苯基丙酰胺类化合物及其应用的制作方法

苯基丙酰胺类化合物及其应用
1.本技术主张如下优先权
2.申请号：pct/cn2021/091547，申请日：2021年04月30日。
技术领域
3.本发明涉及苯基丙酰胺类化合物及其应用，具体涉及式(i)所示化合物及其药学上可接受的盐。


背景技术：

4.本发明化合物是一类新的kappa激动剂，及其在制备治疗疼痛和瘙痒相关疾病的药物中的应用。
5.阿片受体是一类重要的跨越七膜的g蛋白偶联受体，包括mor、dor、kor和olr等亚型，它们广泛分布在整个大脑、脊髓和外周。kappa阿片受体(kor)由位于人类染色体8q11.2上的单个基因oprk编码。与mor相似，kor在大脑、脊髓和外周神经中广泛表达。kappa阿片受体激动剂可通过至少两种机制产生镇痛作用：(i)对疼痛信号的神经元转运的直接抑制作用和(ii)间接的抗炎作用。
6.中枢性作用的阿片受体激动剂可抑制疼痛，但它们与局限性副作用有关，例如镇静、烦躁不安和尿量增加。激活外周阿片受体可产生镇痛作用，减轻中枢神经系统的副作用。这种方法已被证明可以缓解传统中枢阿片类药物的疼痛。外周限制性的kor激动剂不会越过血脑屏障，因此不会对位于大脑或脊髓的kor产生影响。可以通过作用于位于外周的kappa受体来减少疼痛信号的传导，而不会引起中枢介导的不良反应。


技术实现要素：

7.本发明提供了式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0008][0009]
其中，
[0010]
r1选自c
3-5
环烷基和-c
1-3
烷基-c
3-5
环烷基，所述c
3-5
环烷基和-c
1-3
烷基-c
3-5
环烷基任选被1、2或3个ra取代；
[0011]
r2选自所
述述任选被1、2或3个rb取代；
[0012]
l1选自-n(re)-c(rc)(rd)-，氮原子与r3相连，碳原子与l1相连；
[0013]
r3自-c
1-3
烷基-苯基，所述-c
1-3
烷基-苯基任选被1、2或3个rf取代；
[0014]
ra和rf选自f、cl、br和ch3；
[0015]
rb选自f、cl、br、nh2、cooh、c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、-c(＝o)-c
1-3
烷基和-nh-c(＝o)nh-c
1-3
烷基，所述c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、-c(＝o)-c
1-3
烷基和-nh-c(＝o)nh-c
1-3
烷基任选被1、2或3个r取代；
[0016]
rc和rd分别独立地选自h、nh2和ch3；
[0017]
re选自h和ch3；
[0018]
r选自f、cl和br。
[0019]
在本发明的一些方案中，上述r1选自环丙基、环戊基和-ch
2-环丙基，所述环丙基、环戊基和-ch
2-环丙基任选被1、2或3个ra取代，其他变量如本发明所定义。
[0020]
在本发明的一些方案中，上述r1选自其他变量如本发明所定义。
[0021]
在本发明的一些方案中，上述rb选自f、cl、br、nh2、cooh、ch3、cf3、och3、-c(＝o)-ch3和-nh-c(＝o)nh-ch3，其他变量如本发明所定义。
[0022]
在本发明的一些方案中，上述r2选自选自所述任选被1、2或3个rb取代，其他变量如本发明所定义。
[0023]
在本发明的一些方案中，上述r2选自选自其他变量如本发明所定义。
[0024]
在本发明的一些方案中，上述r3选自所述任选被1、2或3个rf取代，其他变量如本发明所定义。
[0025]
在本发明的一些方案中，上述r3选自其他变量如本发明所定义。
[0026]
在本发明的一些方案中，上述l1选自-nh-ch
2-，其他变量如本发明所定义。
[0027]
在本发明的一些方案中，上述r
3-l
1-选自其他变量如本发明所定义。
[0028]
本发明提供了式(i)所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0029][0030]
其中，
[0031]
r1选自c
3-5
环烷基和-c
1-3
烷基-c
3-5
环烷基，所述c
3-5
环烷基和-c
1-3
烷基-c
3-5
环烷基任选被1、2或3个ra取代；
[0032]
r2选自所述所述任选被1、2或3个rb取代；
[0033]
l1选自-c(rc)(rd)-和-n(re)-c(rc)(rd)-；
[0034]
r3自-c
1-3
烷基-苯基，所述-c
1-3
烷基-苯基任选被1、2或3个rf取代；
[0035]
ra和rf选自f、cl、br和ch3；
[0036]
rb选自f、cl、br、nh2、cooh、c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基和-c(＝o)-c
1-3
烷基，所述c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基和-c(＝o)-c
1-3
烷基任选被1、2或3个r取代；
[0037]
rc和rd分别独立地选自h、nh2和ch3；
[0038]
re选自h和ch3；
[0039]
r选自f、cl和br。
[0040]
在本发明的一些方案中，上述r1选自环丙基、环戊基和-ch
2-环丙基，所述环丙基、环戊基和-ch
2-环丙基任选被1、2或3个ra取代，其他变量如本发明所定义。
[0041]
在本发明的一些方案中，上述r1选自其他变量如本发明所定义。
[0042]
在本发明的一些方案中，上述rb选自f、cl、br、nh2、cooh、ch3、cf3、och3和-c(＝o)-ch3，其他变量如本发明所定义。
[0043]
在本发明的一些方案中，上述r2选自所述所述任选被1、2或3个rb取代，其他变量如本发明所定义。
[0044]
在本发明的一些方案中，上述r2选自选自其他变量如本发明所定义。
[0045]
在本发明的一些方案中，上述r3选自所述任选被1、2或3个rf取代，其他变量如本发明所定义。
[0046]
在本发明的一些方案中，上述r3选自其他变量如本发明所定义。
[0047]
在本发明的一些方案中，上述l1选自-ch
2-、-ch(nh2)-和-nh-ch
2-，其他变量如本发明所定义。
[0048]
在本发明的一些方案中，上述r
3-l
1-选自其他变量如本发明所定义。
[0049]
本发明还有一些方案是由上述各变量任意组合而来。
[0050]
本发明的一些方案中，上述述化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
[0051][0052]
r1、r2和r3如本发明所定义；
[0053]
带“*”碳原子为手性碳原子，以(r)或(s)单一对映体形式或富含一种对映体形式存在。
[0054]
本发明的一些方案中，上述述化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
[0055][0056]
r1、r2和r3如本发明所定义；
[0057]
带“*”碳原子为手性碳原子，以(r)或(s)单一对映体形式或富含一种对映体形式存在。
[0058]
本发明还提供了下式所示化合物或其药学上可接受的盐，
[0059][0060]
本发明的一些方案中，上述化合物、其异构体或其药学上可接受的盐，其选自：
[0061][0062]
本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗瘙痒的药物上的应用。
[0063]
定义和说明
[0064]
