邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物及其制备方法及应用

1.本发明涉及化学技术和药学技术领域，尤其是一种邻羟基苯乙酰拼接双吲哚 甲基类化合物及其制备方法及应用。


背景技术：

2.根据药物设计的活性骨架拼接和迁越原理，把两个或多个具有生物活性骨架 拼接成一个潜在生物活性的多骨架分子在有机化学和医药化学中是极其重要的 研究领域。(1)邻羟基苯乙酰骨架广泛存在天然产物和合成药物分子中，吸引了 许多化学工作者及医药化学团队的广泛关注,如化合物olympicin a,tatarinoid a, norbrachycoumarin和aspidinol。(2)双吲哚骨架也普遍存在天然产物和药物分 子中,如化合物arundine,vibrindole a,arsindoline a,streptindole和arsinoline b。 这些化合物在解除病痛、经济发展中起着重大作用。鉴于吡喃、邻羟基苯乙酰骨 架和双吲哚骨架具有潜在的生物活性。因此，把邻羟基苯乙酰骨架拼接到双吲哚 骨架上，合成一系列新的潜在多活性官能团的邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化 合物。特别说明的是:所合成的邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物可以为生 物活性筛选提供化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值(如图 8所示)。


技术实现要素：

3.本发明的目的是：提供一种邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物及其制备 方法与应用，它是一类重要的医药中间体类似物和药物分子类似物，对药物筛选 和制药行业具有重要的应用价值，且其合成方法非常经济简便。
4.本发明还发现该类化合物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
5.本发明是这样实现的：一种邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物，该化合 物具有如下通式(i)的结构：
[0006][0007]
式中，r1为甲基或溴或氯或氢；r2为甲基或甲氧基或氟或氯或溴或氢；r3为甲基或氢。
[0008]
具体为如下结构之一：
[0009][0010]
邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物的制备方法，在有机溶剂中，在有机 质子酸催化剂催化下，将各种取代的吲哚和各种取代的色酮-3-甲酸，发生双 michael加成与开环反应，获得邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物。
[0011]
合成路线举例如下：
[0012][0013]
其中合成路线中的化合物，其取代基满足式中，r1为甲基或溴或氯或氢； r2为甲基或甲氧基或氟或氯或溴或氢；r3为甲基或氢。
[0014]
反应机理举例如下：
[0015][0016]
所述的有机溶剂为有机溶剂为甲苯、乙腈、四氢呋喃或乙醇。
[0017]
所述的有机质子酸催化剂为：对甲基苯磺酸、苯基磺酸、甲基磺酸、樟脑磺 酸或三氟乙酸。
[0018]
各种取代的吲哚和各种取代的色酮-3-甲酸，发生双michael加成与开环反 应，温度为70℃至90℃，反应时间为6至12小时。
[0019]
邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
[0020]
通过采用上述技术方案，在有机溶剂中，在有机质子酸催化剂催化下，将各 种取代的吲哚和各种取代的色酮-3-甲酸，发生双michael加成与开环反应，获得 邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物，该骨架化合物可以为生物活性筛选提供 化合物源，对药物的筛选和制药行业具有重要的应用价值。且该骨架化合物对人 人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)、人 克隆结肠腺癌细胞(caco-2)具有抑制活性的作用。本发明操作简单易行，原料 合成便宜易得，可以在各种有机溶剂中进行，也具有较好的空气稳定性，适用性 广，对于各种取代基都有很好的兼容性。
附图说明
[0021]
图1及图2为本发明的实施例的化合物1谱图数据；
[0022]
图3及图4为本发明的实施例的化合物2谱图数据；
[0023]
图5及图6为本发明的实施例的化合物3谱图数据；
[0024]
图7为本发明的实施例的化合物2和7单晶图；
[0025]
图8为本发明所合成的化合物的设计思路及其创造性；
[0026]
图9为本发明化合物19对正常细胞和肿瘤细胞有选择性药理图；
[0027]
图10为本发明化合物3e对a549细胞集落形成的抑制作用药理图；
[0028]
图11为本发明化合物19诱导a549细胞凋亡作用药理图；
[0029]
不同浓度化合物19处理a549细胞48h：(a)ao-eb荧光染色；(b)hoechst 33258 染色；(c)采用annexin v-fitc/pi染色结合流式细胞仪检测化合物19诱导的 a549细胞凋亡；(d)通过流式细胞术定量分析a549细胞的凋亡率；(e)通过 dna ladder检测实验，观察化合物19诱导的a549细胞凋亡。进行三组独立实 验，实验数据以平均值
±
标准误的形式表示。(与空白对照组相比，*p《0.05， **p《0.01)
