一株有益根际假单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一株有益根际假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.植物病害的发生和流行严重影响全球粮食产量和经济状态，每年由于植物病原微生物侵染可导致全球30％的粮食减产，造成全球经济损失约2200亿美元。植物病害所造成的粮食安全和食物短缺等问题在很大程度上影响人们的生活，目前全球有超过8亿人(占全球人数的10％以上)正遭受粮食安全的威胁，尤其在发展中国家因植物病害发生引起的上述问题对人们造成的影响更加严重。化学杀菌剂的出现在很大程度上缓解了这一问题，为农业增收，保障粮食产量做出了重要贡献。然而，在实际生产中，为了更加高效的防控植物病害的发生，过量施用农药的现象屡见不鲜，这不仅没有帮助农业有效实现正增长，还逐渐的使其弊端凸显。严重破坏了土壤正常的理化性状和生态微环境，造成土壤板结、营养流失，土壤愈发贫瘠；过量的化学元素流失也造成江河湖海水体的富营养化，藻类疯长，破坏了水体生态平衡；对于病原微生物也产生了一个定向筛选的过程，加速抗药性的产生，同时也在一定程度影响田间生物多样性，杀灭有益生物等。不仅对粮食安全和生态环境造成很大影响，也严重制约农业健康发展。因此，探寻新的绿色可持续防控途径迫在眉睫。
3.利用有益微生物资源开发生物防治产品是实施绿色防控战略的重要措施之一。有益微生物种类众多，代谢产物丰富，作用机制多样，具有良好的环境适应性。利用有益微生物及其产生代谢产物来抑制病原菌，是一种安全高效，生态良好的植物病害防治方法，是病害综合治理的重要环节。
4.假单胞菌(pseudomonas spp.)种类丰富、分布广泛，尤其在植物根际环境中普遍存在，具有定殖能力强、代谢产物多样、抗菌谱广等特点，其在病害防控和植物促生方面具有重要价值。尽管假单胞菌类群众多，但目前得到商品化应用的有益假单胞菌株绝大多数为荧光假单胞菌，存在商业化微生物制剂相对单一的问题。有益微生物资源出现严重的趋同性，同样其作用机理的也存在单一化。因此，筛选新的有益假单胞菌，丰富有益微生物种质资源，能够为微生物制剂的开发和利用提供极为重要的资源，是保障农业的绿色可持续发展的重要基石。


技术实现要素：

5.本发明针对植物病害防治困难，且难以实现可持续绿色防控的问题，提出了一株有益根际假单胞菌及其应用。
6.第一方面，本发明要求保护一株假单胞菌(新菌种)。
7.本发明所要求保护的假单胞菌为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)，其菌株号为2270，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.226780。
8.林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270呈杆状，好氧型革兰氏阴性菌，
在kb培养基上可产生荧光，菌落呈乳白色，规则圆形，粘稠状。该菌株的生长温度范围在4-40℃，最适宜生长温度为28-32℃，生长ph值在6-9，最适宜ph值为7。林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的生理生化特征如表2所示。林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有seq id no.1所示的16s rdna。
9.第二方面，本发明要求保护林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的培养物。
10.林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的培养物是将林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270在细菌培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。
11.上述培养物中，所述物质包括林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270(菌体自身)和林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物。
12.术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。
13.上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。
14.术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。
15.在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为lb液体培养基或者pda固体培养基。
16.第三方面，本发明要求保护一种菌剂。
17.本发明要求保护的菌剂含有林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物和/或前文第二方面所述培养物。
18.其中，所述菌剂可为病原菌抑制剂、病害抑制剂、促进植物生长的菌剂和/或改良土壤的菌剂。
19.进一步地，所述病原菌抑制剂可对立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)、青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)、西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)和/或辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)具有抑制作用。
20.进一步地，所述病害可为由立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、稻瘟病菌
(magnaporthe oryzae)、稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)、青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)、西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)和/或辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)引起的病害。