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
[0065]
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0066]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
[0067]
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
[0068]
除非另有说明，术语“异构体”意在包括几何异构体、顺反异构体、立体异构体、对
映异构体、旋光异构体、非对映异构体和互变异构体。
[0069]
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对对映体、(r)-和(s)-对映体、非对映异构体、(d)-异构体、(l)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
[0070]
除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。
[0071]
除非另有说明，术语“顺反异构体”或者“几何异构体”系由因双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而引起。
[0072]
除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。
[0073]
除非另有说明，“(d)”或者“(+)”表示右旋，“(l)”或者“(-)”表示左旋，“(dl)”或者“(
±
)”表示外消旋。
[0074]
除非另有说明，用楔形实线键和楔形虚线键表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键和直形虚线键表示立体中心的相对构型，用波浪线表示楔形实线键或楔形虚线键或用波浪线表示直形实线键和直形虚线键
[0075]
除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。
[0076]
除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构体或对映体过量(ee值)为80％。
[0077]
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(r)-和(s)-异构体以及d和l异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
[0078]
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3h)，碘-125(
125
i)或c-14(
14
c)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比
于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
[0079]
术语“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
[0080]
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，取代基可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧(即＝o)时，意味着两个氢原子被取代。氧取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
[0081]
当任何变量(例如r)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个r所取代，则所述基团可以任选地至多被两个r所取代，并且每种情况下的r都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
[0082]
当一个连接基团的数量为0时，比如-(crr)
0-，表示该连接基团为单键。
[0083]
当一个取代基数量为0时，表示该取代基是不存在的，比如-a-(r)0表示该结构实际上是-a。
[0084]
当一个取代基为空缺时，表示该取代基是不存在的，比如a-x中x为空缺时表示该结构实际上是a。
[0085]
当其中一个变量选自单键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如a-l-z中l代表单键时表示该结构实际上是a-z。
[0086]
当一个取代基的键可以交叉连接到一个环上的两一个以上原子时，这种取代基可以与这个环上的任意原子相键合，例如，结构单元表示其取代基r可在环己基或者环己二烯上的任意一个位置发生取代。当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到被取代的基团上时，这种取代基可以通过其任何原子相键合，例如，吡啶基作为取代基可以通过吡啶环上任意一个碳原子连接到被取代的基团上。
[0087]
当所列举的连接基团没有指明其连接方向，其连接方向是任意的，例如，中连接基团l为-m-w-，此时-m-w-既可以按与从左往右的读取顺序相同的方向连接环a和环b构成也可以按照与从左往右的读取顺序相反的方向连接环a和环b构成所述连接基团、取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
[0088]
除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。当该化学键的连接方式是不定位的，且可连接
位点存在h原子时，则连接化学键时，该位点的h原子的个数会随所连接化学键的个数而对应减少变成相应价数的基团。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键直形虚线键或波浪线表示。例如-och3中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连；中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连；中的波浪线表示通过该苯基基团中的1和2位碳原子与其他基团相连；表示该哌啶基上的任意可连接位点可以通过1个化学键与其他基团相连，至少包括表示该哌啶基上的任意可连接位点可以通过1个化学键与其他基团相连，至少包括这4种连接方式，即使-n-上画出了h原子，但是仍包括这种连接方式的基团，只是在连接1个化学键时，该位点的h会对应减少1个变成相应的一价哌啶基。
[0089]
除非另有规定，术语“c
1-3
烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述c
1-3
烷基包括c
1-2
和c
2-3
烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。c
1-3
烷基的实例包括但不限于甲基(me)、乙基(et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。
[0090]
除非另有规定，术语“c
1-3
烷氧基”表示通过一个氧原子连接到分子的其余部分的那些包含1至3个碳原子的烷基基团。所述c
1-3
烷氧基包括c
1-2
、c
2-3
、c3和c2烷氧基等。c
1-3
烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基(包括正丙氧基和异丙氧基)等。
