一种Cy-sMpGPPS基因以及利用萜类代谢调控促进林木生长的方法

一种cy-smpgpps基因以及利用萜类代谢调控促进林木生长的方法
技术领域
1.本发明属于林业技术领域，尤其涉及一种cy-smpgpps基因以及利用萜类代谢调控促进林木生长的方法。


背景技术：

2.萜类物质是自然界广泛存在的一种由异戊二烯为基本结构单元的化学物质的总称，是一类广泛存在于植物体内的天然碳氢化合物，是目前为止所最大的一个植物次生代谢产物家族。萜类化合物大多具有多种化学生态学效应，大多数萜类化合物具有复杂而重要的生理生化活性，对固着生活的植物扮演着重要的作用。大量研究表明萜类代谢调控植物一系列的生理生长活动，对植物细胞代谢的许多方面具有一定的影响，同时还影响细胞膜的生理响应变化，如细胞膜结构、分泌运输等功能的变化有着非常重要的影响，因此，萜类代谢跟植物的生长密切相关。
3.目前我国人工林面临前所未有的考验，木材进口依存度达到60％，怎样培育速生丰产、高质量的人工林，进行木材战略储备刻不容缓。然而，传统育种由于林木繁殖周期长，遗传杂合性高，许多性状的遗传机理不明，以及种间地理、生殖隔离等因素的限制，很难定向培育出生物量突破性提高的林木新品种，因此常规育种方法很难突破林木固有的生长瓶颈。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种cy-smpgpps基因以及利用萜类代谢调控促进林木生长的方法。
5.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
6.一种cy-smpgpps基因，其由蚜虫(myzus persicae)的mpgpps(aay33491.1)全长基因与人类流感血凝素ha(hemagglutinin)部分序列通过人工合成得到。优选的，该cy-smpgpps基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.蚜虫(myzus persicae)的mpgpps(aay33491.1)全长基因(如seq id no:1所示的第1-1086bp的碱基片段)，其编码的同型二聚体蛋白定位于线粒体，具有催化gpp和fpp形成的双功能(gpp和fpp是萜类代谢的两条途径)。人类流感血凝素ha(hemagglutinin)的部分序列(如seq id no:1所示的第1087-1113bp的碱基片段)，其编码的ha蛋白与细胞表面病毒特异性受体结合，介导病毒外膜与细胞内小体膜融合释放病毒核衣壳进入胞浆，以及刺激机体产生中和性抗体(起标记蛋白的作用)。因此，将上述两种基因序列组合后运用到林木上，可以调节萜类代谢来调控植物生长，突破木本植物固有的生长周期长、生长缓慢的瓶颈，解析萜类代谢对林木的生长调控，达到速生丰产的目的。
8.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种利用萜类代谢调控促进林木生长的方法，包括如下步骤：
9.(1)将所述的cy-smpgpps基因构建到含有绿色荧光蛋白、潮霉素抗性标记的表达载体上，构建植物表达载体；
10.(2)以待调控的林木为受体材料，进行培养获得无菌瓶苗，然后以无菌苗叶片为外植体，用所述步骤(1)构建的植物表达载体融合质粒的农杆菌对所述无菌苗叶片进行叶盘法侵染转化，经过农杆菌介导浸染、基因转化共培养、潮霉素抗性筛选培养(把没有转化成功的植株杀死，从而筛选出转化成功的株系)、生根培养、炼苗移栽，获得经过萜类代谢调控的转基因植株。
11.上述的方法，优选的，在步骤(1)中，所述表达载体为pmdc84，采用酶切、连接和重组反应的方法将所述cy-smpgpps基因构建到表达载体pmdc84上。
12.优选的，在步骤(2)中，所述受体材料为杨树，更优选为银腺杨无性系84k(p.alba
×
p.glandulosa)。
13.优选的，所述农杆菌为农杆菌gv3101。
14.优选的，在步骤(2)中，所述基因转化共培养的培养基配方如下：ms+0.5mg