21.更进一步地，所述病害可为小麦纹枯病、稻瘟病、水稻白叶枯病、番茄青枯病、烟草黑胫病、瓜类细菌性果斑病和/或辣椒疫病。
22.上述菌剂中，所述菌剂的活性成分可为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物和/或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的培养物，所述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分。所述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据抑菌效果、抗病效果、促进植物生长效果、土壤改良效果确定。
23.上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
24.上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
25.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
26.上述菌剂中，林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物可从林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的发酵液中获得(如无菌发酵滤液)。
27.第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
28.a1)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在抑制病原菌中的应用；
29.a2)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备抑制病原菌的产品中的应用；
30.a3)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在抑制病害中的应用；
31.a4)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备抑制病害的产品中的应用；
32.a5)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在促进植物生长中的应用；
33.a6)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备促进植物生长的产品中的应用；
34.a7)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在激发植物免疫反应中的应用；
35.a8)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备激发植物免疫反应的产品中的应用；
36.a9)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在改良土壤中的应用；
37.a10)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备改良土壤的产品中的应用；
38.a11)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在水解有机磷中的应用；
39.a12)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备水解有机磷的产品中的应用；
40.a13)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在解钾中的应用；
41.a14)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述培养物或前文第三方面所述菌剂在制备解钾的产品中的应用；
42.a15)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在产蛋白酶中的应用；
43.a16)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在制备产蛋白酶的产品中的应用；
44.a17)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在产氨中的应用；
45.a18)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在制备产氨的产品中的应用；
46.a19)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在产铁载体中的应用；
47.a20)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在制备产铁载体的产品中的应用；
48.a21)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在产生长素(iaa)中的应用；
49.a22)林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂在制备产生长素(iaa)的产品中的应用。
50.所述产品可为微生态制剂或生物肥料。
51.在所述应用中，所述病原菌可为病原真菌和/或病原细菌。
52.进一步地，所述病原真菌可为如下中的全部或部分：立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)、辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)；所述病原细菌可为如下中的全部或部分：稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzaepv.oryzae，xoo)、青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)。
