一种鱼皮源医用级非变性胶原及其制备方法

1.本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种鱼皮源医用级非变性胶原及其制备方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是动物体内含量极其丰富的结构蛋白，是一种天然功能性高分子蛋白质。胶原蛋白是由三条左手螺旋的α-肽链组成，通过相互作用缠绕成右手超螺旋结构。胶原蛋白具有(gly-x-y)n的三肽重复序列，其中x、y常为脯氨酸(pro)和羟脯氨酸(hyp)。甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸共同作用，对氢键的形成和维持胶原三螺旋结构具有重要意义。
3.胶原蛋白具有良好的生物特性，可被广泛应用于医疗领域。如胶原可以促进血小板积聚和血浆结块而起到止血的作用，胶原独特的三螺旋结构可为细胞的增殖提供良好的环境，胶原的可降解性能使其在体内被降解为小分子后可促进组织伤口愈合等，在医用生物材料领域具有重要的应用价值。
4.胶原蛋白的提取原料主要来源于牛皮、牛跟腱和猪皮等陆生动物，但是由于疯牛病、口蹄疫等疾病的发生和宗教的影响，使陆生胶原蛋白的应用受到了限制。近年来中国渔业的快速发展，鱼类资源加工过程中产生的副产物越来越多，从鱼皮中提取胶原蛋白引起了研究者们的广泛关注。鱼皮中胶原蛋白含量丰富，从鱼皮中提取胶原可以提高资源利用率，具有重要的经济效益与社会效益。另外，从鱼皮中提取的胶原蛋白具有安全性高、低致敏性、生物活性高、应用范围广等优势，具有较好的应用前景。
5.但目前非变性胶原的除杂、提取和分离工艺普遍存在耗时长，提取率低等的缺点，难以对胶原进行大规模生产。另外，胶原中存在的杂蛋白、端肽和内毒素等物质，会对人体产生不良影响，也会限制胶原类材料在医疗领域的进一步应用。因此，如何高效的制备出高纯度医用级与组织工程级胶原蛋白是一个亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了一种鱼皮源医用级非变性胶原及其制备方法，所提供的高纯度鱼皮源医用级非变性胶原在医疗领域具有广泛的应用前景。
7.本发明所提供的高纯度鱼皮源医用级非变性胶原，其制备方法包含如下的步骤：
8.1)将鱼皮剪碎置于含有菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶的冰水中处理4-8h，处理结束后用冰水进行冲洗；
9.所述的鱼皮，作为一种实施例的具体记载，为鳕鱼或罗非鱼皮；
10.2)接着将处理后的鱼皮放入到含nacl的臭氧冰水中进行超声处理，超声处理后再加入表面活性剂进行间歇超声处理；超声处理后的鱼皮进行漂洗，再加入2-4％h2o2低温处理；
11.所述的nacl在臭氧冰水中的添加浓度为0.9-1.0％；
12.所述的臭氧冰水，其中臭氧浓度为5-8mg/l；
13.所述的臭氧冰水中的间歇超声处理，是每隔5min中超声1min，超声功率100-300w，超声次数20-40次；
14.所述的表面活性剂，其添加浓度为0.5％-1.0％；
15.所述的加入表面活性剂的间歇超声处理，低温间歇超声处理30son/270s off，累计超声处理次数6-12次，裂解细胞并去除部分脂肪、潜在病毒威胁；
16.3)将步骤2)处理的鱼皮加入到含edta的naoh溶液中，在100-200w功率下间歇超声处理，超声处理后的鱼皮用预冷的去离子水反复清洗至中性；超声处理步骤及清洗步骤控制温度0-4℃；
17.所述的含edta的naoh溶液，是含20mmol edta的0.1mol/l naoh溶液；
18.所述的超声处理，是每超声1min，停9min，累计超声次数60-80次；
19.4)将步骤3)处理按鱼皮质量加入0.5mol/l的醋酸溶液中进行匀浆，同时加入胃蛋白酶至终浓度1.0-5.0g/l进行处理；处理期间使用超声进行处理；控制温度0-4℃；