[0030]
图12为本发明化合物19能提高a549细胞的活性氧水平，降低线粒体膜电 位作用药理图；
[0031]
用不同浓度的化合物19处理a549细胞48h。(a)化合物19对a549细胞中ros 诱导的影响。(b)化合物19对a549细胞线粒体膜电位的影响。
[0032]
图13为本发明化合物19通过线粒体途径诱导a549细胞凋亡作用药理图； 通过western blot实验分析测定化合物19对a549细胞中凋亡相关蛋白表达的 影响。用指定浓度的化合物19处理48h后，a549细胞中p53、bax、bcl-2、 cyt c、cleaved caspase-9/-3/parp的蛋白质表达情况(图a和b)。化合物19影 响的a549细胞中促凋亡和抗凋亡蛋白的定量分析(图c至h)。进行三组独立 实验，实验数据以平均值
±
标准误的形式表示。(与空白对照组相比，*p《0.05， **p《0.01)
[0033]
图14为本发明化合物19抑制a549细胞的迁移作用药理图；通过划痕实验和transwell迁移实验检测化合物19抑制a549细胞的迁移能力。 用不同浓度化合物19处理a549细胞24h后进行划痕实验的效果和数据分析(图 a和c)。用不同浓度化合物19处理a549细胞24h后进行transwell迁移实验 的效果和数据分析(图b和d)。
进行三组独立实验，实验数据以平均值
±
标准误的形式表示。(与空白对照组相比，*p《0.05，**p《0.01)图15为本发明化合物19诱导a549细胞周期阻滞在g0/g1期药理图；化合物19处理a549细胞48h后的细胞周期变化情况。(a)a549细胞经化合物19作用后，用乙醇固定，pi染色，然后流式细胞术分析。(b)进行三组独立实验，实验数据以平均值
±
标准误的形式表示。(与空白对照组相比，*p《0.05，**p《0.01)图16为本发明化合物19对a549细胞形态的影响药理图；化合物19处理a549细胞48h后的形态学观察。
具体实施方式
[0034]
本发明的实施例：在反应管中依次加入色酮-3-甲酸(0.3mmol)，吲哚(1.5mmol)，苯基磺酸(0.06mmol,9.5mg)和0.3ml甲苯，80℃中搅拌反应12小时,tlc检测基本反应完全，上样经柱层析[洗脱剂：v(石油醚)：v(乙酸乙酯)＝3:1]纯化得化合物1，黄色固体,熔点：162.3-163.1℃；产率67％。
[0035]
核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.69(s,6h),3.97(d,j＝7.6hz,2h),5.14(t,j＝7.6hz,1h),6.91-6.95(m,4h),7.06-7.09(m,2h),7.25(s,2h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),7.48-7.54(m,3h),7.97(d,j＝8.4hz,1h),11.89(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:29.2,32.8,45.2,110.0,117.7,118.7,119.5,121.4,127.1,131.3,136.6,137.2,161.1,205.3；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
27h24
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+
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[0036]
表1为一种邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物的化学结构
[0037][0038]
表2为一种邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物的化学结构
[0039][0040]
化合物2至22的制备方法同化合物1，投料比与化合物1相同，可得到化合物2至22，反应产率见表1和表2，但需强调的是本发明的化合物不限于表1和表2所表示的内容。
[0041]
本实施例制备化合物2:黄色固体,熔点：167.6-168.3℃；产率81％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.07(d,j＝7.2hz,2h),5.26(t.j＝7.2hz,1h),6.79-6.85(m,2h),6.88-6.91(m,2h),7.23-7.26(m,2h),7.31-7.34(m,2h),7.46(s,2h),7.48-7.50(m,1h),8.09-8.12(m,1h),10.13(brs,2h),12.36(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:29.9,43.5,103.8(d,j
cf
＝23.4hz),109.3(d,j
cf
＝27.0hz),112.1,112.2,112.3,117.9,118.2,118.3,118.9,119.8,124.2,124.4,127.1,130.8,133.6,133.7,136.3,157.1(d,j
cf
＝230.4hz),162.4,205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
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:439.1229；found:439.1233.