53.在所述应用中，所述病害可为由立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)、青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)、西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)和/或辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)引起的病害。
54.进一步地，所述病害可为小麦纹枯病、稻瘟病、水稻白叶枯病、番茄青枯病、烟草黑胫病、瓜类细菌性果斑病和/或辣椒疫病。
55.在所述应用中，所述促进植物生长可体现为如下中的全部或部分：促进植物侧根形成、提高植物生物量；
56.在所述应用中，所述激发植物免疫反应可体现为如下中的全部或部分：激发植物表层免疫反应引起细胞程序性死亡、诱导抗病相关基因上调表达。
57.进一步地，所述诱导抗病相关基因具体可为如下中的全部或部分：pti5基因、wrky7基因、wrky8基因、hin1基因、hsr203j基因、pr1a基因和npr1基因。
58.在所述应用中，所述改良土壤可体现为如下中的全部或部分：水解有机磷、解钾、产蛋白酶、产氨、产铁载体、产iaa。
59.在本发明的具体实施方式中，所述解钾具体为解钾长石。
60.第五方面，本发明要求保护如下任一方法：
61.b1)一种抑制病害的方法，可包括如下步骤：对植物植株或者植物种子或植物根际土壤施用林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂。
62.b2)一种促进植物生长的方法，可包括如下步骤：对植物植株或者植物种子或植物根际土壤施用林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂。
63.b3)一种激发植物免疫反应的方法，可包括如下步骤：对植物植株或者植物种子或植物根际土壤施用林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270或林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的代谢物或前文第二方面所述的培养物或前文第三方面所述的菌剂。
nyingchiensis)2270是一株稳定、高效、广谱的植物防病促生菌。该菌株对引起小麦纹枯病的病原立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、水稻白叶枯病的病原稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)、稻瘟病的病原稻瘟菌(magnaporthe oryzae)、辣椒疫病的病原辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)、烟草黑胫病病原烟草疫霉菌(phytophthora parasitica)、瓜类细菌性果斑病病原西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)、番茄青枯病病原青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)等病原真菌和病原细菌具有显著的抑制作用，对小麦纹枯病的室内防效可以达到79.22％。林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够水解有机磷、分解钾长石，具有产蛋白酶、铁载体、nh3，以及分泌吲哚乙酸(iaa)等功能，有效改善土壤营养环境、促进植物生长。此外，该菌株还能够通过激发植物表层免疫反应引起细胞程序性死亡，诱导抗病相关基因显著上调表达，激发植物产生抗病能力。林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270是一株植物根际益生菌，具有环境友好、对人畜安全等优势，且培养条件简单、容易保存，具有良好的工业化生产前景。
79.保藏说明
80.分类命名：pseudomonas nyingchiensis；
81.参椐的生物材料：2270；
82.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
83.保藏机构简称：cgmcc；
84.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
85.保藏日期：2021年6月9日；
86.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22678。
附图说明
87.图1为基于16srdna序列构建林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270与近源假单胞菌的系统进化树。
88.图2为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的抑菌谱。其中，a为立枯丝核菌、b为稻黄单胞菌水稻致病变种、c为稻瘟病菌、d为辣椒疫霉、e为烟草疫霉、f为西瓜嗜酸菌、g为青枯雷尔氏菌。
89.图3为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270激发本氏烟免疫反应。a为接种本氏烟叶片表型，左侧叶片为5
×
108cfu/ml林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的菌悬液，右侧为接种10mm mgcl2；b为本氏烟叶片接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270后免疫相关基因表达量，结果为接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270组与接种10mm mgcl2的对照组之间的比值，大于1则表示接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270后相应基因表达上调。
90.图4为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270和对照处理14d后拟南芥的生长情况。a为接种lb液体培养基，b为接种浓度为5
×
108cfu/ml的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液，每株拟南芥下方接种2μl。
