双生病毒dna1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法
技术领域
1.本发明涉及农业昆虫与害虫防治，具体涉及双生病毒dna1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，即将双生病毒tbcsv改造的沉默载体诱导的烟粉虱基因沉默效果遗传给下一代的方法。
背景技术：
2.设施蔬菜栽培产业不断发展，在为人类带来丰富的蔬菜产品的同时，其特殊的栽培环境也加重了病虫害的发生与为害，长期的化学防治已引起了害虫的抗药性、农药残留等问题，抗药性治理与非化学防控措施越来越受到重视，但是农业生产中依靠农药的现状并未完全改变。烟粉虱的田间防治中，化学农药的大量使用，使烟粉虱的抗药性也越来越强，为了避免进入农药使用量增加和抗药性增强的恶性循坏，分子生物学技术在病虫害防治的作用逐渐得到重视。
3.rna干扰(rnai)已被作为一种防控害虫的方法，病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing, vigs)是可应用于田间的一种简单而有效的rnai方法。2mdna1沉默表达载体是双生病毒tbcsv的dna1组分， 2mdna1载体介导的基因沉默效果能否通过烟粉虱的卵遗传给下一代，放大基因沉默效果还未可知，避开通过基因编辑的技术难点获得害虫下一代基因沉默表型，并有效应用于田间防治的应用方法尚不清楚。
技术实现要素：
4.为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提出双生病毒dna1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，将2mdna1载体通过显微注射、人工饲料的方式接种至烟粉虱体内，将2mdna1介导的烟粉虱基因沉默效果可以遗传给下一代，为烟粉虱基因功能研究和烟粉虱防治提供有效途径。
5.本方案是通过以下技术方案实现的，双生病毒dna1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法，其技术要求是：包括以下步骤：（1）2mdna1沉默表达载体构建
①ꢀ
获取烟粉虱基因靶标片段btbiob的pcr纯化产物
②ꢀ
所述靶标片段biob的pcr纯化产物、2mdna1载体分别进行双酶切，获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段、2mdna1载体片段；
③ꢀ
所述含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段与2mdna1载体片段连接，获得2mdna1-biob连接产物；
④ꢀ
所述2mdna1-biob连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α；热击处理后进行2mdna1特异性检测，获得2mdna1-biob重组沉默表达载体；
⑤
提取烟草曲茎病毒tbcsv质粒；（2）获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱采用显微注射法或人工饲喂法任一种接种烟粉虱；
①
显微注射法具体为：将2mdna1-biob沉默表达载体、tbcsv的质粒分别用注射缓冲液稀释到100 ng/μl；二者按照体积比2mdna1-biob：tbcsv=1：1混合，获得2mdna1-biob沉默表达载体接种液；取羽化1 d的烟粉虱进行显微注射，注射2mdna1-biob沉默表达载体接种液，所述烟粉虱的雌雄比例为1:1，雌虫注射量为100头/μl，雄虫注射量为200头/μl，获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱；
②
人工饲喂法具体为：采用2mdna1-biob人工饲料饲喂烟粉虱；所述2mdna1-biob人工饲料的配方为：所述2mdna1-biob人工饲料的配方为：2mdna1-biob沉默表达载体 0.05 g/l，tbcsv质粒 0.05 g/l，蔗糖 300 g/ l；饲喂的烟粉虱为羽化1 d的烟粉虱，所述烟粉虱雌雄比为1:1，饲养条件温度25
ꢀ±ꢀ
3℃，相对湿度60 %
ꢀ‑
70 %，光照周期l : d = 14 h : 10 h，饲养3 d，最终获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱，所述f0代烟粉虱生物素合成基因biob表达被抑制、生物素含量降低；（3）田间释放f0代烟粉虱，用于与田间正常烟粉虱交配产卵，获得下代携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱，下代携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱生物素合成基因biob表达被抑制、生物素含量降低。
6.进一步的，所述烟粉虱基因靶标片段btbiob具有seq id no：1所示的核苷酸序列；所述烟粉虱基因靶标片段btbiob获取的方法为：以烟粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为p-biob-f和p-biob-r，所述p-biob-f具有seq id no：2所示的核苷酸序列，所述p-biob-r具有seq id no：3所示的核苷酸序列；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段biob的pcr纯化产物。