[0042]
本实施例制备化合物3:黄色固体,熔点：152.1-152.8℃；产率83％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.02(d,j＝7.2hz,2h),5.31(t,j＝7.2hz,1h),6.70-6.76(m,2h),6.86-6.90(m,2h),7.06-7.09(m,2h),7.30-7.31(m,2h),7.45-7.49(m,1h),7.53-7.56(m,2h),8.05-8.07(m,1h),10.09(brs,2h),12.35(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:29.9,43.8,97.3(d,j
cf
＝26.3hz),106.8(d,j
cf
＝24.2hz),117.9,118.5,118.9,119.8,120.0,120.1,122.8,123.6,130.7,136.3,136.9,159.6(d,j
cf
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:439.1229；found:439.1234.
[0043]
本实施例制备化合物4:黄色固体,熔点：184.7-185.2℃；产率81％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.85(d,j＝7.2hz,2h),5.56(t,j＝7.2hz,1h),6.50-6.55(m,2h),6.73-6.81(m,2h),6.85-6.90(m,2h),6.96(s,2h),7.04(d,j＝8.4hz,2h),7.32-7.36(m,1h),7.99(d,j＝8.0hz,1h),10.09(brs,2h),12.20(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:31.0,45.3,103.7(d,j
cf
＝21.3hz),107.8,115.3(d,j
cf
＝20.2hz),119.0,121.7,121.8,122.9,130.6,136.3,139.9,140.0,157.0(d,j
cf
＝242.1hz),162.5,205.5；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
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+
:439.1229；found:439.1223.
[0044]
本实施例制备化合物5:黄色固体,熔点：110.8-111.4℃；产率82％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.05(d,j＝7.2hz,2h),5.29-5.33
(m,1h),6.86-6.93(m,4h),7.35-7.39(m,4h),7.45-7.49(m,1h),7.54(d,j＝8.4hz,2h),8.05-8.07(m,1h),10.17(brs,2h),12.33(brs,1h)；
13
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+
:472.3202；found:472.3206.
[0045]
本实施例制备化合物6:黄色固体,熔点：157.6-158.3℃；产率72％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.09(d,j＝7.2hz,2h),5.35(t,j＝7.2hz,1h),6.88-6.95(m,4h),7.09-7.11(m,2h),7.44(s,1h),7.56(d,j＝8.0hz,2h),8.10-8.12(m,1h),10.32(brs,2h),12.31(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:29.9,43.7,116.2,117.9,118.2,118.9,119.5,120.8,123.5,128.7,130.8,133.9,136.4,162.4,205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
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:471.0638；found:471.0643.
[0046]
本实施例制备化合物7:黄色固体,熔点：167.2-167.9℃；产率83％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.07(d,j＝7.2hz,2h),5.30(t,j＝7.2hz,1h),6.89-6.93(m,2h),7.13-7.15(m,2h),7.31(d,j＝8.8hz,2h),7.43(s,2h),7.47-7.51(m,1h),7.73(s,2h),8.10-8.13(m,1h),10.25(brs,2h),12.31(brs,1h)；
13
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[0047]
本实施例制备化合物8:黄色固体,熔点：83.8-84.5℃；产率84％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.02(d,j＝7.6hz,2h),5.31(t,j＝7.6hz,1h),6.84-6.89(m,2h),7.03-7.05(m,2h),7.33(s,2h),7.43-7.51(m,3h),7.55(s,2h),8.02-8.05(m,1h),10.2(brs,2h),12.33(brs,1h)；
13
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+
:558.9627；found:558.9630.