91.图5为salkowski比色法测定林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270产iaa检测结果。上排左一为植物生长素iaa标准样品，上排左二为培养基阴性对照，下排三个
为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液的三个重复。
92.图6为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270产nh3检测结果。上排均为ck，下排三个为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270处理的三次重复。
93.图7为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270产蛋白酶检测结果。
94.图8为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270产嗜铁素检测结果。
95.图9为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270水解有机磷检测结果。
96.图10为林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270分解钾长石检测结果。
具体实施方式
97.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
98.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
99.下述实施实例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，尽可用于重复本技术实验，不得他用。
100.1)引起小麦纹枯病的病原立枯丝核菌(rhizoctonia solani)(魏海雷,王烨,张力群,唐文华.生防菌株2p24与cpf-10的鉴定及其生防相关性状的初步分析.植物病理学报,2004,34:80-85)。
101.2)引起稻瘟病的稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)(厉晓东，卢建平，刘小红，林福呈.稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测.植物病理学报.2011,41(4):361-370)。
102.3)引起水稻白叶枯病的稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzaepv.oryzae，xoo)(杨雅云，张敦宇，陈玲，陈越，殷富有，蒋春苗，肖素勤，柯学，余腾琼，王波，付坚，钟巧芳，陈功友，程在全.云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定.植物病理学报.2019,1:101-112)。
103.4)番茄青枯病病菌-青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)(魏海雷,王烨,张力群,唐文华.生防菌株2p24与cpf-10的鉴定及其生防相关性状的初步分析.植物病理学报,2004,34:80-85)。
104.5)烟草黑胫病病菌-烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)(王万能,全学军,肖崇刚.烟草疫霉的产孢和接种方法研究.植物保护学报,2005,32(1):18-22)。
105.6)引起瓜类细菌性果斑病的西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)(阚玉敏，云晓敏，李玉文，李健强，罗来鑫.bio-pcr方法检测葫芦科作物种子携带西瓜嗜酸菌的特异性引物筛选.植物病理学报，2018,48(2):263-270)，以下简称西瓜嗜酸菌。
106.7)引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)(许静，张美祥，叶廷跃，沈丹宇，窦道龙.辣椒疫霉菌piavr3a-like基因的鉴定及功能分析.植物病理学报，2016,46(2)：160-168)。
107.以下实施例中所用培养基配制方法如下：
108.pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000ml。
109.kb液体培养基：蛋白胨20g，mgso4·
7h2o 0.4g，甘油10ml，k2hpo
4 1.5g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.0-7.2。
110.kb固体培养基：蛋白胨20g，mgso4·
7h2o 0.4g，甘油10ml，k2hpo
4 1.5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000ml，ph7.0-7.2。
111.lb液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，蒸馏水定容至1000ml，ph 7.0-7.2。
112.lb固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000ml，ph 7.0-7.2。
113.营养琼脂培养基(na培养基)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖2.5g，琼脂18g，ph 7.0，蒸馏水定容至1000ml。
114.营养肉汤培养基(nb培养基)：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖2.5g，ph 7.0，蒸馏水定容至1000ml。
115.v8培养基：v8混合蔬菜汁(金宝汤公司，美国；货号f057)100ml，caco
3 1g，蒸馏水定容至1000ml。
116.实施例1、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270(cgmcc no.22678)的分离和鉴定
117.一、菌株2270的分离
118.菌株2270分离自西藏林芝县青稞根围土。称取2g根围土壤样品，加入盛有18ml无菌蒸馏水的三角瓶中，在28℃，200rpm条件下，震荡1h。室温静置5min后，取1ml上层清液，通过10倍梯度稀释至10-5
