一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣的制备方法及其在抑制tau聚集中的应用

1.本发明属于生物医药材料领域，涉及一种tau蛋白特异的分子伴侣样复合胶束及制备方法，并应用于抑制tau蛋白聚集。


背景技术：

2.tau蛋白异常聚集是阿尔茨海默症的主要病理，也是阿尔茨海默症治疗面临的一个重大挑战，tau蛋白特异的纳米分子伴侣的设计有望解决这一问题。以复合胶束为基础的纳米分子伴侣是一类有巨大应用价值的抗菌材料，在抑制tau蛋白聚集，恢复tau蛋白稳态等方面有重要应用。
3.现有技术中，纳米分子伴侣识别和结合目标蛋白主要通过两种作用力来实现：(1)静电相互作用，根据目标蛋白的带电性质设计相应的分子伴侣。分子伴侣通过静电吸附目标蛋白，该方法的缺陷在于以静电相互作用识别结合蛋白很难避免带电性质接近的其他蛋白的结合，且带电荷的纳米分子伴侣容易造成细胞损伤；(2)疏水相互作用，根据目标蛋白的亲疏水性质设计相应的分子伴侣，可以通过亲疏水转变完成蛋白的吸附与释放。这种方法的弊端同样在于选择性不够好，难以精准控制。
4.具有应用潜力的tau蛋白分子伴侣应该具有良好的选择性和生物相容性。传统的纳米分子伴侣通过弱相互作用识别和结合目标蛋白，很难区分开带电性质或者亲疏水性质接近的蛋白，因此对于复杂的蛋白很难具有良好的特异性，限制了其在细胞内或者生物体内等复杂环境中的应用。因此，开发具有优良性能的tau蛋白分子伴侣具有重大意义。