20.其中鱼皮与醋酸溶液的质量体积比g/ml为1：20-60；
21.加胃蛋白酶后处理时间控制在12-48h；
22.5)将步骤4)制备的提取液进行离心，收集上清液调节ph为6.8-7.2，并加入nacl进行盐析，收集盐析出的蛋白，将沉淀出的蛋白复溶于0.5m的醋酸，先用0.1m的醋酸透析，再用去离子水透析，透析液干燥获得本发明制备的高纯度鱼皮源医用级非变性胶原。
23.其中nacl加入的终浓度为0.9-1.5m。
24.本发明的制备方法可以有效除去鱼皮上的色素、细菌、残余核酸、残留的细胞与细胞表面的抗原、潜在的病毒、内毒素、非胶原蛋白等，从原料上减少了胶原免疫原的产生。本发明的方法缩短了胶原提取时间，增加了胶原提取率，有效去除了胶原c、n末端肽；缩短了纯化时间，显著提高了胶原纯度，根据sds-page电泳分析胶原纯度大于99％，色泽洁白，dna残留量小于2μg/l。
附图说明
25.图1为本发明的鱼皮源医用级非变性胶原的紫外光谱图；
26.图2为本发明的鱼皮源医用级非变性胶原的红外光谱图；
27.图3为本发明的鱼皮源医用级非变性胶原的色氨酸含量测试图；
28.图4为传统方法制备的鱼皮胶原的sds-page图；
29.图5为本发明的鱼皮源医用级非变性胶原的sds-page图；
30.图6为本发明的鱼皮源医用级非变性胶原的的热变性曲线图。
具体实施方式
31.本发明针对水产源医用级非变性胶原制备过程中存在的非胶原组分、内毒素、热源脱除难的问题，提供了一种高纯度非变性胶原的制备方法。
32.下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
33.实施例1
34.1)鱼皮预处理：新鲜鳕鱼皮流水解冻，低温刮除血渍、鱼鳞及残余碎肉，并对鱼皮进行病毒检测，保证测试结果均为阴性；
35.2)将鱼皮剪碎置于含有1％菠萝蛋白酶与1％木瓜蛋白酶的冰水中处理8h，冰水冲洗鱼皮三次，去除色素、残留碎肉、蛋白酶；
36.与传统预处理方法相比，本步骤可以更彻底的将色素脱除，且绿色无污染，不破坏鱼皮中胶原组织，色素脱除率90-96％。
37.3)接着加入含0.9％nacl的臭氧冰水(臭氧浓度控制在6mg/l)中间歇超声处理，每隔5min中超声1min，超声功率300w，超声次数20次，进一步去除鱼皮上的细菌、残留血渍；加入0.5％的表面活性剂十二烷基硫酸钠(sds)，低温间歇超声处理30s on/270s off，累计超声处理次数12次，裂解细胞并去除部分脂肪、潜在病毒威胁；冰水漂洗5次后，加入4％h2o2低温处理25min，冷水漂洗三次，进一步去除残留的细胞与细胞表面的抗原。
38.与现在已有的方法相比，本步骤可以显著地抑制微生物的生长，并彻底破坏残留组织中的细胞组分、微生物组分，脱除部分杂蛋白组分。
39.4)鱼皮中加入预冷的30倍体积的含20mmol edta的0.1mol/l naoh溶液，在200w功率下间歇超声处理，每超声1min，停9min，累计超声次数60次，以除去非胶原成分、其它杂质，同时消除内源性蛋白酶对胶原蛋白的影响，期间更换处理液两次。
40.处理后的鱼皮用预冷的去离子水反复洗至中性，以上步骤控制温度0-4℃。
41.5)按鱼皮质量加入料液比为1：40(w/v)的0.5mol/l的醋酸溶液匀浆，同时加入胃蛋白酶至终浓度2.0g/l提取48h，间歇辅助超声处理(40s开/80s关)20次，去除端肽，可非变性胶原的溶出效率提高26.5％。以上步骤控制温度0-4℃。
42.与传统处理方法相比，c-端肽、n-端肽脱除率提高12％以上，脱除效率显著提高了15-30％，采用elisa方法分析n-端肽与c-端肽含量降低到检测限以下。