·
l-1
6-ba+0.05mg
·
l-1
naa+acetosyringone 0.5mg
·
l-1
；
15.所述潮霉素抗性筛选培养的培养基配方如下：ms+6-ba 0.5mg
·
l-1
+naa 0.05mg
·
l-1
+hyg 3mg
·
l-1
+timentin150 mg
·
l-1
；
16.所述生根培养的培养基配方如下：1/2ms+naa 0.05mg
·
l-1
+hyg 3mg
·
l-1
+timentin 150mg
·
l-1
。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
18.1、本发明针对目前没有能够显著提高林木生长及生物量的基因的现状，寻找到一个调控萜类代谢的cy-smpgpps基因，在此基础上，利用植物化学与代谢工程技术将该基因运用到林木上，通过调节萜类代谢来调控植物生长，突破木本植物固有的生长周期长、生长缓慢的瓶颈，解析萜类代谢对林木的生长调控，达到速生丰产的目的，可以培育出生长迅速、生物量大的新品种，对林木遗传改良具有巨大的应用前景，对我国木材战略储备具有重要意义。
19.2、本发明的萜类代谢调控促进林木生长的方法，通过新型萜类催化酶基因cy-smpgpps的导入，相对于对照野生型杨树，杨树中过表达的smpgpps基因显著促进苗期生长，使植株长得更高更壮，转基因株系主要表现为苗高生长快、地径增长快，叶数增多，节间长等特征，和野生型相比，转基因株系苗高增加17％～31％、地径增加10％～15％、叶数增加20％；显著提高了生长量及生物量，其中平均生长速率提高近50％。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是植物表达载体pmdc84-cy-smpgpps的构建图；
22.图2是cy-smpgpps的遗传转化过程图(a、b、c、d分别表示cy-smpgpps转基因杨树共培养、筛选培养、生根培养以及移栽的实物照片)；
23.图3是4月龄的杨树不同基因型苗高的比较(cy-84k表示pmdc84-cy-smpgpps转基因杨树；ept表示空载，阳性对照；84k表示野生型，阴性对照)；
24.图4是5月龄的杨树不同基因型苗高的比较(cy-84k表示pmdc84-cy-smpgpps转基因杨树；ept表示空载，阳性对照；84k表示野生型，阴性对照)。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
26.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
27.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
28.本发明的实施方式如下：
29.(1)新型萜类催化酶基因的合成
30.将来自蚜虫(myzus persicae)的mpgpps(aay33491.1)、人类流感血凝素ha(hemagglutinin)序列人工合成一个新的基因序列，核苷酸序列如seq id no:1所示，并构建到含有gfp(绿色荧光蛋白)、潮霉素抗性标记的表达载体pmdc84上，最终构建植物表达载体pmdc84-cy-smpgpps(以下简称smpgpps)；
31.(2)新型萜类催化酶基因的遗传转化
32.以杨树为受体材料，通过农杆菌gv3101介导的基因共转化，导入smpgpps基因，通过潮霉素抗性筛选获得转基因植株，选出优良的转基因植株，建立高效稳定的遗传转化体系；
33.(3)转基因植株的分子检测
34.对所得到的抗性植株进行pcr、rt-pcr检测以确定所转基因及其拷贝数，通过qrt-pcr分析基因的表达情况，以确定外源基因整合、表达情况；
35.(4)萜类代谢途径的检测分析
36.通过检测杨树转基因株系的叶绿素、类胡萝卜素、赤霉素、光合响应、抗病虫等植物生长、生理指标；通过gc-ms测试分析萜类物质成分及含量，并进行gfp亚细胞定位研究，分析不同基因型株系细胞的萜类代谢路径；