7.进一步的，所述靶标片段biob的pcr纯化产物、2mdna1载体双酶切均采用takara 公司的quickcut限制性内切酶试剂盒；反应条件均为：30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活。
8.进一步的，所述含有bamhi和xbai粘性末端的biob靶标基因片段和2mdna1载体片段连接采用t4 dna ligase试剂盒，把靶标基因biob片段：2mdna1载体片段体积比为6.5 μl：1.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-biob连接产物。
9.进一步的，所述f0代烟粉虱通过2mdna1特异性检测确定携带2mdna1-biob沉默表达载体，所述2mdna1特异性检测引物为dna1f和dna1r ，所述dna1f具有seq id no：4所示的核苷酸序列，所述dna1r具有seq id no：5所示的核苷酸序列。
10.进一步的，所述注射缓冲液配方为： kcl 5mm， nah2po
4，
0.1mm，ph 6.8。
11.本发明的有益效果：（1）本发明建立了将2mdna1载体接种至烟粉虱体内的方法，证明了2mdna1介导的烟粉虱基因沉默效果可以遗传给下一代，为烟粉虱基因功能研究和烟粉虱防治提供有效途径；（2）对携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱进行追踪调查结果表明，携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱具有多代遗传的特点，携带2mdna1-biob沉默表达载体
的烟粉虱即使未在产卵或交配前死亡，其下一代也具有该载体，具有种群逐渐消亡的特点。
具体实施方式
12.双生病毒dna1分子诱导可遗传的烟粉虱基因沉默方法1．2mdna1沉默表达载体构建1.1 烟粉虱基因靶标片段的获取所述基因靶标片段btbiob具有seq id no：1所示的核苷酸序列：atggctttga gatggtcgct ggaggaggct ttgcgagtgt tcaaattacc gatggcagacttgatgtatc aggcccagtc tacccaccgg gccaacttca accctaacga aatgcaaatcagcacgcttc tgagcatcaa gacgggcgct tgcccagaaa actgctcgta ctgtccccagtcagcctact acaaaacgga gatcaagaag gagcctctga tggatttagc ggaggttgttgccgccgcga aggcagccaa agagggtgga agtacccgtt tctgcatggg tgctgcttggcgtggaccca ctgacaggaa tctcccgttg gtctgtgata tggtcaaaga ggtgaagaagttgggtctag agacttgcgt tacattagga cttctgaagg accgccacgc ggtacaactaaaagaggccg gactggactt ctacaaccac aacatcgaca cgtcgccgga gtactacaagaagatcatct cgacgaggac tttcgaggat cgaatccgga ccctggagca cgtgcgcaacgccgggatca aggtctgctg cggcgggatc ctcgggatgg gcgagaacac cgaggaccggatcaagatgc tcctggtgtt ggcgaacctg gaggagcctc ctgaatcagt cccgatcaatcagctgattc cgatccctgg gactccactc gccgatgcgg atcccgtcga gggcaccgacttcgtgcgga ccatcgctct cacccgggtc atgatgccca aggcctacat ccgtctctccgccggccggg agaacatgtc cgaggagatg cagacgctct gttttttggc gggagtcaactctatcttct acggcgagaa gctcctcacg gccaagaact tccagccgag caaggacgatcagttactca gtaagctcgg cttcaagaag atggagatcg atgagacgcc ggccagcagtcagtgtaagg aggcggccat tgggtga所述烟粉虱基因靶标片段获取的方法为：以烟粉虱cdna为模板，用引入了bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述bamhi和xbai两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为：p-biob-f（seq id no：2）:cgggatcctcgggatgggcg；p-biob-r（seq id no：3）:gctctagatcacccaatggccgcctc）；所述靶标基因片段长度为100-1000 bp，测序验证后用promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段biob的pcr纯化产物；可参考：ren fr, sun x, wang ty, yao yl, huang yz, zhang x, et al. biotin provisioning by horizontally transferred genes from bacteria confers animal fitness benefits. isme j. 2020; 14(10):2542-53。