43.6)将提取液在10000rpm离心25min，收集上清液调节ph为6.8，并加入研细的nacl进行盐析，nacl的最终浓度为1.1m，搅拌1h后，静置8h，9000rpm离心30min，沉淀复溶于0.5m的醋酸，先用0.1m的醋酸透析1d，再用去离子水透析2d，每隔8h更换一次透析液。以上步骤控制温度0-4℃，将透析液冷冻干燥获得鱼皮源医用级非变性胶原。
44.本发明的制备方法可以有效除去鱼皮上的色素、细菌、残余核酸、残留的细胞与细胞表面的抗原、潜在的病毒、内毒素、非胶原蛋白等。结果显示本发明方法制备的鱼皮胶原蛋白，sds-page电泳分析胶原纯度达到99.7％，杂蛋白小于0.1％，c、n末端肽浓度低于elisa试剂盒检测限。制备的鱼皮胶原蛋白在透射电子显微镜下d周期明显且圆二色谱在220-221nm处有一个弱的正峰，在198nm处有一个强的负峰，rpn值0.14，这表明本方法制备胶原不仅纯度高，而且三螺旋结构保持完整，dna残留量小于2μg/l。热源实验显示，实验动物的体温升高总和0.3℃，
45.根据中国药典方法测定：胶原样品无色氨酸检出，浸提液内毒素《0.01eu/ml，杂蛋白含量小于0.1％，α-gal抗原的残留量低于elisa法最低检测限(10μg/l)。通过生物学性能评价显示，该胶原材料，可以显著促进人脐静脉内皮细胞(huvec)、小鼠胚胎成骨细胞(mc3t3e1)和小鼠胚胎成纤维细胞(l929)等的增殖，无细胞毒性、无急性全身毒性、无溶血反应、无致敏反应、无遗传毒性。
46.将实施例1制得的样品的溶于0.1mol/l乙酸溶液中配置成0.25mg/ml的溶液，对其进行190nm-400nm的全波长扫描，0.1mol/l乙酸溶液为空白测定基线。
47.实施例1制得的样品的紫外光谱结果如图1所示，胶原蛋白中含有一定量的笨丙氨
酸和酪氨酸，但是不含有色氨酸，因此典型的胶原蛋白在230nm左右呈现最大紫外吸收。
48.实施例1制得鳕鱼皮胶原在221nm处有最大吸收峰，传统方法鳕鱼皮胶原最大吸收峰在222nm处，无明显区别。
49.1mg的实施例1试样冻干品和恒重后的光谱级kbr按照约1：100的比例混合研磨，在干燥条件下压片后，在4000-400cm-1
范围内进行光谱扫描，分辨率1cm-1
，波峰用omnic 8.0软件进行分析。
50.实施例1制得的样品的红外光谱结果如图2所示，在室温下，实施例1制得鳕鱼皮胶原主要在3319.59、2933.32、1655.29、1550.10和1237.81cm-1处表现出5个吸收峰，分别对应于酰胺a、酰胺b、酰胺i、酰胺ii和酰胺iii。传统方法鳕鱼皮胶原主要在3316.26、2932.32、1656.63、1543.37、1234.74m-1处表现出5个吸收峰，分别对应于酰胺a、酰胺b、酰胺i、酰胺ii和酰胺iii，基本无区别。
51.取3-5mg实施例1试样干粉于安醅瓶中，加入2ml 6mol/l盐酸溶液，酒精喷灯封口后于130℃下水解4h,转移至容量瓶中，加入2滴甲基红指示试剂，用2mol/l naoh调溶液至淡黄色，用蒸馏水定容至100ml。取2ml按照标准曲线的操作方法测定，实验结果为3次平行测定的平均值。
52.配制浓度为10ug/ml羟脯氨酸标准液。吸取羟脯氨酸标准工作液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于各试管中，用蒸馏水补足到2ml。各试管中加入1ml氯胺t试剂，振摇试管，并在室温下放置20
±
2min,在每个试管中加入1ml发色剂充分混合，试管置于60
±
5℃的水浴锅中准确放置15min,在流动的自来水下冷却试管至少3min,擦干试管，560nm处测吸光度值。
53.经测定，测定实施例1制备的鳕鱼皮胶原中羟脯氨酸含量占胶原含量为10.3％。根据鳕鱼皮氨基酸组成分析，干基纯度大于99.9％。