。每个浓度取100μl涂布于lb培养基平板，每个浓度梯度重复3个平板，置于28℃培养箱培养48h。挑取菌落单一且形态不同的菌落重新划线纯化，并编号xxxx，菌株2270便为其中之一。
119.二、菌株2270的鉴定
120.对上述分离得到的菌株2270经形态观察，生理生化特性分析和遗传进化分析鉴定，方法如下：
121.菌落的形态、大小、凹凸度、边缘，革兰氏染色及生理生化特征检测具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。结果表明，菌株2270为革兰氏阴性，呈杆状，严格好氧。菌落呈乳白色，表面光滑，规则圆形，粘稠状；可在kb培养基上产生明显荧光。菌株2270可在ph值在6-9和温度4-40℃范围内生长，最适ph值为7，最适生长温度为28-32℃。
122.菌株2270全基因组测序委托金唯智生物科技有限公司进行。通过对该菌株全基因组测序，从中分析拼接获得seq id no.1所示的16s rdna序列，基于该序列在ncbi blast比对分析并构建系统进化树(图1)。发现菌株2270与地中海假单胞菌(pseudomonas mediterranea)在同一分支，然而进一步对菌株2270和p.mediterranea cfbp 5447的16srrna序列比对分析，两者之间的序列相似性为97.95％。推测该菌株可能为假单胞菌属的一个新种。
123.菌株2270基因组草图测序及组装获得53个scaffolds，测序深度434
×
，n50长度为481,926bp，基因组全长6,587,045bp，g+c含量为59.26％。利用在线分析网站https://
www.ezbiocloud.net/tools/ani计算平均核苷酸一致性(ani)和http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php#计算dna-dna杂交值(ddh)，结果见表1。假单胞菌2270与p.lini dsm16768
t
的ani值最高，为94.38％，低于阈值95％；两者之间的ddh值仅为55.40％，远远小于70％的同一种阈值。而与假单胞菌2270在16s rrna同一分支上的p.mediterranea cfbp5447
t
，两者之间的ani和ddh值分别为84.02和26.30。这一结果为假单胞菌2270作为一个新种提供更加充分的支撑。
124.表1、假单胞菌2270与其近缘菌株ani及ddh值分析
[0125][0126][0127]
基于系统进化分析和ani、ddh计算，接下对假单胞菌2270、p.lini dsm16768
t
和p.mediterranea cfbp5447
t
的生理生化指标差异进行分析。利用biolog细菌鉴定系统，总体分析3株菌的生理生化活性，结果见表2。结果显示：在ph为6的条件下，菌株2270可以生长，而dsm 16768和cfbp 5447则不能生长；菌株2270和dsm 16768可以利用d-海藻糖作为碳源生长，而在l-海藻糖和1％乳酸钠为碳源时生长较弱，菌株cfbp 5447则能够有效利用1％乳酸钠作为碳源生长，而在d-海藻糖存在时生长较弱，且不能以l-海藻糖为碳源生长；菌株2270和cfbp 5447在梭链孢酸和d-丝氨酸存在时不能生长，但菌株dsm 16768则能够正常生长；菌株2270不能利用盐酸胍和柠檬酸生长，而dsm 16768和cfbp 5447则在两种底物存在是可以生长；菌株2270能够利用果胶、半乳糖醛酸、吐温40作为单一碳源生长，在l-半乳糖酸、葡萄糖醛酸、粘液酸和γ-amino-丁酸为单一碳源条件下呈弱阳性，但p.lini dsm16768
t
则均不可利用以上碳源，而菌株p.mediterranea cfbp5447
t
的无法利用吐温40；在以p-hydroxy-苯乙酸为单一碳源时，菌株2270和p.lini dsm16768
t
均不能生长，而p.mediterranea cfbp5447
t
的生长不受影响。
[0128]
表2、假单胞菌2270、p.lini dsm16768
t
和p.mediterranea cfbp5447
t
生理生化特征
[0129]
[0130]
[0131][0132]
注：其中，“+”表示可利用该碳氮源生长，“—”表示不可利用，“w”表示在该碳氮源基础上生长较弱；阴影部分表示菌株间存在差异的指标。
[0133]
在28℃条件下，利用lb培养基新鲜划线培养菌株2270及p.lini dsm16768
t
和p.mediterranea cfbp5447
t
用于脂肪酸谱的测定，通过sherlock微生物鉴定系统(midi)分析细胞中的脂肪酸甲酯含量(表3)。结果表明菌株2270与其近源模式假单胞菌中脂肪酸的组成基本相同，但是含量上却存在较大差异。
[0134]
表3、菌株2270及其近源模式菌株的细胞脂肪酸组成及含量
[0135]
[0136][0137]
综上所述，通过对菌株2270的形态特征、培养特性和系统进化分析可以明确菌株2270鉴定为假单胞菌(pseudomonas sp.)。进一步对其与假单胞菌属近源模式菌株进行ani和ddh计算分析，发现其与已知菌株的平均核苷酸一致性和dna-dna杂交值均低于菌种划分的临界值，且生理生化指标和脂肪酸含量差别较大，因此确定菌株2270为假单胞菌属一个新种，将其拉丁名命名为pseudomonas nyingchiensis，中文名为林芝假单胞菌。这一菌株的发现进一步丰富了有益假单胞菌资源。pseudomonas nyingchiensis 2270已于2021年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为cgmcc no.22678。
[0138]
实施例2、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的抑菌谱测定供试植物病原菌如下：
[0139]
病原真菌有：立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)、烟草疫霉(phytophthora parasitica var.nicotianae)、辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)。
[0140]