37.(5)萜类代谢对林木的生长量调控分析
38.通过检测杨树转基因株系的苗高、地径、叶数、生物量，分析比较各株系表型差异。
39.实施例：
40.一种萜类代谢调控促进林木生长的方法，包括如下步骤：
41.(1)smpgpps基因合成及载体构建
42.为研究具有催化gpp和fpp形成的双重功能的蚜虫(myzus persicae)mpgpps(aay33491.1)对植物的生长调控影响，本发明将蚜虫(myzus persicae)的mpgpps(aay33491.1)、人类血凝素hemagglutinin(ha)二个基因序列合成mpgpps-ha(以下简称cy-smpgpps)基因(核苷酸序列如seq id no:1所示)，然后采用“酶切-连接”的方法和“重组反
应”方法构建到含有gfp(绿色荧光蛋白)、潮霉素抗性标记(hygromycin)的pmdc84载体上，采用gateway系统及pcr筛选构建植物表达载体pmdc84-cy-smpgpps(以下简称smpgpps)。载体构建图见图1，pmdc84为空载对照，用来消除转基因流程本身的误差对照；pmdc84-cy-smpgpps为构建的合成基因的植物表达载体。
43.(2)smpgpps在植物中的遗传转化
44.为研究人工合成基因cy-smpgpps对植物的生长调控及功能影响，以银腺杨无性系84k(p.alba
×
p.glandulosa)为受体材料，进行培养获得无菌瓶苗，然后以无菌苗叶片为外植体。用cy-smpgpps和空载对照pmdc84融合质粒的农杆菌gv3101菌株对银腺杨无性系84k(无菌瓶苗)进行叶盘法侵染转化，分别经过农杆菌介导浸染、基因转化共培养、筛选培养、生根培养、炼苗移栽等培养阶段(见图2)，最终获得抗性植株。最终每基因型获得抗性植株20株以上，分别移栽cy-84k以及空载(ept)的抗性植株到温室大棚，2个基因型分别为47株和24株，同时野生型(84k)移栽10株用于对照。
45.各阶段培养基配方如下：
46.共培养：ms+0.5mg
·
l-1
6-ba+0.05mg
·
l-1
naa+acetosyringone 0.5mg
·
l-1
；
47.筛选培养：ms+6-ba0.5 mg
·
l-1
+naa0.05 mg
·
l-1
+hyg 3mg
·
l-1
+timentin150 mg
·
l-1
；
48.生根培养：1/2ms+naa0.05 mg
·
l-1
+hyg 3mg
·
l-1
+timentin 150mg
·
l-1
。
49.(3)smpgpps转基因植株分子检测
50.为鉴定筛选出的抗性植株外源基因的导入情况，以移栽到温室大棚的抗性植株为实验材料，提取抗性植株基因组dna、rna，将rna反转录成cdna，以转基因抗性植株dna、cdna样品为pcr模版，以各基因质粒为阳性对照，以未转化的野生型烟草(wt)为阴性对照，分别用潮霉素抗性基因和smpgpps基因的特异性引物进行pcr、rt-pcr、qrt-pcr分子检测，以筛选出转基因阳性植株及检测cy-smpgpps基因的表达量。
51.表1：抗性植株pcr检测引物序列
[0052][0053]
表2：pcr反应体系
[0054][0055]
pcr扩增程序为95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶电泳体系：凝胶浓度1％，电压150v，电泳时间20min。
[0056]
表3：抗性植株rt-pcr检测引物序列
[0057][0058][0059]
表4：dnaase反应体系
[0060][0061]
表5：cdna合成反应体系
[0062][0063]
以抗性植株总rna为模板，以smpgpps质粒作为阳性对照，运用smpgpps基因特异性引物，进行rt-pcr反应。rt-pcr反应体系(见表6)：
[0064]
表6：rt-pcr反应体系
[0065][0066]