[0048]
本实施例制备化合物9:黄色固体,熔点：147.3-147.9℃；产率91％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.18(s,6h),3.83(d,j＝7.2hz,2h),5.16(t,j＝7.2hz,1h),6.72-6.76(m,4h),7.01(s,2h),7.07(d,j＝8.4hz,2h),7.27(s,2h),7.30-7.35(m,1h),7.91-7.94(m,1h),9.65(brs,2h),12.25(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:20.8,29.4,44.1,111.0,111.1,117.9,118.0,118.8,118.9,122.2,122.4,122.8,127.1,127.2,130.8,135.5,136.2,162.5,205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
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[0049]
本实施例制备化合物10:黄色固体,熔点：143.2-144.1℃；产率82％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.18(s,6h),3.82(d,j＝7.2hz,2h),5.14(t,j＝7.2hz,1h),6.59-6.61(m,2h),6.69-6.73(m,2h),6.97(d,j＝8.4hz,4h),7.30(d,j＝8.4hz,3h),7.87-7.89(m,1h),9.61(brs,2h),12.26(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:20.9,29.4,44.0,111.2,111.3,117.9,118.4,118.9,119.0,119.9,120.2,121.4,121.5,124.9,130.5,130.8,136.3,137.6,162.5,205.5；hrms(esi-tof)m/
z:calcd.for c
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+
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[0050]
本实施例制备化合物11:黄色固体,熔点：150.2-151.0℃；产率85％；核磁共振和高分 辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.42(s,6h),4.02(d,j＝7.2hz,2h), 5.34(t,j＝7.2hz,1h),6.83-6.90(m,6h),7.24(s,2h),7.44-7.48(m,3h),8.06-8.08(m,1h), 9.89(br s,2h),12.04(br s,1h)；
13
c nmr(dmso-d6,100mhz)δ:16.0,29.6,44.0,117.0,117.9, 118.8,118.9,119.0,119.9,120.4,121.8,121.9,126.6,130.8,136.3,136.5,162.5,205.4；hrms (esi-tof)m/z:calcd.for c
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[0051]
本实施例制备化合物12:黄色固体,熔点：189.9-190.2℃；产率87％；核磁共振和高 分辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.70(s,6h),3.89(d,j＝7.2hz, 2h),6.06(t,j＝7.2hz,1h),6.73(d,j＝6.8hz,2h),6.91-6.99(m,6h),7.20(d,j＝8.4hz,2h), 7.51-7.55(m,1h),8.19-8.21(m,1h),9.92(br s,2h),12.38(br s,1h)；
13
c nmr(dmso-d6,100 mhz)δ:19.7,30.6,46.0,109.4,118.0,119.1,119.9,120.5,120.7,121.4,122.5,122.6,125.1, 130.1,130.7,136.4,137.8,162.5,205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.for c
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[0052]
本实施例制备化合物13:黄色固体,熔点：173.2-173.7℃；产率89％；核磁共振和高 分辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.53(s,6h),3.87(d,j＝7.2hz, 2h),5.12(t,j＝7.2hz,1h),6.54-6.57(m,2h),6.70-6.74(m,2h),6.95(s,2h),7.06-7.09(m, 4h),7.28-7.32(m,1h),7.92-7.94(m,1h),9.65(br s,2h),12.28(br s,1h)；
13
c nmr(dmso-d6, 100mhz)δ:30.1,43.8,54.9,101.3,111.2,111.8,111.9,117.9,118.2,118.9,119.9,122.8,122.9, 127.3,130.8,132.3,136.3,153.6,162.5,205.5；hrms(esi-tof)m/z:calcd.for c
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:463.1628；found:463.1629.
[0053]
本实施例制备化合物14:黄色固体,熔点：131.4-132.2℃；产率87％；核磁共振和高 分辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:3.73(s,3h),3.96(d,j＝7.2hz, 2h),5.24(t,j＝7.2hz,1h),6.57-6.60(m,2h),6.86-6.89(m,4h),7.11(s,2h),7.42-7.50(m, 3h),9.74(br s,2h),12.41(br s,1h)；
13
c nmr(dmso-d6,100mhz)δ:30.3,44.0,54.7,94.5, 108.6,117.9,118.5,118.9,119.7,120.8,121.3,125.8,127.8,130.8,136.2,137.8,156.2,162.5, 205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.for c
27h24
n2nao4[m+na]
+
:463.1628；found:463.1624.
[0054]
本实施例制备化合物15:黄色固体,熔点：157.8-158.4℃；产率81％；核磁共振和高 分辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:4.00(d,j＝7.2hz,2h),5.31-5.35 (m,1h),6.89-6.93(m,2h),7.00-7.05(m,3h),7.09(s,1h),7.25(s,2h),7.35(d,j＝8.0hz,2h), 7.59(d,j＝8.0hz,2h),7.96(d,j＝8.8hz,1h)；
13
c nmr(dmso-d6,100mhz)δ:30.2,44.1, 111.3,111.4,118.3,118.5,118.9,119.2,120.8,121.2,122.1,122.2,122.3,126.9,129.8,132.3, 137.1,162.9,205.5；hrms(esi-tof)m/z:calcd.for c
25h19
brn2nao2[m+na]
+
:481.0522； found:481.0513.