病原细菌有：稻黄单胞菌水稻致病变种(xanthomonas oryzaepv.oryzae，xoo)、青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)、西瓜嗜酸菌(acidovorax citrulli)。
[0141]
采用平板对峙培养法对上述植物病原菌分别进行拮抗实验。
[0142]
植物病原真菌对峙实验方法如下：用直径0.7cm的打孔器，取于25℃条件下，在pda平板(立枯丝核菌和稻瘟病菌)或v8平板(辣椒疫霉菌和烟草疫霉菌)上新鲜培养的植物病原真菌菌饼，用接种针挑取菌饼，菌丝朝下接种于对应平板中心处，然后在菌饼两侧约2.5cm处分别接种10μl浓度为1
×
109cfu/ml林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液(lb液体摇培)，晾干后于25℃倒置培养，以仅接种病原菌的平板为对照，每个处理设置3次重复。培养3-5天后观察并测量抑菌带宽度。
[0143]
植物病原细菌对峙实验方法如下：将琼脂含量为1％的na培养基融化后，水浴冷却至45℃。将在nb培养液中新鲜摇培的病原细菌浓度调至1
×
108cfu/ml，按照1％(体积百分比)的量加入冷却的na培养基中，倒平板。晾干后，在平板上接种10μl浓度为1
×
109cfu/ml林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液(lb液体摇培)。晾干后于28℃倒置培养，以仅接种病原菌的平板为对照，每个处理设置3次重复。培养48h后观察并测量抑菌圈直径。
[0144]
结果发现，林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液(lb液体摇培)对稻黄单胞菌水稻致病变种、立枯丝核菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉、烟草疫霉、西瓜嗜酸菌、青枯雷尔氏菌等植物病原真菌和病原细菌均具有良好的抑制效果(图2)。说明林芝假单胞
菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有较为广谱、高效的抑菌活性，在多种植物病害防控中具有潜在的应用价值。
[0145]
实施例3、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270对小麦纹枯病的室内防效实验
[0146]
林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵种子液的制备：挑取新鲜培养的单菌落，用接种针转接于5ml lb液体培养基，在28℃，200rpm下摇培过夜，获得种子液。
[0147]
发酵液制备：将种子按照0.1％(体积百分比)的浓度接种在装有200ml lb液体培养的三角瓶中，在28℃，200rpm下摇培48h，获得林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液。
[0148]
小麦纹枯病防效检测：选择颗粒饱满、大小均一的小麦种子(铭贤169)，经5％次氯酸钠表面消毒5min，用无菌水冲洗2-3次。在25℃无菌条件下保湿催芽，待小麦种子露白后，选择发芽一致的种子均分为三组，每组30颗种子，其中一组于浓度为5
×
108cfu/ml的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液(加入0.02％(体积百分比)的silwet l-77表面活性剂)中浸泡30min，另外两组浸泡于lb液体培养基中30min设为对照。然后将经林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液预处理和其中一组空白对照播种于土壤上层放置直径1cm小麦纹枯菌病原菌(立枯丝核菌，rhizoctonia solani)菌饼的试管中，另一组空白播种于土壤上层放置直径1cm空白pda培养基的试管中。置于23℃温室条件下生长7d，观察茎基部发病情况。计算发病率、病情指数和防治效果(表4)。
[0149]
发病率(％)＝发病植株数/处理植株总数
×
100％；
[0150]
病情指数＝[∑(各级病株数
×
对应病级)]/(调查总株数
×
最高病级)
×
100；
[0151]
防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数
×
100％。
[0152]
病情指数分级标准如下：
[0153]
采用5级分级标准：
[0154]
0级：无发病症状；
[0155]
1级：1个或多个小病斑，病斑长度小于0.5cm；
[0156]
2级：1个或多个中等大小病斑，长度0.5-1.5cm；
[0157]
3级：病斑较大，长度1.5-2.5cm；
[0158]
4级：1个或多个大病斑，病斑长度大于2.5cm且幼苗萎蔫；
[0159]
5级：幼苗枯死。
[0160]
表4、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270对小麦纹枯病的防治效果
[0161]
处理发病率(％)病情指数防治效果(％)发病对照85.56％25.67—2270预处理17.78％5.3379.22％健康对照00—
[0162]
实施例4、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270引起本氏烟细胞程序性死亡和表层免疫相关基因的显著表达
[0163]
将林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270于kb平板划线培养48h，刮取表面菌落，重悬浮于无菌的10mm mgcl2溶液中，浓度调至5
×
108cfu/ml，使用1ml无针注射器
接种生长6周的本氏烟叶片，以单独接种10mm mgcl2为对照，每个处理重复3次。然后将处理植株置于22℃光照培养箱(光暗时长16/8h，光照强度100μmol/m2·
s，湿度约65％)培养1-2d，观察记录接种部位坏死情况。结果发现，经林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270菌体悬浮液接种后，在本氏烟叶片的接种部位均能引起明显的细胞坏死现象(图3中a)。说明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够激发本氏烟和番茄免疫反应。
[0164]
刮取kb平板新鲜培养的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270菌落，重悬浮于10mm mgcl2溶液，浓度调至5
