一种负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物材料是一类用于诊断、治疗、修复或替换人体组织、器官或增进其功能的新型高技术材料，涉及亿万人的健康，其应用不仅挽救了数以万计危重病人的生命，显著降低了心血管病、癌症、创伤等重大疾病的死亡率，而且为提高患者生命质量和健康水平、降低医疗成本发挥了重要作用。
3.目前，每年有数百万例使用生物惰性金属材料进行骨组织修复固定手术，或者自体(患者自身)骨移植和同种异体(来自他人)骨移植。然而，金属固定装置往往需要二次手术进行摘除，容易引起细菌感染。自体骨移植会造成供体部位额外的发病率，同种异体骨移植的疾病传播风险是不可预估的。近些年，骨组织工程支架材料取得了实质性的进展，这些材料在不产生上述风险的情况下，促进骨缺损部位的骨再生和修复。
4.水凝胶是水溶胀的交联体型聚合物分子网络，一般由单体聚合而成或分子链之间通过氢键或范德华力形成网络。在过去几十年里，由于其在生物材料领域的特殊应用，备受关注。医药级聚乙烯醇，不同于化工级别聚乙烯醇，它是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，尤其在医疗中，水性凝胶在眼科、伤口敷料和人工关节方面有广泛应用，同时聚乙烯醇薄膜在药用膜、人工肾膜等方面也有使用。聚乙烯醇与单丁酸在酸性环境下，再添加一些离子可形成双网络水凝胶，并在中性环境下加热可固化及贴附在其他材料表面。成型后的水凝胶具有细胞亲和性，并可以负载生长因子在体内缓慢释放，但单独使用其力学性能难以作为骨的替代物在体内应用。
5.聚酰亚胺作为一种特种工程材料，已广泛应用在航空、航天、微电子、纳米、液晶、分离膜、激光等领域。在生物材料领域，聚酰亚胺具有良好的生物相容性，更贴近人体骨组织的弹性模量和强度，加工方式更为灵活，并可根据实际应用设计制备，可作为植入骨的替代材料，但材料本身是生物惰性以及疏水的，因此制备一种生物活性好、成骨性能以及抗菌性能优异的聚酰亚胺生物活性材料意义重大。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料及其制备方法和应用，旨在解决聚酰亚胺本身生物活性的不足和水凝胶本身存在的力学性能缺陷，负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料以聚酰亚胺作为硬支撑，水凝胶负载在聚酰亚胺表面作为生长因子的载体，使得整个材料既具有良好的细胞活性，并在成骨性能以及抗菌性能上表现优异。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明目的之一是提供一种负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料的制备方法，包括如下步骤：将聚酰亚胺基材浸入强碱溶液中进行水热处理，将水凝胶包覆在处理过的聚酰亚胺基材表面，然后浸泡在生长因子溶液中，灭菌后得到负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料。
9.进一步地，所述聚酰亚胺是由铸造、挤压成型、粉末热压成型等塑料加工方法制备，制备出的聚酰亚胺基材的形状可根据实际应用需要设计，具体的，将聚酰亚胺表面打磨光滑后，用溶剂超声清洗并干燥。
10.进一步地，打磨为干打磨、湿打磨或机械打磨；超声清洗采用丙酮、乙醇、丙醇、甲酰胺或去离子水进行，最佳为丙酮、乙醇、去离子水；干燥为在真空干燥箱中40～120℃干燥1～24h，最佳温度时间为50～80℃、4～12h。
11.进一步地，所述强碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为0.01～1mol/l，最佳为0.02～0.5mol/l；所述水热反应的温度为100～150℃，时间为1～12h，最佳为110～130℃，1～4h。
12.进一步地，所述水热处理后再次进行超声清洗，超声清洗采用丙酮、乙醇、丙醇、甲酰胺或去离子水进行，最佳为丙酮、乙醇、去离子水；清洗完成后加热至40～100℃，最佳为50～90℃。
13.进一步地，所述水凝胶为聚乙烯醇单丁酸双网络水凝胶，具体制备方法为：将聚乙烯醇、单丁酸溶解在去离子水中，用酸性溶液调节ph至1～2，再加入金属离子，用碱性溶液调节ph至7～8。
14.进一步地，所述金属离子为镁离子、锌离子、铁离子和钙离子中的任意一种，镁离子最佳；所述去离子水、聚乙烯醇、单丁酸和金属离子的质量比为(90～95):(0.5～5):(0.5～5):(0.05～0.5)。
15.进一步地，所述酸性溶液为稀盐酸、稀硫酸和稀硝酸中的任意一种，稀盐酸最佳；所述碱性溶液为氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的任意一种，氢氧化钠溶液最佳。
16.进一步地，所述包覆是将水凝胶滴加在聚酰亚胺基材表面，或将聚酰亚胺基材浸没在水凝胶中1～20s，最佳为3～10s。
17.进一步地，所述生长因子为骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少一种，优选骨形态发生蛋白；所述生长因子溶液的浓度为0.01～10mg/l，最佳为0.1～5mg/l，所述浸泡在生长因子溶液中的时间为10～48h，最佳为16～32h。
18.进一步地，所述灭菌为紫外灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌中的任意一种，最佳为紫外灭菌。
19.本发明目的之二是提供一种所述制备方法制备的负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料。