[0055]
本实施例制备化合物16:黄色固体,熔点：153.4-154.1℃；产率86％；核磁共振和高 分辨质谱测试等结果如下：1h nmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.29(s,3h),4.03(d,j＝7.2hz, 2h),5.33(t,j＝7.2hz,1h),6.84(s,1h),6.90-6.94(m,2h),7.01-7.05(m,2h),7.29-7.34
tof)m/z:calcd.forc
28h25
cln2nao4[m+na]
+
:511.1395；found:511.1391.
[0061]
本实施例制备化合物22:黄色固体,熔点：143.5-144.1℃；产率77％；核磁共振和高分辨质谱测试等结果如下：1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ:2.31(s,3h),3.73(s,6h),3.96(d,j＝7.2hz,2h),5.21(t,j＝7.2hz,1h),6.57-6.60(m,2h),6.86(s,3h),7.14(s,2h),7.44(d,j＝8.4hz,2h),8.00(s,1h),9.76(brs,2h),12.29(brs,1h)；
13
cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:19.7,30.4,44.0,54.7,94.5,108.6,118.4,119.0,119.7,120.0,120.8,121.3,130.3,137.8,145.1,156.2,160.9,205.4；hrms(esi-tof)m/z:calcd.forc
28h25
cln2nao4[m+na]
+
:511.1395；found:511.1391.
[0062]
本发明的式(1)化合物具有重要的生物活性，体外对人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)的细胞毒性试验表明：此类式(1)所示结构的邻羟基苯乙酰拼接双吲哚甲基类化合物对肿瘤细胞生长具有抑制作用，有可能发展成为新的防治肿瘤药物。但需强调的是本发明的化合物不限于人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)表示的细胞毒性。
[0063]
药理实施例：化合物1至化合物22对人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)的细胞毒性
[0064]
人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)分别用rpmi-1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100u/ml的青霉素和100u/ml链霉素。细胞以每孔5000个细胞的浓度加入到96孔中，在37℃含5％co2潮湿空气的培养箱中培养24小时。
[0065]
细胞存活率的测定用改良mtt法。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的化合物1至化合物22的二甲基亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物最终浓度分别为5μmol/l,10μmol/l,20μmol/l,40μmol/l和80μmol/l。48小时后，每孔加入10μlmtt(5mg/ml)的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的mtt，每孔中加入150μl二甲基亚砜。以溶解还原的mtt晶体甲臜(formazan)，用酶标仪在490nm波长测定od值。结果如下表3所示。
[0066]
表3.invitrocytotoxicactivityofthetencompounds1-22towardsa549,pc-3,nci-h1299andcaco-2cells.
[0067][0068]aic
50
:theconcentrationwhichresultsin50％oftumourcellproliferationinhibitionafter48hofcompoundstreatment.datawererepresentedasmeans
±
sdobtainedinatleastthreeindependentexperimentsbcisplatinandarundineusedaspositivecontrols.