技术实现要素：

5.本发明目的是解决现有纳米分子伴侣存在针对tau蛋白聚集抑制方面选择性不够好且难以精准控制的问题，提供一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣及其制备方法。该方法制备过程简单，原料合成容易，制备的纳米分子伴侣具有良好的特异性和生物相容性，能够抑制tau蛋白的异常聚集。
6.本发明的技术方案：
7.一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣，所述纳米分子伴侣为vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl和pcl
‑
b
‑
pae自组装得到。
8.该纳米分子伴侣的tau靶向肽vqivyk能够与具有聚集倾向的异常tau的vqivyk结合，捕获tau并屏蔽异常tau蛋白的聚集核心，由聚β
‑
氨基酸(pae)形成的胶束表面疏水微域为确定的tau蛋白提供了结合点，由聚乙二醇(peg)组成的亲水链保证了纳米分子伴侣在生理条件下的分散性和稳定性。
9.本发明同时提供了一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣的制备方法，步骤如下：
10.第1、vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl的合成
11.第1.1、以马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg
‑
oh)引发ε
‑
己内酯(ε
‑
cl)单体开环聚合，
得到马来酰亚胺
‑
聚乙二醇
‑
b
‑
聚己内酯(mal
‑
peg
‑
b
‑
pcl)；即称取质量比为1:44的mal
‑
peg
‑
oh和ε
‑
cl，溶于减压蒸馏过的甲苯中，加入sn(oct)2作为催化剂，之后反复冷冻
‑
抽真空
‑
通氮气
‑
解冻除去体系中的水和氧气，并在105
‑
115℃条件下反应12h，然后在过量冰乙醚中沉淀，抽滤，洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜，得到白色固体mal
‑
peg
‑
b
‑
pcl；
12.第1.2、然后将mal
‑
peg
‑
b
‑
pcl溶于dmf，然后分散于ph7.4的pbs中，将vqivyk加入该溶液中，在30℃下搅拌24h后，将混合物用超纯水透析2天，以除去多余的游离肽，冻干后得到vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl；
13.第2、pcl
‑
b
‑
pae的合成
14.通过丙烯酸2
‑
羟基乙酯与ε
‑
cl以1:50的摩尔比溶解在重蒸甲苯中，经液氮冷冻
‑
抽真空
‑
解冻过程循环，在105
‑
115℃条件下反应12h得到pcl单丙烯酸酯；之后pcl单丙烯酸酯，己烷
‑
1,6
‑
二醇
‑
二丙烯酸酯(hdd),4,4
’‑
三亚甲基
‑
二哌啶(tdp)以1:30:31的摩尔比发生迈克尔加成聚合反应制备pcl
‑
b
‑
pae；
15.第3、tau
‑
nchap的制备
16.按照1:1或者3:2的摩尔比，将第1步制备的vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl和第2步制备的pcl
‑
b
‑
pae溶解在dmf中，在超声状态下将聚合物溶液逐滴滴到ph～6酸性水中得到胶束溶液，十分钟后，将胶束溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中透析3天，得到tau蛋白特异的纳米分子伴侣，即tau
‑
nchap。胶束在使用前通过超滤浓缩定容。
17.本发明还提供了所述tau蛋白特异的纳米分子伴侣作为tau聚集抑制剂的应用。
18.本发明的优点和有益效果：
19.本发明提供了一种简单有效的纳米分子伴侣及其制备方法，并用于抑制tau蛋白聚集。本发明有如下的优势：1)原料简单易得；2)合成步骤简单且收率高，易批量生产；3)聚合物胶束稳定，生物毒性低，4)有良好的抑制tau蛋白聚集的作用，易于推广应用。
附图说明
20.图1为tau
‑
nchap的形成示意图。
21.图2为制备的tau
‑
nchap的透射电镜(tem)照片。
22.图3为制备的tau
‑
nchap抑制tau聚集的效果图。
23.图4为制备的tau
‑
nchap降低tau聚集引起的神经毒性的效果图。
具体实施方式
24.实施例1：
25.一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣的制备方法，该方法步骤和基本表征如下：
26.1)vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl的合成
27.具体的过程如下，称取mal
‑
peg
‑
oh(0.5g)和ε
‑
cl(0.5g)，溶于3ml减压蒸馏过的甲苯中。加入一滴sn(oct)2之后，反复冷冻
‑
抽真空
‑
通氮气
‑
解冻三次除去体系中的水和氧气，并在110℃条件下反应12h，然后在过量冰乙醚中沉淀，抽滤，洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜，得到白色固体mal
‑
peg
‑
b
‑
pcl。将mal
‑
peg
‑
b
‑
pcl(100mg)溶于10mldmf，然后分散于pbs(ph7.4，10ml)中。将vqivyk(10mg)加入该溶液中。在30℃下搅拌24h后，将混合物用超纯水透析2天，以除去多余的游离肽。冻干后得到vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl。
28.2)pcl
‑
b
‑
pae的合成
29.0.8mmol丙烯酸2
‑
羟基乙酯和40mmolε
‑
cl溶于10ml重蒸甲苯中，加入1滴辛酸亚锡。通过液氮冷冻—抽真空—充氮气—解冻，循环三次后，在氮气保护下于105
‑
115℃的油浴中反应12h。然后在十倍体积的冰乙醚中沉淀，粗产物在真空烘箱中烘干得到pcl单丙烯酸酯。然后将0.1mmol pcl单丙烯酸酯，3mmol hdd和3.1mmol tdp溶于10ml三氯甲烷中。在55℃下搅拌3天，将全部溶液沉淀到过量的乙醚中，抽滤得到pcl
‑
b
‑
pae。
30.3)纳米分子伴侣tau
‑
nchap的制备；
31.如图1所示，按照1:1的摩尔比，将总质量为5mg步骤1)得到的vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl和步骤2)得到的pcl
‑
b
‑
pae溶解在1mldmf中。在超声状态下将聚合物溶液逐滴滴到ph～6酸性水中，10分钟后，将胶束溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中透析3天，得到tau
‑
nchap。
32.实施例2
33.纳米分子伴侣的制备同实施例1，不同之处是，按3:2的摩尔比，总质量为5mg的vqivyk
‑
peg
‑
b
‑
pcl和pcl
‑
b
‑
pae溶解在1mldmf中。在超声状态下将聚合物溶液逐滴滴到ph～6酸性水中，10分钟后，将胶束溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中透析3天，得到tau
‑
nchap。
34.实施例3、tau
‑
nchap的电镜表征；
35.将实施例1或2制备的一滴tau
‑
nchap样品(0.5mg/ml)滴在涂有碳的铜网上，约15分钟后用滤纸吸去多余的溶液。然后将大约10μl的2％的醋酸铀滴到网格上，2分钟后用滤纸将多余的液体吸走，使其风干。测量由talos f200c电子显微镜进行，测量电压为200kv。电镜表征结果如图2所示。
36.实施例4：
37.一种tau蛋白特异的纳米分子伴侣在抑制tau聚集中的应用如下：
38.1)tau
‑
nchap抑制tau蛋白聚集；
39.如图3所示，我们用肝素建立全长tau蛋白的聚集模型，并通过硫黄素
‑
t(tht)荧光检测法研究单纯tau蛋白和有tau
‑
nchap存在时的聚集动力学。当单独培养全长tau蛋白时，tht的荧光强度随时间迅速增加，并在96h后达到最大值，表明了tau聚集的形成。引入tau
‑
nchap后，与单独的tau组相比，tht荧光的最大值明显下降到约50％，供了强有力的证据，证明tau
‑
nchap对全长tau的聚集具有很大的抑制能力。
40.2)tau
‑
nchap的安全性评估；
41.如图4所示，安全性评估通过体外的细胞毒性实验来完成。首先配置了七个不同浓度的纳米粒子溶液(10、20、50、100、200、500、1000ug/ml)，选用n2a细胞进行细胞毒性实验(cck
‑
8)。结果如图4中所示，各浓度下，细胞的存活率都在90％以上，说明我们所制备的纳米粒子在体外没有明显的细胞毒性。