54.称取1mg的实施例1样品置于水解管中，加入1ml的3m naoh溶液，冲入氮气封口后，于110℃下消化24h，冷却后用3m hcl溶液中和，取上述溶液0.5ml于玻璃试管中，加入1ml的冰醋酸(含少量乙醛酸)，充分混匀后，倾斜试管，随后沿着试管壁缓缓加入1ml的浓硫酸，缓慢立起试管，使上下两层溶液重叠但不互混，于试管架上静置5min，观察上下层溶液界面的情况。
55.色氨酸在110℃的碱性条件下可以从蛋白质中水解出来。色氨酸中含有吲哚基团，其能够和乙醛酸发生反应生成紫红色的物质，这一颜色反应可以有效地检验色氨酸的存在。实施例1制得的样品的色氨酸测定如图3所示，观察到在上下两层溶液界面中并未出现紫红色圈，从而表明了胶原蛋白中并不含有色氨酸，这在一定程度上也表明了提取纯化的胶原蛋白具有较高的纯度。
56.选用8％的分离胶和5％的浓缩胶。实施例1试样溶解于0.5m的醋酸中配制成1.5mg/ml的溶液，用3m naoh溶液中和后离心(10,000rpm,30min,4℃)，离心后的上清液与上样缓冲液(含β-巯基乙醇)按照4:1(v/v)的比例混合，混合液于100℃下煮沸5min，冷却后离心(5000rpm,5min)，取上清液，在泳道上上样15μl。
57.电泳首先在80v恒压下进行20min，随后转为恒压120v，跑至距离胶边缘约1cm处。电泳结束后，将胶置于考马斯亮蓝r-250中染色1h，随后用脱色液脱色过夜，在凝胶成像仪上观察条带并拍照。
58.实施例1样品平均分成两组，每组两只试管。一组暂不做处理，称a管，另一组于60
℃水浴进行加热30min，称为b管。将两组样品中分别加入10 000～20 000u/g胃蛋白酶溶液，在4℃反应5min后取出。取a、b反应液，加入样品制备液，100℃加热5min以使蛋白质变性，制备电泳样品。
59.实施例1制得的样品的sds-page结果如图4和图5所示，图4为传统方法(左侧)和实施例1(右侧)提取的鳕鱼皮胶原蛋白sds-page，图5为实施例1制得鳕鱼皮胶原加热30min(左侧)与未加热(右侧)加入胃蛋白酶的sds-page，通过比较可以发现本发明方法制备的鳕鱼皮胶原保留了完整的三螺旋结构，且纯度更高。
60.实施例1样品用0.1m乙酸溶液配制成0.5mg/ml的溶液，于乌氏粘度计中测定不同温度下溶液的粘度值，温度从5℃至40℃，温度间隔为3℃。
61.特定温度下的fractional viscosity通过下列方程式进行计算：
62.fractional viscosity＝(η
sp
(t)-η
sp
(40℃))/(η
sp
(5℃)-η
sp
(40℃))
63.其中，η
sp
是增比粘度,增比粘度＝(t-t0)/t0＝η
r-1,ηr是相对粘度，相对粘度＝t/t0，t是胶原蛋白溶液流过毛细管的时间，t0是相同温度下溶剂(0.1m的醋酸)流过毛细管的时间。fractional viscosity对温度作曲线，fractional viscosity为0.5时对应的温度值即为胶原蛋白的热变性温度。
64.实施例1制得的样品的热变性温度曲线如图6所示，鳕鱼皮胶原的热变性温度为15.8℃。
65.将实施例1制备的胶原蛋白作为组织工程材料，可以用于研究开发新型胶原蛋白基医用材料，如止血愈创的止血海绵、双层复合止血敷料、超细纤维止血敷料、胶原膜等。
66.结果显示，本发明胶原蛋白止血敷料的体外凝血时间显著减少12％-60％；对于edc/nhs交联胶原蛋白海绵，在凝血刚开始1min时其bci值就低至50％以下，样品的抗凝全血均逐渐凝固形成血块，血红蛋白含量在30min后减少到20％-30％；胶原海绵的肝脏止血时间显著减少18-25％；胶原海绵的股动脉出血模型中的出血时间显著减少30％-48％。胶原蛋白海绵被转化为吸收能力更强的止血敷料，接触血液时能够迅速脱水，使血液中的蛋白质和血小板浓缩，实现更快的凝血过程。
67.本发明制备的胶原海绵愈创能力显著提高，第7天的创伤愈合率提高25％-27％，第14天的创伤愈合率提高70％-72％。