13.1.2 靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体双酶切采用takara 公司的quickcut试剂盒；所述靶标片段pcr纯化产物与2mdna1载体反应条件：分别30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活；获得含有bamhi和xbai两个粘性末端的靶标基因biob片段和2mdna1载体片段；
1.3 靶标基因biob片段与2mdna1载体片段连接使用t4 dna ligase（promega公司的酶）将含有bamhi和xbai粘性末端的biob靶标基因片段，和2mdna1载体片段按照t4 dna ligase配套的说明书，把靶标基因biob片段：2mdna1载体片段体积比为6.5 μl：1.5 μl，混匀后4℃过夜连接，获得2mdna1-biob连接产物；1.4 2mdna1-biob连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌dh5α具体操作步骤如下：（1）取一管-80℃冰箱保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞（购买于takara公司），置冰上融化；（2）在超净工作台中，取一无菌的2ml离心管，加入10 μl2mdna1-biob连接产物、50 μl感受态细胞，轻弹混匀，冰浴10-30 min；（3）42 ℃热击60-90 s后迅速置冰上冷却5 min；（4）加入940 μl lb液体培养基（无抗生素），于37 ℃、200 rpm摇床中振荡培养1 h；（5）8,000 rpm离心1 min，留下200 μl沉淀，重悬菌液后分别取适量均匀涂布于lb-kana平板（x-gal（20 μl）、iptg（10 μl），37 ℃倒置培养过夜。
14.（6）用无菌小号枪头挑取白色单菌落于lb-kana液体培养基中，37 ℃条件下，摇床230 rpm培养8-10 h 后做相关检测。
15.参考的文献：huang, c.j., xie, y., & zhou, x.p. (2010). efficient virus
‐
induced gene silencing in plants using a modified geminivirus dna1 component. plant biotechnol j, 7(3), 254-265；黄昌军（2009）双生病毒dna1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用。
16.转化后大肠杆菌菌液pcr进行 2mdna1特异性检测；引物dna1f（seq id no：4）:gtatgagcctttaatggcc；引物dna1r（seq id no：5）:gagactcttcctcttgcc；验证正确的菌株即含有2mdna1-biob重组质粒，在大肠杆菌dh5α中大量培养复制，通过天根公司的质粒小提试剂盒提取菌体的重组质粒，即为2mdna1-biob重组沉默表达载体，按照体积比2mdna1-biob：tbcsv=1：1将二者混合，通过显微注射方法给羽化1 d的烟粉虱（数量比雌：雄=1:1）注射。注射1.5 d后，对照组和处理组分别单独取24头雌虫，单头提dna（luan et al., 2018），通过载体的特异性引物dna1f和dna1r检测其携带载体情况（黄昌军，2009；谢艳等，2002）。本步骤获得携带2mdna1-biob沉默表达载体和2mdna1空载体的烟粉虱，这些烟粉虱被称为f0代。
17.1.5提取烟草曲茎病毒(tbcsv)质粒通过天根公司的质粒小提试剂盒，质粒提取最后一步用注射缓冲液（ghanimet al., 2007）将质粒洗脱出来，获得2mdna1-biob沉默表达载体、tbcsv的质粒，把这些质粒的浓度调整到500 ng/μl。
18.所述注射缓冲液配方参照ghanim（2007）的方法，终浓度为5mm kcl、0.1mm nah2po4、ph 6.8；
ghanim, m. , kontsedalov, s. , & czosnek, h. (2007). tissue-specific gene silencing by rna interference in the whitefly bemisia tabaci (gennadius).insect biochemistry & molecular biology, 37(7), 732-738.2．