[0091]
除非另有规定，“c
3-5
环烷基”表示由3至5个碳原子组成的饱和环状碳氢基团，其为单环体系，所述c
3-5
环烷基包括c
3-4
和c
4-5
环烷基等；其可以是一价、二价或者多价。c
3-5
环烷基的实例包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基等。
[0092]
除非另有规定，c
n-n+m
或c
n-c
n+m
包括n至n+m个碳的任何一种具体情况，例如c
1-12
包括c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c
10
、c
11
、和c
12
，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如c
1-12
包括c
1-3
、c
1-6
、c
1-9
、c
3-6
、c
3-9
、c
3-12
、c
6-9
、c
6-12
、和c
9-12
等；同理，n元至n+m元表示环上原子数为n至n+m个，例如3-12元环包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、和12元环，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如3-12元环包括3-6元环、3-9元环、5-6元环、5-7元环、6-7元环、6-8元环、和6-10元环等。
[0093]
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶x射线衍射法(sxrd)，把培养出的单晶用bruker d8 venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为cukα辐射，扫描方式：扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。
[0094]
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下
面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
[0095]
本发明所使用的溶剂可经市售获得。
[0096]
本发明采用下述缩略词：aq代表水；hatu代表o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐；eq代表当量、等量；dcm代表二氯甲烷；pe代表石油醚；dmf代表n,n-二甲基甲酰胺；dmso代表二甲亚砜；etoac代表乙酸乙酯；etoh代表乙醇；meoh代表甲醇；cbz代表苄氧羰基，是一种胺保护基团；boc代表叔丁氧羰基是一种胺保护基团；r.t.代表室温；o/n代表过夜；thf代表四氢呋喃；boc2o代表二叔丁基二碳酸酯；tfa代表三氟乙酸；dipea代表二异丙基乙基胺；pd2(dba)3代表三(二亚苄基丙酮)二钯。
[0097]
化合物依据本领域常规命名原则或者使用软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
附图说明
[0098]
图1：化合物1对小鼠瘙痒的抑制作用。
[0099]
技术效果
[0100]
本发明化合物具有显著的kappa受体激动作用；在人和sd大鼠血浆中表现为非常高的血浆蛋白游离率；本发明化合物无相关药药相互作用风险；本发明化合物具有良好的药代动力学性质；本发明化合物的渗透性更低，外排率更高，预示着进脑风险更低；本发明化合物具有优异的抑制瘙痒的效果。
具体实施方式
[0101]
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
[0102]
参考例1:合成中间体m1
[0103]
[0104]
步骤1:中间体m1-2的制备
[0105]
将化合物m1-1(1.1g,8.52mmol)溶于1,4-二氧六环(10ml)中，加入氢氧化钠(408.80mg,10.22mmol)的水(10ml)溶液，接着加入二碳酸二叔丁酯(2.23g,10.22mmol)，反应液体20℃下继续搅拌15小时。向反应液中加入30ml水，用饱和硫酸氢钾溶液调节ph至3左右，乙酸乙酯(50ml*2)萃取，合并萃取后的有机相用60ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到化合物m1-2，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:5.09-5.07(d,j＝8.0hz,1h),4.28-4.26(m,1h),1.63-1.53(m,2h),1.32(s,9h),0.70-0.58(m,1h),0.42-0.32(m,2h),0.05
‑‑
0.05(m,2h)。
[0106]
下中间体使用与中间体m1-2类似的方法合成得到：
[0107][0108]
步骤2:中间体m1-3的制备
[0109]
将化合物m1-2(1.95g,8.51mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(15ml)中，加入碳酸钾(1.41g,10.21mmol)和溴化苄(1.75g,10.21mmol)，反应液在20℃下继续搅拌15小时。将反应液用80ml乙酸乙酯稀释，依次用水(50ml*2)和饱和食盐水(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：0-10％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物m1-3。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.38-7.25(m,5h),5.12(d,j＝2.4hz,2h),4.40-4.36(m,1h),1.64-1.60(m,2h),1.39(s,9h),0.68-0.56(m,1h),0.46-0.29(m,2h),0.07
‑‑
0.08(m,2h)。
[0110]
下中间体使用与中间体m1-3类似的方法合成得到：
[0111][0112]
步骤3:中间体m1-4的制备
[0113]
将化合物m1-3(2.4g,7.51mmol)溶于乙酸乙酯(10ml)中，加入4m盐酸-乙酸乙酯溶液(10ml)，反应液在20℃下继续反应0.5小时。减压除去有机溶剂，得到粗品化合物m1-4的盐酸盐，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1h nmr(400mhz,cd3od)δ:7.32-7.19(m,5h),5.19-5.08(m,2h),4.02(t,j＝6.4hz,1h),1.82-1.54(m,2h),0.70-0.55(m,1h),0.47-0.32(m,2h),0.08
‑‑
0.09(m,2h)。
[0114]
下中间体使用与中间体m1-4类似的方法合成得到：
[0115][0116]
步骤4:中间体m1-5的制备
[0117]