×
108cfu/ml，得到林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270悬浮液，接种本氏烟叶片，以接种10mm mgcl2溶液为对照，每个处理设置3个重复。6h后每个重复用直径5mm的打孔器各取3个叶碟，并迅速用液氮冷冻。经植物rna提取试剂盒(plant rna kit(r6827-01)，omega)提取rna，利用dna酶(dnase i rnase-free(m0303s)，neb)消化彻底清除dna后进行cdna反转录(protoscript ii first strand cdna synthesis kit(e6560s)，neb)。利用sybr green(universal qpcr master mix(m3003l)，neb)进行定量pcr检测，以ef1a基因为参考基因，并与10mm mgcl2溶液接种植株对比。结果显示假单胞菌2270可以激发pti5基因、wrky7基因、wrky8基因、hin1基因、hsr203j基因、pr1a基因和npr1基因这些免疫相关基因显著上调表达(图3中b)。仪器使用abi quantstudiotm 6flex实时荧光定量pcr系统，引物序列如表5所示。
[0165]
表5、免疫相关基因定量pcr检测引物序列信息
[0166]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)nbpti5-fcctccaagtttgagctcggatagtnbpti5-rccaagaaattctccatgcactctgtcnbwrky7-fcacaagggtacaaacaacacagnbwrky7-rggttgcatttggttcatgtaagnbwrky8-faacaatggtgccaataatgcnbwrky8-rtgcatatcctgagaaaccattnbhin1-fagttgtctctttggatgcctctgcnbhin1-ractgagtcaacgtagcatcggtcanbhsr203j-fcgcaattccaatccatccaggcttnbhsr203j-rgcaatttaagctcctcaaccgcctnbpr1a-fgtaatatcccactcttgccgnbpr1a-ratgaaatcgccacttccctcnbnpr1-fttacttcactgaaacgcctnbnpr1-rcacttcctttaattccacctnbef1a-fgaaggatggatacaaccctgacanbef1a-rctcttgggctcattaatctggtc
[0167]
实施例5、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270显著促进拟南芥侧根形成和生物量增加
[0168]
拟南芥(col-0)种子经2％次氯酸钠表面消毒5min，用无菌水冲洗3遍。均匀点接于ms(caisson，美国；货号：msp09-50lt)平板一侧，每板8颗种子，然后用锡箔纸包裹置于4℃，
遮光春化2d。取出后，于22℃培养箱(光暗时长16/8h，光照强度100μmol/m2·
s，湿度约65％)培养5d，待种子出芽约0.5cm。在每棵幼苗下方接近平板底部位置点接浓度为5
×
108cfu/ml的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液各2μl，如图4所示。以接种等量的lb液体培养基为对照，每个处理重复3次。然后置于上述条件下培养14d。测量各处理拟南芥的根系长度、侧根数量及植株鲜重。结果表明，与空白对照相比，接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270发酵液可以显著增加拟南芥的侧根形成数量和生物量(图4)。证明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够拟南芥促进侧根发育，并提高拟南芥的生物量。
[0169]
实施例6、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够分泌iaa
[0170]
采用salkowski比色法测定内生细菌分泌植物生长激素(iaa)，将供试菌株林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270和不产iaa的阴性对照菌株escherichia coli dh5α(康润生物，中国)分别接种于含有lb液体培养基(培养基中加入终浓度3mm的色氨酸)的三角瓶中，每瓶盛有20ml培养基，每各处理重复3次，置于28℃，200rpm摇床摇培4d。取100μl培养液滴于白色陶瓷板上，同时加100μl salkowski比色液(50ml 35％hclo4+1ml 0.5mol/l fecl3)。在比色液中加入100μl 100mg/l的iaa为阳性对照。将白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，比色液颜色变红表示能够分泌iaa(图5)。结果表明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270使比色液变红，能产生植物生长素(iaa)。
[0171]
实施例7、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有产氨的能力
[0172]
将新鲜培养的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270转接到蛋白胨氨化培养基中(蛋白胨5g，k2hpo
4 0.5g，nacl 0.25g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso
4 0.01g，蒸馏水定容至1000ml)，28℃，200rpm摇培48h。取200μl培养液滴于白色陶瓷板上，以200μl蛋白胨氨化培养基为对照。然后在培养液和蛋白胨氨化培养基中加入3滴纳氏试剂(源叶生物，中国；货号：s26016-100ml)，出现黄色或棕红色沉淀则表明菌株具备产nh3的能力。结果表明，对照中加入纳氏试剂后无黄色或棕红色沉淀出现，而林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的培养液加入纳氏试剂后有明显的黄色或棕红色沉淀出现(图6)。说明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有显著的产氨能力。