获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱采用显微注射法或人工饲喂法任一种接种烟粉虱；（1）显微注射法参照栾军波、闫金阳（2020）一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法（申请号2020101560275）；将2mdna1-biob沉默表达载体、tbcsv的质粒（辅助沉默表达载体复制）分别用注射缓冲液稀释到100 ng/μl；二者按照体积比2mdna1-biob：tbcsv=1：1混合，获得处理组2mdna1-biob沉默表达载体接种液；另将 2mdna1：tbcsv=1：1将注射液混匀，获得对照组接种液，取羽化1 d的烟粉虱进行显微注射，注射2mdna1-biob沉默表达载体接种液和对照组接种液，所述烟粉虱的雌雄比例为1:1，雌虫注射量为100头/μl，雄虫注射量为200头/μl，获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱；对照组和处理组分别单独取24头雌虫，单头提dna（luan et al., 2018），通过载体的特异性引物dna1f和dna1r检测其携带载体情况（黄昌军，2009；谢艳等，2002）。本步骤获得携带2mdna1-biob沉默表达载体和2mdna1空载体的烟粉虱。
19.通过qrt-pcr以βactin为内参，用2-δct
法分析数据。取处理组合对照组中携带载体的fo代烟粉虱雌虫（对照组2mdna1-control，处理组2mdna1-biob），5头雌虫每个生物学重复提rna，对照处理分别用all-in-one cdna synthesis supermix（bimake，usa）反转录到相同的浓度，通过qrt-pcr检测其biob基因表达情况，这些烟粉虱biob基因被沉默，引物为：qrt-biob-f（seq id no：6）： gtcgccggagtactacaaga；qrt-biob-r（seq id no：7）：cgcagcagaccttgatcc；βactin
ꢀ‑
f（seq id no：8） ：tggagatggtgtttcccacac；βactin
ꢀ‑
r （seq id no：9）ccagccaagtccaaacgaag）；结果为：对照组死亡率10%-20%，处理组死亡率70%-80%；处理组较对照组biob基因表达下调60%-80%。（2）人工饲喂法具体为：采用2mdna1-biob人工饲料饲喂烟粉虱；所述2mdna1-biob人工饲料的配方为：所述2mdna1-biob人工饲料的配方为：2mdna1-biob沉默表达载体0.05g/l，tbcsv质粒0.05g/l，蔗糖300g/l；饲喂的烟粉虱为羽化1 d的烟粉虱，所述烟粉虱雌雄比为1:1，通过玻璃双通管（直径约2.5 cm，高约7 cm），一端用薄的封口膜封好后加200μl人工饲料，再用一层厚的封口膜封好，另一端用纱布封好。最后把玻璃管用锡箔纸保住，放在光照培养箱中（温度25
ꢀ±ꢀ
3℃，相对湿度60 % ~ 70 %，光照周期l : d = 14 h : 10 h）饲养3 d，最终获得携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱，所述f0代烟粉虱生物素合成基因biob表达被抑制、生物素含量降低；结果为：饲喂人工饲料后烟粉虱死亡率为70%-80%；生物素合成基因biob表达下调60%-80% 。3. f0代烟粉虱2mdna1-biob沉默表达载体的遗传性将步骤2中获得的携带2mdna1-biob沉默表达载体的f0代烟粉虱用夹叶笼固定在棉花上，每夹叶笼中释放30-50头烟粉虱（数量比雌：雄=1：1）使其产卵，卵继续发育到f1代成虫羽化，取羽化1 d的烟粉虱单头提dna，参照2.2中方法，检测其携带载体情况，用dna1f
和dna1r通过普通pcr检测，检测后烟粉虱f1代成虫携带载体比例，可接着检测棉花上烟粉虱后代f1代biob基因表达情况。
20.检测结果为：烟粉虱f1代携带沉默表达载体的比例约为60%-70%；烟粉虱f1代死亡率50%-60%；biob基因表达下调50%-70%；可见：田间释放f0代烟粉虱，用于与田间正常烟粉虱交配产卵，获得下代携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱，下代携带2mdna1-biob沉默表达载体的烟粉虱生物素合成基因biob表达被抑制、生物素含量降低。
21.vigs效果可以由烟粉虱雌虫遗传给下一代，可以看到烟粉虱下一代基因沉默表型，放大基因沉默效果。
22.本具体实施方式中参考文献：ren fr, sun x, wang ty, yao yl, huang yz, zhang x, luan jb. 2020. biotin provisioning by horizontally transferred genes from bacteria confers whitefly fitness benefits.isme journal, 14: 2542
–
2553；luan jb, sun xp, fei z, douglas ae. 2018. maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly bemisia tabaci. current biology, 28, 459-465；栾军波、闫金阳（2020）一种粉虱类小型昆虫成虫显微注射方法；黄昌军（2009）双生病毒dna1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用；谢艳, 等. (2002) 粉虱传双生病毒的tas-elisa及pcr快速检测[j]. 植物病理学报, 2: 87-91.）。