将化合物m1-4的盐酸盐(1.9g,7.43mmol)和boc-d-苯丙氨酸(1.97g,7.43mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入二异丙基乙胺(2.88g,22.29mmol,3.88ml)和hatu(4.24g,11.14mmol)，反应液在20℃下搅拌16小时。反应液用80ml乙酸乙酯稀释，依次用水(40ml*2)和饱和食盐水(50ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：10～25％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物m1-5。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.44-7.21(m,10h),6.53(d,j＝7.2hz,1h),5.17(q,j＝12.0hz,2h),5.10-5.00(m,1h),4.72-4.61(m,1h),4.42-4.38(m,1h),3.13-3.02(m,2h),1.79-1.70(m,1h),1.68-1.56(m,1h),1.44(s,9h),0.63-0.49(m,1h),0.46-0.28(m,2h),0.07
‑‑
0.09(m,2h)。
[0118]
下中间体使用与中间体m1-5类似的方法合成得到：
[0119][0120][0121]
步骤5:中间体m1的制备
[0122]
将化合物m1-5(3.4g,7.29mmol)溶于乙酸乙酯(30ml)中，加入4m盐酸-乙酸乙酯溶液(30ml)，反应液在20℃下继续反应1小时。减压除去有机溶剂，得到化合物m1的盐酸盐，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1h nmr(400mhz,cd3od)δ:7.35-7.11(m,10h),5.08(s,2h),4.49-4.46(m,1h),4.09-4.00(m,1h),3.16-3.12(m,1h),2.87-2.84(m,1h),1.92-1.89(d,j＝8.8hz,1h),1.73-1.50(m,2h),0.79-0.60(m,1h),0.43-0.22(m,2h),0.09
‑‑
0.12(m,2h)。
[0123]
下中间体使用与中间体m1类似的方法合成得到：
[0124]
[0125]
参考例3:合成中间体a1
[0126][0127]
步骤1:中间体a1-1的制备
[0128]
将化合物m1的盐酸盐(1.2g,3.27mmol)混悬于二氯甲烷(15ml)中，加入三乙胺(994.08mg,9.82mmol)，缓慢滴入氯乙酰氯(554.77mg,4.91mmol,390.68μl)，反应液在20℃下继续搅拌18小时。反应液用50ml二氯甲烷稀释，依次用30ml饱和氯化铵溶液和30ml饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品化合物a1-1，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.51-7.38(m,5h),7.35-7.24(m,5h),6.30(d,j＝7.6hz,1h),5.38-5.14(m,2h),4.81-4.59(m,2h),3.29-3.02(m,3h),1.83-1.67(m,2h),1.48(t,j＝7.2hz,1h),0.66-0.50(m,1h),0.45-0.39(m,2h),0.08
‑‑
0.09(m,2h)；ms m/z＝443.2[m+h]
+
。
[0129]
下中间体使用与中间体a1-1类似的方法合成得到：
[0130][0131]
步骤2:中间体a1-2的制备
[0132]
将化合物a1-1(1.42g,3.21mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(15ml)中，加入化合物(r)-(+)-β-甲基苯乙胺(660.41mg,3.85mmol)，碘化钾(1.06g,6.41mmol)和碳酸钾(1.33g,9.62mmol)，反应液在60℃下继续搅拌16小时。降温，减压除去有机溶剂，加入30ml水，用二氯甲烷萃取(30ml*2)，合并萃取后的有机相，饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品化合物a1-2，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。ms m/z＝542.3[m+h]
+
。
[0133]
下中间体使用与中间体a1-2类似的方法合成得到：
[0134][0135]
步骤3:中间体a1-3的制备
[0136]
将化合物a1-2(1.7g,3.14mmol)溶于二氯甲烷(15ml)中，加入二异丙基乙胺(1.22g,9.42mmol,1.64ml)，和boc酸酐(1.37g,6.28mmol)，反应液在20℃下继续搅拌16小时。减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：10～30％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物a1-3。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.46-7.28(m,10h),7.25-7.18(m,5h),6.77-6.32(m,2h),5.25-5.05(m,2h),4.77-4.54(m,2h),3.90-3.06(m,7h),1.75-1.61(m,2h),1.44(s,9h),1.26(d,j＝6.8hz,3h),0.66-0.48(m,1h),0.41-0.33(m,2h),0.09
‑‑
0.11(m,2h)。
[0137]
下中间体使用与中间体a1-3类似的方法合成得到：
[0138][0139]
步骤4:中间体a1的制备
[0140]
将化合物a1-3(1.05g,1.64mmo)溶于乙醇(30ml)中，氮气保护下，加入10％钯/碳(150mg,155.33μmol)，反应液在20℃，15psi氢气压力下继续搅拌15小时。反应液经硅藻土过滤，减压除去有机溶剂，得到化合物a1，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.30-7.09(m,10h),7.00-6.64(m,2h),4.80-4.66(m,1h),4.52-4.44(m,1h),3.83-3.59(m,2h),3.55-2.83(m,5h),1.78-1.52(m,2h),1.36(s,9h),1.18(d,j＝6.8hz,3h),0.60-0.52(m,1h),0.40-0.30(m,2h),0.05
‑‑
0.05(m,2h)。
[0141]
下中间体使用与中间体a1类似的方法合成得到：
[0142][0143]
参考例5:合成中间体b1
[0144][0145]
步骤1:中间体b1-1的制备
[0146]
将化合物a1(1.9g,3.44mmol)和化合物a1-a(1.16g,3.44mmol)溶于dmf(20ml)中，加入二异丙基乙胺(1.34g,10.33mmol,1.80ml)和hatu(1.96g,5.17mmol)，反应液在20℃下继续搅拌15小时。用150ml乙酸乙酯稀释，有机相依次用水(60ml*2)和饱和食盐水(80ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂：10～40％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物b1-1。ms m/z＝870.9[m+h]
+
。
[0147]
步骤2:中间体b1的制备
[0148]
将化合物b1-1(1.4g,1.61mmol)溶于乙醇(20ml)中，加入钯碳(0.2g,10％纯度)，反应液在20℃，氢气压力为15psi下继续反应15小时。反应液经硅藻土过滤，减压除去有机溶剂，得到化合物b1，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。ms m/z＝802.6[m+na]