[0173]
实施例8、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有产蛋白酶的能力
[0174]
将活化的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270接种于lb液体培养基，在28℃，200rpm条件下过夜摇培。取2μl培养液点接于蛋白酶检测培养基平板(蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，cacl
2 0.1g，脱脂牛奶10.0ml，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml)，115℃灭菌30min，ph 7.2-7.4)，以点接2μl lb液体为对照处理，每个处理重复3次。晾干后在28℃倒置培养2d，观察是否出现透明圈。结果显示，对照组平板无任何变化，而接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270的检测平板上在接种菌落周围出现明显的水解透明圈(图7)，说明平板中的蛋白被分解。证明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有产蛋白酶的能力。
[0175]
实施例9、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有产嗜铁素的能力
[0176]
铬天青蓝色定性检测平板的制备：
[0177]
取0.012g铬天青溶于10ml去离子水中，并与2ml浓度为1mmol/l的fecl3溶液混匀，得溶液a。
[0178]
取0.015g十六烷基三甲基溴化铵溶于8ml去离子水中，得溶液b。
[0179]
将a液缓慢加入b液中，充分混合均匀即得到染液c。
[0180]
将0.1mol/l磷酸盐溶液(2.427g na2hpo4·
12h2o，0.5905g nah2po4·
2h2o，0.075g kh2po4，0.125g nacl，0.25g nh4cl，去离子水定容至100ml，使用时10倍稀释)10ml、哌嗪二乙醇磺酸(pipes)6.04g加入盛有150ml蒸馏水的干净三角瓶中，混匀并用50％naoh溶液将ph调至6.8，最后加入4g琼脂粉，得培养基d。
[0181]
将染液c、培养基d及1mmol/l cacl2、1mmol/l mgso4·
7h2o、20g/100ml葡萄糖、10g/100ml酪蛋白氨基酸灭菌(1l5℃，20分钟)。分别量取上述1mmol/l cacl
2 0.2ml、1mmol/l mgso4·
7h2o 4ml、酪蛋白氨基酸溶液6ml、葡萄糖溶液2ml加入培养基d中。再缓慢加入染液c，充分摇匀后倒平板，即可获得铬天青蓝色定性检测平板。
[0182]
将活化的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270接种于lb液体培养基，在28℃，200rpm条件下过夜摇培。
[0183]
取2μl培养液点接于铬天青蓝色定性检测平板上，28℃培养24、48、60、72h观察菌落外围是否产生黄色晕圈。由于嗜铁素竞争培养基中edta螯合的铁离子，使培养基中蓝色褪去，在菌落周围褪色晕圈。结果表明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270菌落周围出现明显的褪色晕圈，证明该菌株具备产生嗜铁素的能力(图8)。
[0184]
实施例10、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够水解有机磷
[0185]
将活化的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270接种于lb液体培养基，在28℃，200rpm条件下过夜摇培。取2μl培养液点接于蒙金娜有机磷培养基平板(葡萄糖10g，(nh4)2so
4 0.5g，nacl 0.3g，kcl 0.3g，feso4·
7h2o 0.03g，mnso4·
4h2o0.03g，蛋黄卵磷脂0.2g，caco
3 5g，酵母膏0.4g，琼脂15g，蒸馏水定容至l000 ml，ph 7.0)，以点接2μl lb液体为对照处理，每个处理重复3次。晾干后在28℃倒置培养5-7d，观察是否出现水解晕圈。结果显示，对照组平板无任何变化，而接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270培养液的平板上在接种菌落周围出现明显的水解晕圈(图9)，说明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够水解有机磷，可用于土壤改良。
[0186]
实施例11、林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270具有分解钾长石的功能
[0187]
将活化的林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270接种于lb液体培养基，在28℃，200rpm条件下过夜摇培。取2μl培养液点接于解钾培养基(蔗糖5g，mgso4·
7h2o 0.5g，fecl
3 0.005g，caco
3 0.1g，钾长石粉2g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml)，以接种2μl lb液体为对照处理，每个处理重复3次。晾干后在28℃倒置培养3-5d，观察菌落生长状况。若能正常生长则证明菌株可以分解钾长石。结果显示，对照组平板无任何变化，而接种林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270培养液的平板上能够明显观察到菌落生长(图10)，说明林芝假单胞菌(pseudomonas nyingchiensis)2270能够分解钾长石，提高土壤养分含量，改善植物根系营养状况。
[0188]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申
请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。