无性繁殖方式为单边芽殖。菌株在ypd的在400倍显微镜下的显微图片如图1所示。
48.将菌株进行基因组提取，并进行26s rdna d1/d2序列测序的分类鉴定。通过真菌26s rdna d1/d2引物(正向26s-f：5
’‑
gcatatcggtaagcggaggaaaag-3’seq id no.2；反向26s-r：5
’‑
ggtccgtgtttcaagacgg-3’seq id no.3)进行以基因组为模板的pcr 扩增。以最终测得26s rdna d1/d2序列进行blast(http://blas-t.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)同源比对，其与kluyveromyces marxianus cbs712菌株最相似，最大相似度为100％，因此将该菌株鉴定为kluyveromyces marxianus。
49.其中，jba-mby-jt140k 26s rdna d1/d2序列(seq id no.1)如下：
50.gctcaaatttgaaatctggcgtcttcgacgtccgagttgtaatttgaagaaggcga ctttgtagctggtccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcc cgtgtggcgaggatcccagttatttgtaaagtgctttcgacgagtcgagttgtttggga atgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgata gcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagt acgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggcgtttgcttcggctttc gctgggccagcatcagttttagcggttggataaatcctcgggaatgtggctctgcttcgg tagagtgttatagcccgtgggaatacagccagctgggactgaggattgcgacttttgtc aaggatgctggcgt。
51.本实施例菌株jba-mby-jt140k的形态特征和培养：在ypd平板上30℃下培养2d后，单菌落呈奶油色到淡黄色，边缘光滑，轻微反光，菌落隆起，易挑起。显微特征：在ypd平板培养2d后，细胞呈卵形、椭圆形，细胞大小为(3.1-4.2
×
1.3-2.3)μm。无性繁殖方式为单边芽殖。kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k能够利用木糖生长，并且比已有文献报道的 kluyveromyces marxianus菌株利用葡萄糖生产gaba产量(7.78mg/l)提高35倍(perpetuini 等，j appl microbiol,2020,129:1609-1619)。
52.实施例2、jba-mby-jt140k发酵液中gaba产量的测定
53.本实施例测定了jba-mby-jt140k的发酵液中gaba的含量。
54.具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的jba-mby-jt140k菌株20μl接种到1ml的ypd 液体培养基中，于30℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100ml的ypd种子培养基(即ypd液体培养基)中，置于30℃摇床中培养18h，按照初始od
600
为0.1接种到ypd发酵培养基中，用透气封口膜封口，在30℃，200rpm下发酵48h后取样，在8000rpm条件下离心 3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定gaba 的含量，gaba的出峰
时间为1.010min。
55.实施例3、jba-mby-jt140k利用葡萄糖和木糖生产gaba
56.本实施例测定了jba-mby-jt140k利用葡萄糖和木糖生产gaba的能力。
57.具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的jba-mby-jt140k菌株20μl接种到1ml的ypd 液体培养基中，于30℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100ml的ypd种子培养基(即 ypd液体培养基)中，置于30℃摇床中培养18h，按照初始od
600
为0.1接种到ypd(葡萄糖20g/l和葡萄糖40g/l)和ypx(木糖20g/l和木糖40g/l)发酵培养基中(如图2所示)，用透气封口膜封口，在30℃，200rpm下发酵48h后取样，在8000rpm条件下离心3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱-四极杆质谱仪测定gaba的含量，用全波长酶标仪测定600nm下的光吸收值，测定的该菌株发酵液中的od