+
。
[0149]
参考例6:合成中间体d1
[0150][0151]
步骤1:中间体d1-2的制备
[0152]
将化合物d1-1(3g,7.93mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中，加入碳酸钾(1.31g,9.51mmol)和溴化苄(1.63g,9.51mmol,1.13ml)，反应液在20℃下继续搅拌15小时。向反应液中加入50ml水，用乙酸乙酯(60ml*2)萃取，合并萃取后的有机相，用饱和食盐水(60ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到的粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：5～25％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物d1-2。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.33-7.19(m,10h),5.06(s,2h),4.98(s,2h),4.95(s,1h),3.75-3.71(m,2h),3.06-3.00(m,2h),2.02-1.92(m,4h),1.37(s,9h)。
[0153]
步骤2:中间体d1-3的制备
[0154]
将化合物d1-2(3.7g,7.90mmol)溶于乙酸乙酯(10ml)中，加入4m盐酸/乙酸乙酯(10ml)，反应液在20℃下继续搅拌1小时。减压除去有机溶剂，得到化合物d1-3的盐酸盐，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.37
–
7.31(m,10h),5.16(s,2h),5.06(s,2h),3.37-3.30(m,4h),3.27-3.11(m,2h),2.40-2.21(m,4h)。
[0155]
步骤3:中间体d1-5的制备
[0156]
将化合物d1-3的盐酸盐(3g,7.41mmol)和化合物d1-4(3.47g,7.41mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中，加入二异丙基乙胺(2.87g,22.23mmol,3.87ml)和hatu(4.23g,11.11mmol)，反应液在20℃下继续搅拌14小时。反应液用100ml乙酸乙酯稀释，依次用水(50ml*2)和饱和食盐水(60ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，得到粗品经硅胶柱层析(洗脱剂：15～30％乙酸乙酯/石油醚)分离纯化，得到化合物d1-5。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.78(d,j＝7.4hz,2h),7.67-7.57(m,2h),7.47-7.28(m,14h),5.84-5.68(m,1h),5.26-5.01(m,5h),4.74-4.53(m,2h),4.39(d,j＝7.0hz,2h),4.27-4.19(m,1h),4.03-3.57(m,2h),3.51-3.25(m,1h),3.20-3.01(m,2h),2.30-2.14(m,2h),2.02
–
1.96(m,2h),1.79-1.65(m,2h),1.60-1.30(m,14h)。
[0157]
下中间体使用与中间体d1-5类似的方法合成得到:
[0158][0159]
步骤4:中间体d1的制备
[0160]
将化合物d1-5(3g,3.66mmol)溶于二氯甲烷(15ml)中，加入哌啶(3.12g,36.63mmol,3.62ml)，反应液在20℃下继续搅拌16小时。减压除去有机溶剂，加入30ml乙腈打浆，过滤，滤液旋干，所得粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂：35％乙酸乙酯/石油醚～10％甲醇/二氯甲烷)分离纯化，得到化合物d1的盐酸盐。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.41-7.29(m,10h),5.16(s,2h),5.08(s,2h),4.62-4.58(m,1h),3.75-3.60(m,2h),3.43-3.08(m,4h),2.29-2.13(m,2h),2.05-1.87(m,2h),1.68-1.54(m,4h),1.54-1.39(m,15h)；ms m/z＝597.3[m+h]
+
。
[0161]
下中间体使用与中间体d1类似的方法合成得到:
[0162][0163]
参考例8:合成中间体e1
[0164][0165]
步骤1:中间体e1-2的制备
[0166]
将化合物e1-1(2g,9.99mmol)，吡啶(880.00mg,11.13mmol,897.96μl)溶于四氢呋喃(45ml)中，氮气保护下，0℃滴加氯甲酸苯酯(1.56g,9.99mmol,1.25ml)，加完后20℃继续反应2小时。反应结束后，减压除去有机溶剂，粗产物用乙酸乙酯稀释，然后用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗产品经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到化合物e1-2。ms m/z＝301.9[m-56+na]
+
。
[0167]
步骤2:中间体e1-3的制备
[0168]
将化合物e1-2(0.6g,1.87mmol)溶于甲醇(15ml)中，加入甲胺溶液(2m,842.74μl)，加完后升温至50℃继续反应15小时。冷却，减压除去有机溶剂，所得粗产品经柱层析纯
化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得到化合物e1-3。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:4.26-4.10(m,2h),4.03-3.80(m,2h),3.75-3.61(m,1h),2.79(br t,j＝12.4hz,2h),2.70(d,j＝4.8hz,3h),1.91-1.80(m,2h),1.38(s,9h)。
[0169]
步骤3:中间体e1的制备
[0170]
将化合物e1-3(249.03mg,967.73μmol)溶于乙酸乙酯(3ml)中，加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4m,2.42ml)，加完后在20℃继续反应1小时。减压除去有机溶剂，所得粗产品经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到化合物e1的盐酸盐。1h nmr(400mhz,cd3od)δ:3.84-3.70(m,1h),3.41(br d,j＝13.2hz,2h),3.17-3.05(m,2h),2.72(s,3h),2.12(br dd,j＝3.2,14.0hz,2h),1.75-1.62(m,2h)；ms m/z＝158.1[m+h]
+
。
[0171]
实施例1:化合物1的制备
[0172][0173]
步骤1:中间体1-1的制备
[0174]