扩增程序为95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶电泳体系凝胶浓度1％，电压150v，电泳时间20min。
[0067]
表7：抗性植株qrt-pcr检测引物序列
[0068][0069]
表8：qrt-pcr反应体系
[0070][0071]
表9：qrt-pcr循环条件
[0072][0073]
(4)smpgpps基因调节植物生长的检测分析及调控评价
[0074]
为研究合成基因smpgppg对植物生长及生物量积累的调控影响，以移栽到温室大棚的不同基因型杨树(cy-84k、空载对照ept以及野生型对照84k)为实验材料，定期监测各基因型植株生长情况，包括形态、生理、亚细胞定位、以及萜类代谢产物等指标测定及评价分析。
[0075]
实验结果表明：相对于对照组，杨树转smpgpps基因植株苗期表现出生长旺盛，植株长得更高更壮的特征(见表10、表11、表12)。转基因植株在苗期4月龄苗高增加17％～31％、地径增加10％～15％、叶数增加20％；cy-smpgpps基因显著提高了苗期生长，平均生长速率提高近50％，转基因植株在表型上主要表现为株高生长快、地径增长快，叶数增多等形态特征。
[0076]
表10：不同基因型杨树苗高的比较
[0077][0078]
注：“*”表示与野生型之间有显著差异，0.01《p值《0.05，“**”表示与野生型之间有极显著差异，p值《0.01，(t检验)。
[0079]
表11：不同基因型杨树地径比较
[0080][0081]
注：“*”表示与野生型之间有显著差异，0.01《p值《0.05，“**”表示与野生型之间有极显著差异，p值《0.01，(t检验)。
[0082]
表12：不同基因型杨树叶数比较
[0083][0084]
注：“*”表示与与野生型之间有显著差异，0.01《p值《0.05，“**”表示与与野生型之间有极显著差异，p值《0.01，(t检验)。
[0085]
图3、图4、表10表明：cy-84k、空载对照ept及野生型84k在第4个月出现显著差异。在第4月龄，cy-84k平均苗高63.10cm，空载对照ept-84k平均苗高48.75cm，野生型84k平均苗高48.00cm，相对于对照来说，转基因苗高提高16.7％-31.3％，方差分析表明cy-84k基因型苗高与野生型之间有显著差异，显著性水平0.05，而空载对照ept-84k与野生型之间没有明显差异。在第5月龄，cy-84k平均苗高81.30cm，空载对照ept-84k平均苗高61.88cm，野生型84k平均苗高62.0cm，相对于对照来说，转基因苗高提高22.9％-31.1％，方差分析表明cy-84k基因型苗高与野生型之间有显著差异，显著性水平0.05，而空载对照ept-84k与野生型之间没有明显差异(表10)。
[0086]
图3、图4、表11表明：cy-84k、空载对照ept以及野生型84k地径在第4个月出现差异
显著，在第4月龄，cy-84k平均地径4.26mm，空载ept平均地径3.67mm，84k平均地径3.72mm，cy-84k基因型地径与84k之间有显著差异，地径提高9.67％-14.5％，而空载ept与84k之间没有明显差异；在第5月龄，cy-84k平均地径5.13mm，空载ept平均地径4.28mm，84k平均地径4.33mm，相对于对照来说，cy-84k地径与野生型之间有显著差异，地径提高9.67％-18.5％，其它基因型与野生型84k之间差异没有达到显著性(表11)。
[0087]
图3、图4、表12表明：在移栽后直到第3个月，cy-84k转基因杨树幼苗与野生型84k及空载ept-84k在叶数上没有显著差异，3个基因型植株叶数在14～15片之间；到第4个月，cy-84k转基因植株有21～26片叶子，而空载及野生型植株只有18～22片叶子，且转基因植株叶数显著大于空载对照ept-84k及野生型对照84k；到第5个月，cy-84k转基因植株有30～36片叶子，而空载及野生型植株只有25～30片叶子，且转基因植株叶数显著大于空载对照ept-84k及野生型对照84k(表12)。