[0069]
药理实施例2：人胚肺成纤维细胞(mrc-5)和人肾皮质近曲小管上皮细胞(hk-2)属于正常人体细胞，选化合物19对胚肺成纤维细胞(mrc-5)和人肾皮质近曲小管上皮细胞(hk-2)进行细胞毒性试验。细胞存活率的测定用改良mtt法，具体方法如药理实施例1。结果如图9所示，化合物19对正常细胞和肿瘤细胞有选择性。
[0070]
药理实施例3：化合物3e对a549细胞集落形成的抑制作用
[0071]
癌细胞的集落形成代表单个细胞生长为集落的能力，也被认为是衡量长期细胞生存能力的标准。因此，克隆和软琼脂试验用于证实化合物19对a549细胞集落形成能力的影响。如图10所示，化合物19作用后，与对照组相比，菌落数量少且小，抑制效果有一定的浓度依赖性。这表明化合物19能抑制a549细胞集落的形成。
[0072]
药理实施例4：化合物19诱导a549细胞凋亡作用
[0073]
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，具有典型的、明确的形态学变化特征，包括质膜起泡、染色质浓缩和染色质与核膜的边缘化、核碎裂和凋亡小体的形成。通过形态学观察，化合物19对a549细胞的抑制作用可能是通过诱导其凋亡而实现的。我们进一步使用
ao/eb分析(图11a)、hoechst 33258染色、annexinv-fitc/pi染色和dna片段分析来检测化合物19是否能诱导a549细胞凋亡。 ao/eb分析显示，与对照组相比，药物治疗组的细胞出现早期和晚期凋亡状态， 染色质呈绿色或橙红色，并出现固缩。随着药物浓度的增加，细胞凋亡状态更加 明显。当药物浓度达到30μm时，凋亡小体明显出现。在hoechst 33，258染色 分析中(图11b)，由于核固缩和染色质浓缩，凋亡细胞的细胞核呈亮蓝色。在 用不同浓度的化合物19处理48小时后，细胞显示出强烈的蓝色荧光，并以浓度 依赖的方式显示典型的凋亡形态，并且这些结果与先前的ao/eb双重染色结果 相似。通过标准琼脂糖凝胶电泳激活核内切酶，由于dna断裂，细胞凋亡可被 视为约200bp寡核体大小片段的倍数。dna片段分析(图11e)表明，与对照 组相比，药物治疗组可导致其dna片段化。相同数量的细胞用化合物19处理 48小时后，提取其dna并用琼脂糖凝胶电泳检测，当用浓度为30μm的化合物19处理时，发现明显的dna片段。如图11c和11d所示，通过annexin v fitc/pi (av/pi)双染色法进一步评估化合物19对a549细胞的凋亡作用，表明该药物 可明显诱导a549细胞凋亡，且早期和晚期凋亡分别呈浓度依赖性。这些结果表 明，化合物19可诱导a549细胞凋亡，从而抑制a549细胞的生长。
[0074]
药理实施例5：化合物19能提高a549细胞的活性氧水平，降低线粒体膜电 位作用
[0075]
ros可诱导肿瘤细胞凋亡，据报道，更多的药物通过在肿瘤细胞中产生ros 来诱导凋亡。为了研究化合物19对a549细胞的凋亡机制是否与活性氧有关， 采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)探针在荧光显微镜下测定化合 物19处理48小时后a549细胞中活性氧的水平。与对照组相比，化合物19处 理48小时后，绿色荧光强度显著增加，这意味着化合物19诱导a549细胞产生 ros。据报道，活性氧可破坏线粒体外电位，线粒体膜电位(δψm)的丧失可 诱导细胞凋亡。在用不同浓度的化合物19处理48小时后，我们通过染料jc-1 染色来评估a549细胞的线粒体膜电位。结果表明，线粒体膜电位随着绿色强度 的增强而下降，红色强度则呈剂量依赖性降低(图12)。因此，化合物19可诱 导a549细胞产生ros，并影响其线粒体膜电位。
[0076]
药理实施例6：化合物19通过线粒体途径诱导a549细胞凋亡作用
[0077]
线粒体依赖性凋亡途径，也称为内源性途径，由bcl-2家族蛋白(包括bax 和bcl-2)调节，可诱导细胞周期蛋白c释放，从而激活caspase-9、-3和parp 裂解，最终触发凋亡的执行。ros是一种重要的信号分子，线粒体膜电位(mmp) 的崩溃已成为线粒体凋亡途径的生化标志之一。我们的实验结果表明，化合物 19可以影响a549细胞的ros和mmp，因此化合物19可能通过线粒体途径诱 导a549细胞凋亡。
[0078]