将化合物a1(220mg,398.79μmol)和化合物d1(237.96mg,398.79μmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，加入二异丙基乙胺(154.62mg,1.20mmol,208.38μl)和hatu(227.45mg,598.18μmol)，反应液在20℃下继续搅拌16小时。反应液用60ml乙酸乙酯稀释，依次用水(30ml*2)和饱和食盐水(40ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗产物经硅胶柱层析(洗脱剂：50％乙酸乙酯/石油醚到5％甲醇/二氯甲烷)分离纯化，得到化合物1-1。ms m/z＝1130.6[m+h]
+
.
[0175]
以下中间体使用与中间体1-1类似的方法合成得到：
[0176][0177][0178]
步骤2:中间体1-2的制备
[0179]
将化合物1-1(200mg,176.93μmol)溶于乙醇(10ml)中，加入10％钯/碳(20mg,176.93μmol)，反应液在20℃下，15psi氢气压力下继续搅拌15小时。反应液经硅藻土过滤，
减压除去有机溶剂，得到化合物1-2，该化合物不经进一步纯化直接用于下一步反应。ms m/z＝906.6[m+h]
+
。
[0180]
以下中间体使用与中间体1-2类似的方法合成得到：
[0181][0182]
步骤3:化合物1的制备
[0183]
将化合物1-2(155mg,171.06μmol)溶于乙酸乙酯(5ml)中，加入4m盐酸/乙酸乙酯(5ml)，反应液在20℃下继续搅拌0.5小时。减压除去大部分溶剂，加入20ml乙酸乙酯打浆，过滤，得到滤饼粗产物通过高效液相色谱法(柱子:venusil asb phenyl 150*30mm*5μm；流动相:[水(0.05％盐酸)-乙腈]；b(乙腈)％:8％-38％,9min)分离纯化，得到化合物1的盐酸盐。1h nmr(400mhz,cd3od)δ:7.26-7.08(m,9h),7.07-6.97(m,1h),4.62-4.50(m,1h),4.31-4.18(m,1h),4.08-3.83(m,1h),3.80-3.49(m,4h),3.25-3.24(m,1h),3.12-2.88(m,4h),2.86-2.68(m,3h),2.25-2.03(m,2h),1.93-1.50(m,7h),1.49-1.25(m,4h),1.24-1.15(m,3h),0.77-0.56(m,1h),0.49-0.23(m,2h),0.12
‑‑
0.10(m,2h)；ms m/z＝706.4[m+h]
+
。
[0184]
以下化合物使用与化合物1类似的方法合成得到：
[0185][0186][0187]
实施例3:化合物3的制备
[0188][0189]
步骤1:中间体3-1的制备
[0190]
将化合物b1(0.2g,256.42μmol)，化合物e1的盐酸盐(70.81mg,307.71μmol)溶于dmf(5ml)中，加入hatu(146.25mg,384.64μmol)和二异丙基乙胺(99.42mg,769.27μmol,133.99μl)，反应液在20℃继续搅拌15小时。将反应液用50ml乙酸乙酯稀释，有机相依次用水(30ml*2)，饱和食盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗产物通过硅胶柱层析(洗脱剂：0～5％甲醇/二氯甲烷)分离纯化，得到化合物3-1。ms m/z＝919.6[m+h]
+
。
[0191]
以下中间体使用与中间体3-1类似的方法合成得到：
[0192][0193]
步骤2:化合物3的制备
[0194]
将化合物3-1(0.19g,206.71μmol)溶于乙酸乙酯(4ml)中，加入氯化氢乙酸乙酯溶液(4m,2ml)，反应液在20℃继续搅拌2小时。减压除去有机溶剂，所得粗产品经高效液相色谱法分离纯化(柱子:venusil asb phenyl 150*30mm*5μm；流动相:[水(0.05％hcl)-acn]；b(乙腈)％:15％-45％,9min)，得到化合物3。1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ:7.41-7.37(m,2h),7.33-7.26(m,7h),7.20-7.11(m,1h),4.77-4.69(m,1h),4.45-4.27(m,2h),4.08-3.94(m,1h),3.91-3.82(m,1h),3.81-3.74(m,1h),3.68(br d,j＝15.6hz,1h),3.24(br dd,j＝4.0,14.0hz,2h),3.18-3.05(m,3h),3.01-2.86(m,4h),2.73(s,3h),2.03-1.88(m,2h),1.83-1.67(m,6h),1.58(td,j＝6.8,14.0hz,1h),1.47(br s,3h),1.38-1.32(m,4h),0.79(br d,j＝7.2hz,1h),0.56-0.41(m,2h),0.23-0.10(m,2h)；ms m/z＝719.2[m+h]
+
。
[0195]
以下化合物使用与化合物3类似的方法合成得到：
[0196][0197]
实验例1：kappa受体camp测试
[0198]
溶液与缓冲液：
[0199]
实验缓冲液:1*hbss(+/+)(sigma#h1387)+20mmhepes(lonza#17-737e)
[0200]
刺激缓冲液(stb):200μm ibmx(sigma#i7018)和3μm nkh477(sigma#n3290)实验缓冲液实验方法与步骤：
[0201]
化合物的配制
[0202]
用dmso(amresco#0231)溶解化合物粉末，化合物溶液浓度为10mm。受试化合物取1μl，加入49μl dmso，稀释为200μm溶液。
[0203]
取一块ldv 384孔板，将上一步稀释后的化合物溶液按顺序分别加入a1～h1孔；取一支预先配好的200μm u-50488(tocris#0495/25)加入p1孔；向a2～a11，b2～h22，p2～p11各孔分别加入10.8μl dmso，1000rpm离心30秒。
[0204]
用bravo对化合物进行连续梯度稀释，以上一步准备的ldv板第1列为起始浓度列，每次吸取5μl至后一列并吹打混匀。
[0205]
稀释完成后，向a24孔加入10μl 200μm u-50488作为hpe(100％抑制率活性)，向p24孔加入10μl dmso作为zpe(0％抑制率活性)，1000rpm离心30秒。
[0206]
用echo 550按照实验布局，将上一步中稀释好的化合物溶液转移至实验板corning 3824，50nl每孔。
[0207]
实验步骤
[0208]
从-80℃冰箱取一支冻存的kor camp细胞，置于37℃水浴中解冻。
[0209]
待解冻完毕，吸取管内细胞至一支15ml离心管，并加入4ml实验缓冲液。
[0210]
1000rpm离心5分钟，弃上清，再加入5ml实验缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀。
[0211]
在细胞计数仪上计数并调整细胞密度至1.5*106个/ml。
[0212]
用multidrop combi将stb加至已含化合物的实验板中，每孔5μl。
[0213]
用multidrop combi将准备好的细胞悬液加至已含化合物的实验板中，每孔5μl。
[0214]
300rpm离心30秒，37℃培养箱内孵育40分钟。
[0215]
配制camp标准曲线，取一支预先配好并分装冻存的2848nm camp溶液解冻，以2848nm作为最高浓度点进行4倍连续梯度稀释，共16个浓度点。
[0216]
将稀释好的camp溶液用排枪转移至一块新的corning 3824实验板，每孔10μl，共3