600
如图2所示，gaba的含量如图3所示。
58.实施例4、jba-mby-jt140k响应高温、乙醇或乙酸的胁迫诱导生产gaba
59.本实施例测定了jba-mby-jt140k在高温，添加乙醇或乙酸发酵条件下gaba的含量。
60.具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的jba-mby-jt140k菌株20μl接种到1ml的ypd 液体培养基中，于30℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100ml的ypd种子培养基(即 ypd液体培养基)中，置于30℃摇床中培养18h，按照初始od
600
为0.1接种到ypd(葡萄糖20g/l)发酵培养基(如图4所示)中，分别按照乙醇3％(v/v)和乙醇5％(v/v)，乙酸 3g/l和乙酸5g/l的浓度添加至发酵液中，对照组不添加任何条件，用透气封口膜封口，在 30℃，200rpm下发酵48h后取样，高温条件放置于37℃，200rpm下发酵48h后取样，在 8000rpm条件下离心3min，取上清液稀释50倍，混匀过0.22μm滤膜，用超高效液相色谱
‑ꢀ
四极杆质谱仪测定gaba的含量，用全波长酶标仪测定600nm下的光吸收值，测定的该菌株发酵液中的od
600
如图4所示，gaba的含量如图5所示。
61.实施例5、jba-mby-jt140k在木糖发酵或乙醇胁迫条件下的胞内gaba含量
62.本实施例测定了jba-mby-jt140k在木糖发酵或乙醇胁迫条件下的胞内gaba含量。
63.具体步骤如下，取于-80℃冰箱保存的jba-mby-jt140k菌株20μl接种到1ml的ypd 液体培养基中，于30℃，200rpm摇床中培养24h后转接到100ml的ypd种子培养基(即 ypd液体培养基)中，置于30℃，200rpm摇床中培养18h，按照初始od
600
为0.1分别接种到ypd(葡萄糖20g/l)、ypd(葡萄糖20g/l)添加3g/l乙醇和ypx(木糖40g/l)发酵培养基中，用透气封口膜封口，在30℃，200rpm下发酵48h后取样50ml，于4℃，30000 rpm条件下离心5min，收集菌体，随后用无菌去离子水洗涤两次，加入4ml 0.1mol/l盐酸 (gr)溶液，悬浮细胞，然后按800μl/管分装至五个1.5ml离心管中。其中一管细胞液经过10000rpm离心2min后去除上清，置于50℃烘箱中至细胞干重恒定，精密分析天平测定细胞干重，剩下四管各加直径为0.5mm的玻璃珠500μl，放置于-20℃预冷的金属模块中，用细胞破碎仪破碎细胞，随后于4℃，12000rpm条件下离心5min收集所有上清液于5ml 离心管中，两管上清液合并为一管，然后加入适量体积预冷的磺基水杨酸(16.7％，w/v)，至终浓度为4.5％(w/v)，振荡混匀，4℃静置1h，在4℃，15000rpm条件下离心30min收集上清液，用1mol/l的naoh调ph为1.9，经0.22μm滤膜过膜后，用氨基酸分析仪检测gaba 的含量，结果如图6所示。
64.由图6可看出，本实施例鉴定的这株kluyveromyces marxianus jba-mby-jt140k的胞内也蕴含着大量的gaba资源，最高产量为4816.14mg/g干重，这表明了其在作为微生物
细胞工厂生产gaba中的潜力和应用价值。
65.综上所述，本发明提供了一株从中国西藏地区采集的酸奶样品中分离得到的产gaba酵母菌株，经过分子鉴定将其分类归属为kluyveromyces marxianus。该菌株于2020年12月17 日保藏于中国(北京)普通微生物菌种保藏中心，且将其原始命名为jba-mby-jt140k，保藏编号为cgmcc no.21385。通过初筛，发现该菌株可以生产gaba，利用超高效液相色谱
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四极杆质谱仪确定了该菌株生产gaba的能力。该菌株耐高温性强，在37℃下生长状态良好。该菌株可以利用木糖生产gaba，并响应高温、乙醇或乙酸多种胁迫条件的诱导，最优选地在37℃条件下利用葡萄糖作为碳源并添加3％(v/v)乙醇，或者在37℃条件下利用木糖作为碳源，都可以较明显地诱导gaba的产生，在摇瓶中最高产量达到275.09mg/l。此外，该菌株胞内积累了大量的gaba，最高产量为4816.14mg/g干重，表明了其在作为微生物细胞工厂生产gaba中的潜力和应用价值。
66.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过额外的创造性的劳动。因此，本发明不仅限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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