此外，p53通过增强促凋亡和抑制抗凋亡bcl-2家族的表达，激活线粒体凋 亡途径，促进细胞凋亡。western blot分析用于研究p53的表达，表明在化合物 19处理48小时后，p53的表达以浓度依赖性方式显著上调。促凋亡(bax)和 抗凋亡(bcl-2)蛋白的相对平衡对于维持细胞内环境稳定至关重要。bax/bcl-2 比率的变化诱导细胞色素c从线粒体释放到胞浆中，导致半胱天冬酶的激活和凋 亡的诱导。先前的研究报道mmp的崩解也导致cyt c的泄漏。westernblot检测 bax/bcl-2比值和cytc的表达。如图13所示，在用化合物19处理48小时后，与 对照组相比，化合物19显著增加了a549细胞中bax/bcl-2比率和cyt c的表达。 caspase是另一个参与p53介导的凋亡下游事件的重要蛋白家族。半胱天冬酶的 激活在凋亡的发生中起着核心作用。此外，有效半胱天冬酶的上调导致parp蛋 白的断裂或失
活，随后是dna断裂、核断裂、凋亡小体的出现和细胞收缩。因 此，切割的caspase-3、切割的parp和dna片段被认为是凋亡的独特特征。 westernblot分析表明，化合物19可分别上调a549细胞中切割的caspase-9、切 割的caspase-3和切割的parp的表达。因此，化合物19上调p53的表达，导致 bax/bcl-2比率上调，活性氧的增加进一步加剧线粒体膜电位的丧失，导致cytc 释放到细胞质中。cytc外流到与caspase-9结合的细胞质中，激活caspase-9，然 后激活caspase-3，导致parp断裂、dna断裂和凋亡。
[0079]
药理实施例7：化合物19抑制a549细胞的迁移作用
[0080]
癌细胞的迁移是肿瘤转移的关键步骤，迁移能力的测定与癌细胞的转移潜能 有关。为了评估化合物19对a549细胞水平和垂直迁移能力的影响，我们分别 进行了伤口愈合实验和transwell实验。如图14所示，药物治疗24小时后，与 对照组相比，通过伤口愈合实验，药物治疗组能够以剂量依赖性的方式显著抑制 a549细胞的侧向迁移能力。在transwell实验中，化合物19也能以一定浓度依 赖性的方式抑制a549细胞的纵向迁移能力。
[0081]
药理实施例8：化合物19诱导a549细胞细胞周期阻滞在g0/g1期
[0082]
细胞周期是细胞增殖和生长过程的关键调节器。因此，我们通过流式细胞术 分析进一步检测化合物19对a549细胞的周期效应。如图15所示，与对照组相 比，化合物19治疗48小时后，随着药物浓度的增加，g0/g1期显著增加，g2/m 期显著缩短。当用30μm化合物19处理时，g0/g1相增加12.71％，s相减少5.57％， g2/m相减少5.62％。因此，化合物19通过将a549细胞周期阻滞在g0/g1期来 抑制其生长和增殖。
[0083]
药理实施例9：化合物19对a549细胞形态的影响
[0084]
为了观察化合物19对a549细胞形态学的影响，我们用不同浓度的化合物 19处理a549细胞，然后在显微镜下观察。在本研究中，如图16所示，与对照 组相比，在用化合物19处理48小时后，10μm低浓度组中a549细胞的形态变 化不大。在20μm处理下，a549细胞的形态改变，细胞粘附变差，细胞表面出 现凋亡体类似物。当用30μm处理时，细胞开始收缩，一些细胞脱落并解体形成 碎片，细胞数量也显著减少。因此，化合物19对a549细胞的抑制作用可能是 通过诱导其凋亡来实现的。
[0085]
实验结论：人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺癌细 胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)是测试化合物对肿瘤细胞的细胞毒 性的有效工具和评价指标。本实验表明此类式(1)所示的邻羟基苯乙酰拼接双 吲哚甲基类化合物对人肺腺癌细胞(a549)、人肺腺癌细胞(h1299)、人前列腺 癌细胞(pc-3)、人克隆结肠腺癌细胞(caco-2)具有较强的细胞毒性，和肿瘤 治疗一线用药顺铂同一数量级或活性比顺铂更好，有可能发展成新的具有抗肿瘤 作用的药物。
[0086]
化合物19对受试细胞系(尤其是a549细胞)表现出最有效和最广谱的抗 增殖抑制作用，并且比arundine和顺铂药物更有效，并且与mrc-5和hk-2正 常细胞相比在癌细胞中具有选择性。初步机制研究表明，化合物19通过抑制a549 细胞的增殖、集落形成和迁移，诱导g0/g1期细胞周期阻滞和凋亡，对a549细 胞具有抗肿瘤作用。此外，化合物19处理的a549细胞活性氧含量增加，并诱 导mmp塌陷；westernblot分析显示p53的表达水平显著升高；bax/bcl-2比值 和cytc升高，caspase-9、-3和parp被切割。这些研究表明，化合物19可通过 线粒体途径诱导a549细胞凋亡，该途径与p53的激活和ros的产生有关。因 此，化合物19可
能被用作开发新的抗肿瘤药物的潜在候选者。