列重复。
[0217]
待40分钟孵育完成后，用multidrop combi将d2(cisbio#62am4pej)加至实验板(包括标准曲线实验板)中，每孔5μl。
[0218]
用multidrop combi将ac(cisbio#62am4pej)加至实验板(包括标准曲线实验板)中，每孔5μl，室温孵育60分钟。
[0219]
实验板用envision读数。
[0220]
实验结果：
[0221]
结果见表1。
[0222]
表1化合物对kappa受体ec
50
值
[0223]
化合物编号ec
50
(nm)化合物10.085化合物20.311化合物30.040化合物40.034
[0224]
结果表明：本发明化合物具有显著的kappa受体激动作用。
[0225]
实验例2：血浆蛋白结合率(ppb)测试
[0226]
1.实验目的
[0227]
测定受试化合物在人、sd大鼠血浆中的蛋白结合率。
[0228]
2.实验方法
[0229]
2.1准备血浆
[0230]
将冻存的血浆置于流动的冷自来水中解冻，然后以3220
×
g离心5分钟并去除其中的悬浮物和沉淀物，测定血浆ph值，只有ph在7.0～8.0之间的血浆才可以用于实验。
[0231]
2.2溶液配制
[0232][0233]
2.3实验操作
[0234]
实验将采用96孔平衡透析板(htdialysis装置)来测定供试品和对照化合物的血浆蛋白结合率。实验开始前，将透析膜按照使用说明书进行预处理，然后按要求组装透析装置。取人、sd大鼠的空白血浆(血浆购买自bioreclamationivt)，加入受试化合物工作溶液或华法林工作溶液，使血浆样品中受试化合物与华法林终浓度均为2μm。将样品充分混合。移取50μl受试化合物和华法林血浆样品到样品接收板中，立即加入相应体积的对应空白血浆或缓冲液，使得每个样品孔的终体积为100μl，血浆：透析缓冲液的体积比为1:1，将终止溶液加入测试化合物和对照化合物的这些t0样品中。将板密封并以800rpm振荡10分钟。然后将这些t0样品与其他透析后样品一起保存在2-8℃下，等待与其它透析完的样品一起进
行后续处理；将150μl受试化合物和华法林血浆样品加入到每个透析孔的给药端，在透析孔对应的接收端中加入150μl空白透析缓冲液。然后将透析板封上透气膜后置于湿润的5％co2的培养箱中，在37℃、100rpm振荡孵育4小时。透析结束时，将来自透析装置的缓冲液侧和血浆(基质)侧的50μl样品等分试样放入新的96孔板(样品收集板)中。在每个样品中添加等体积的相对空白基质(缓冲液或血浆)以达到最终体积100μl，每个孔中血浆(基质)：透析缓冲液的体积比为1：1(v：v)。所有样品均经过蛋白质沉淀进一步处理，用于lc/ms/ms分析。并通过以下公式计算化合物的游离率(unbound)％、结合率(bound)％和回收率(recovery)％：
[0235]
％unbound＝100*fc/tc,
[0236]
％bound＝100-％unbound,
[0237]
％recovery＝100*(fc+tc)/t0。
[0238]
其中fc是透析板缓冲液端化合物的浓度；tc是透析板血浆端化合物的浓度；t0是零时刻血浆样品中化合物的浓度。
[0239]
3.实验结果
[0240]
结果见表2。
[0241]
表2化合物在人和大鼠血浆中的游离率
[0242][0243]
实验结论：本发明化合物在人和sd大鼠血浆中表现为非常高的血浆蛋白游离率。
[0244]
实验例3.细胞色素p450同工酶抑制活性测试
[0245]
1.实验目的
[0246]
测定受试化合物对人细胞色素p450同工酶不同亚型的抑制活性。
[0247]
2.实验方法
[0248]
准备受试化合物、标准抑制剂(100
×
最终浓度)和混合底物工作溶液；将冷冻于-80℃冰箱的微粒体(购自corning inc)取出解冻。将20μl的待测化合物和标准抑制剂溶液加至相应孔位，同时将20μl相应的溶剂加至无抑制剂对照孔位(nic)和空白对照孔位(blank)孔位；其次将20μl混合底物溶液加至相应孔位，blank孔位除外(将20μl pb加至blank孔位)；准备人肝微粒体溶液(使用后标记日期立刻放回冰箱)，随即将158μl人肝微粒体溶液加至所有孔位；将上述样品板放入37℃水浴预孵育，随即准备辅酶因子(nadph)溶液；10分钟后，添加20μl nadph溶液到所有孔位，样品板摇匀后，放入37℃水浴孵育10分钟；在相应时间点，加入400μl冷的乙腈溶液(内标为200ng/ml甲苯磺丁脲和拉贝洛尔)终止反应；样品板混合均匀后，4000rpm离心20分钟，沉淀蛋白质；取200μl上清加至100μl水中，摇匀后送lc/ms/ms检测。
[0249]
3.实验结果
[0250]
结果见表3。
[0251]
表3化合物对p450同工酶抑制的ic50值
[0252][0253]
实验结论：本发明化合物对cyp1a2、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6和cyp3a4-m的抑制ic
50
均大于50μm，无相关药药相互作用风险。
[0254]
实验例4：肝细胞中的代谢稳定性(hms)研究
[0255]
1.实验目的
[0256]
测试供试品在人和大鼠肝细胞中的代谢稳定性。
[0257]
2.实验材料
[0258]
2.1供试化合物(10mm)，对照品：7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin,30mm)，7-羟基基香豆素(7-hydroxycoumarin,对照品，30mm)
[0259]
2.2细胞
[0260]
肝细胞细胞活力供应商cat no.大鼠肝细胞85％bioreclamationivtm00005人肝细胞84％bioreclamation ivtx008001
[0261]
2.3缓冲体系：
[0262]
解冻培养基：威廉姆斯的培养基e含5％胎牛血清和30％percoll溶液及其他辅助用品。
[0263]
孵育培养基：威廉姆斯培养基e(不含酚红)，其中包含2mm l-谷氨酰胺和25mm羟乙基哌嗪乙硫磺酸。
[0264]
终止溶液：乙腈中含有200ng/ml的甲苯磺丁酰胺和拉贝洛尔作为内标。
[0265]
稀释溶液：超纯水。
[0266]
3.实验方法
[0267]
1)将准确量的阳性对照化合物溶解在二甲基亚砜(dmso)中，配制成30mm溶液。
[0268]
2)在96孔板上用dmso将10mm测试化合物和30mm阳性对照化合物稀释至1mm和3mm。
[0269]
3)用乙腈将1mm的测试化合物和3mm的阳性对照化合物稀释到100μm和300μm的定量溶液中。
[0270]
4)将冻存的细胞融化，分离并悬浮在培养液中，然后用预热的培养液稀释至0.5
×
106cells/ml。
[0271]
5)在96孔板中添加198μl预热的细胞悬液。
[0272]
6)在一组预先标记的96孔板中转移100μl终止溶液(乙腈含有200ng/ml的甲苯磺丁酰胺和200ng/ml的拉贝洛尔作为内标)。
[0273]
7)向96孔板的每个孔中一式两份加入2μl 100μm测试化合物或300μm阳性对照定量溶液。
[0274]
8)对于t0样品，混合以达到均匀悬浮约1分钟，然后立即将每个样品20μl转移到含有100μl冰冷终止溶液的孔中，然后混合。
[0275]
9)在95％加湿的培养箱中，在5％co2中于37℃孵育所有平板，以约600rpm的恒定
摇动开始反应。
[0276]
10)在15、30、60和90分钟时，混合样品，然后在每个时间点将20μl每个样品转移到含有100μl冰冷终止溶液的孔中，然后混合。
[0277]
11)通过在每个孔中添加除细胞悬液以外的相同成分，在t0和t
90
制备培养基对照(mc)样品板(标记为t0-mc和t90-mc)。生成最终浓度表
[0278]
12)在每个相应的时间点，通过从培养箱中移出平板并与100μl冰冷的终止溶液混合来终止反应。
[0279]
13)立即在平板振荡器上以500rpm涡旋振荡平板10分钟。然后，将所有样品板在4℃下以3220x g离心20分钟。
[0280]
14)离心后，将35μl/孔的样品板中的上清液转移至另一组预先标记的96孔板中，该板根据板图包含70μl超纯水。
[0281]
15)将分析板密封并在4℃下储存，直到lc-ms-ms分析为止。
[0282]
通过下面公式求得受试化合物和对照化合物的剩余率：
[0283][0284]
通过绘制时间对剩余率的对数作图计算受试化合物和对照化合物在肝细胞中的消除速率常数k，以消除速率k求得半衰期(t
1/2
)和体外固有清除率(cl
int
)，公式如下：
[0285]
t
1/2
＝0.693/k
[0286]
cl
int
(hep)＝k/每毫升细胞量(million cells/ml)
[0287]
cl
int
(liver)＝cl
int
(hep)
×
肝重体重比
×
每克肝脏中的肝细胞数量
[0288]
公式中各种属的参数如下表：
[0289][0290]
4.实验结果
[0291]
结果见表4。
[0292]
表4化合物在人和大鼠肝固有清除率
[0293][0294]
实验结论：本发明化合物在人和大鼠中均为低清除。
[0295]
实验例5：sd大鼠体内药代动力学研究
[0296]
1.实验目的：
[0297]
测试化合物在sd大鼠体内药代动力学
[0298]
2.实验材料：
[0299]
sprague dawley大鼠(雄性，6～10周龄，购自北京维通利华实验动物有限公司)
[0300]
3.实验方法：
[0301]
将化合物1与生理盐水水混合，制备得到1mg/ml的澄清溶液，用于注射组给药，微孔滤膜过滤后备用。静脉注射给予受试化合物3mg/kg，静脉给药的溶媒为生理盐水。动物于给药后0,0.083,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,24小时采集血浆样品。采用lc-ms/ms法测定血药浓度，使用winnonlin
tm version 6.3(pharsight,mountain view,ca)药动学软件，以非房室模型线性对数梯形法计算相关药代动力学参数。
[0302]
4.实验结果
[0303]
实验结果如下表5：
[0304]
表5化合物1在大鼠上的药代动力学数据
[0305] c0(μm)t
1/2
(hr)vd
ss
(l/kg)cl(ml/min/kg)auc
0-last
(μm.hr)化合物117.61.330.299.907.2
[0306]
注：c0为起始浓度，t
1/2
为消除半衰期，vd
ss
为稳态表观分布容积，cl为总清除率，auc
0-last
为从0时间到最后一个可定量时间点的血浆浓度-时间曲线下面积。
[0307]
实验结论：本发明化合物具有良好的药代动力学性质。
[0308]
实测例6：膜渗透性和外排mdr1测试
[0309]
1.实验目的：
[0310]
mdr1-mdck ii细胞是一种转染了人的mdr1基因的madin-darby犬肾细胞，该细胞能稳定高表达p-gp。本研究的目的是测试化合物穿过mdr1-mdck ii细胞模型的双向渗透性，并评估其是否被外排转运。
[0311]
2.细胞培养：
[0312]
将mdr1-mdckⅱ细胞(从荷兰癌症研究所的piet borst获得)以2.5x 105细胞/ml的密度接种到96孔插入系统中的聚乙烯膜(pet)上，直到4-7天，形成融合细胞单层。
[0313]
3.实验方法
[0314]
将测试化合物用运输缓冲液(hbss，含dmso的10mm hepes，ph7.4)稀释，浓度为2μm(dmso《1％)，并涂在细胞单层的顶侧或基底外侧。重复测定从a到b方向或b到a方向的待测化合物，地高辛从a到b方向或b到a方向也以10μm进行测试，而纳多洛尔和美托洛尔在a到b中以2μm进行测试将板在37
±
1℃的co2培养箱中于饱和湿度为5％的co2中孵育2.5小时，不摇动，此外，还测定了每种化合物的流出比，对测试和参考化合物进行了定量。根据分析物/is的峰面积比通过lc/ms/ms分析。转运测定后，采用路西法黄排斥测定来确定细胞单层完整性。从顶室和基底外侧室中除去缓冲液，然后分别在转运缓冲液中添加75μl 100μm萤光黄和在顶端和基底外侧室中添加250μl输送缓冲液。将板在37℃，5％co2和饱和湿度下孵育30分钟，不要摇动。孵育30分钟后，从顶端提取20μl萤光素黄色样品，然后添加60μl运输缓冲液。然后从基底外侧采集80μl的萤光黄样品。用envision酶标仪在425/528nm(激发/发射)下测量荧光素黄的相对荧光单位(rfu)。
[0315]
4.数据计算
[0316]
采用如下公式计算表观渗透系数(p
app
,cm/s)，外排率以及回收率。
[0317]
表观渗透系数(p
app
,cm/s)采用如下公式计算：
[0318]
p
app
＝(dcr/d
t
)
×vr
/(a
×
c0)
[0319]
dcr/d
t
是化合物在单位时间内接收端的累积浓度(μm/s)；vr是接收端溶液的体积(顶端和基底端的溶液体积分别为0.075ml和0.250ml)；a是胞单层的相对表面积(0.0804cm2)；c0是给药端供试品的起始浓度(nm)或对照品的峰面积比值。
[0320]
外排比采用如下公式计算：
[0321]
外排比＝p
app
(ba)/p
app
(ab)
[0322]
回收率采用如下公式计算：
[0323]
％回收率＝100
×
[(vr×cr
)+(vd×cd
)]/(vd×
c0)
[0324]
c0是给药端供试品的起始浓度(nm)或对照品的峰面积比值；vd是给药端的体积(顶侧为0.075ml，基底侧为0.250ml)；cd和cr分别为给药端和接收端供试品的终浓度(nm)或对照品的峰面积比值。
[0325]
基底外侧孔中的萤光黄的百分比使用以下公式计算：
[0326][0327]
其中rfuapical和rfubasolateral分别是顶端和基底外侧孔中萤光黄的相对荧光单位值；vapical和vbasolateral孔分别是顶孔和基底外侧孔的体积(0.075ml和0.25ml)。％荧光黄应小于2。
[0328]
5.实验结果
[0329]
结果见表6。
[0330]
表6化合物对mdr1细胞膜渗透性数据
[0331]
化合物编号p
app
(ab)(10-6
cm/s)p
app
(ba)(10-6
cm/s)外排比化合物1《0.120.38》3.14
[0332]
实验结论：本发明化合物的渗透性更低，外排率更高，预示着进脑风险更低。
[0333]
实测例7：小鼠瘙痒症模型
[0334]
1.实验目的
[0335]
测定受试化合物对小鼠瘙痒的抑制作用。
[0336]
2.实验方法
[0337]
每组使用12只雄性cd-1小鼠(25～30g)，每只动物称重后分组，并将小鼠单独放入观察箱适应10分钟。尾静脉注射生理盐水或受试化合物(0.1和0.3mg/kg)，注射药物15分钟后，在小鼠颈背部皮下注射化合物48/80(sigma)(50μg/只，溶于0.1ml生理盐水中)。随后记录皮下注射后30分钟内动物后肢挠背(瘙痒)次数，并使用graphpad prism分析并检验。
[0338]
3.实验结果
[0339]
结果见图1。注：树状图表示小鼠瘙痒次数平均值，散点图表示每只小鼠瘙痒次数。
[0340]
实验结论：本发明化合物具有优异的抑制瘙痒的效果。