20.本发明目的之三是提供一种所述的负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料在细胞培养增殖载体和骨组织植入材料领域中的应用。
21.进一步地，所述应用具体为，在体外可用作鼠胚成骨细胞(3t3细胞)、骨髓间充质干细胞(bmsc)、人体内皮细胞、神经等细胞的培养增殖载体，在体内可作为人骨替代物，包括人体内软骨、皮质骨、半月板、颅骨等骨组织的植入材料，也可作为鼠、兔、猫、狗等相对应
的骨组织的植入材料，同时也可作为蛋白、药物的体内载体。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明提供的一种负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料可通过铸造、挤压成型或粉末热压成型等加工方式配以对应的模具从而制备出不同形状的基材以匹配不同的使用环境，加工方式灵活。强碱溶液水热处理过后的聚酰亚胺亲水性大大提高，生物相容性提高，有利于水凝胶的贴附。制备的聚乙烯醇单丁酸双网络水凝胶具有简易可控的成凝胶方式，固化速度快，可顺利完成水凝胶在聚酰亚胺基材上的负载，并且水凝胶可载药载生长因子进入体内进行缓慢释放，大大提高材料的生物活性和功能性。本发明提供的负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料既具有贴近人体骨组织的弹性模量和强度，同时具有良好的生物相容性，成骨性能以及抗菌性能，具有十分广泛的应用价值。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料的制作过程示意图。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.在本发明中，打磨优选用砂纸在聚酰亚胺基材表面打磨光滑，先用300～800目砂纸初磨、接着1000～2000目砂纸精细磨、最后3000～5000目砂纸抛光处理。
32.在本发明中，超声清洗使用的有机溶剂优选丙酮和乙醇，丙酮、乙醇和去离子水的
超声清洗的时间分别为8～12min、8～12min、10～12min。
33.在本发明中，在聚酰亚胺基材表面滴加水凝胶溶液的滴加量为0.1～0.5ml/cm2。
34.在本发明中，所有原料均为常规市售产品，其中，骨形态发生蛋白的品牌为bioss。
35.实施例1
36.将聚酰亚胺采用粉末热压成型加工成直径为10mm的棒材，通过线切割成厚度为1mm的薄片。用砂纸在聚酰亚胺基材表面打磨光滑，先用800目砂纸初磨、接着1000目砂纸精细磨、最后3000目砂纸抛光处理。依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，超声时间分别为8min、8min、10min。在真空干燥箱中80℃干燥6h，干燥完成后浸入浓度为0.1mol/l氢氧化钠溶液中，在120℃下水热反应2h。水热完成后再次超声清洗，清洗步骤同上，清洗完成后备用。
37.按照去离子水：聚乙烯醇：单丁酸：镁离子质量比为90：5：5：0.05，称量5g聚乙烯醇，5g单丁酸，将聚乙烯醇、单丁酸溶解在90g去离子水中，用稀盐酸调节ph至1.5，再加入0.3g硝酸镁，接着用氢氧化钠溶液将水凝胶溶液ph调至8后备用。
38.将聚酰亚胺基材放入去离子水中加热到80℃，趁热在其表面滴加0.3ml/cm2制备的水凝胶溶液，10s后水凝胶在聚酰亚胺基材上固化，再将负载水凝胶的聚酰亚胺基材放入含有0.16mg/l骨形态发生蛋白的溶液中，浸泡24h后，紫外灭菌30min得到负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料。
39.实施例2
40.将聚酰亚胺采用粉末热压成型加工成直径为20mm的棒材，通过线切割成厚度为1mm的薄片。用砂纸在聚酰亚胺基材表面打磨光滑，先用800目砂纸初磨、接着2000目砂纸精细磨、最后3000目砂纸抛光处理。依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，超声时间为分别为10min、10min、10min。在真空干燥箱中80℃干燥6h，干燥完成后浸入浓度为0.2mol/l氢氧化钠溶液中，在120℃下水热反应2h。水热完成后再次超声清洗，清洗步骤同上，清洗完成后备用。
41.按照去离子水：聚乙烯醇：单丁酸：镁离子质量比为94：3：3：0.05，称量3g聚乙烯醇，3g单丁酸，将聚乙烯醇、单丁酸溶解在94g去离子水中后用稀盐酸调节ph至2，再加入0.3g硝酸镁，接着用氢氧化钠溶液将水凝胶溶液ph调至7.5后备用。
42.将聚酰亚胺基材放入去离子水中加热到70℃，趁热在其表面滴加0.1ml/cm2制备的水凝胶溶液，8s后水凝胶在聚酰亚胺基材上固化，再将负载水凝胶的聚酰亚胺基材放入含有0.24mg/l骨形态发生蛋白的溶液中，浸泡30h后，紫外灭菌30min得到负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料。
43.实施例3
44.将聚酰亚胺采用粉末热压成型加工成直径为15mm的棒材，通过线切割成厚度为1mm的薄片。用砂纸在聚酰亚胺基材表面打磨光滑，先用800目砂纸初磨、接着1000目、2000目砂纸精细磨、最后5000目砂纸抛光处理。依次用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，超声时间为分别为12min、12min、12min。在真空干燥箱中70℃干燥8h，干燥完成后浸入浓度为0.3mol/l氢氧化钠溶液中，在120℃下水热反应1h。水热完成后再次超声清洗，清洗步骤同上，清洗完成后备用。
45.按照去离子水：聚乙烯醇：单丁酸：镁离子质量比为92：4：4：0.05，称量4g聚乙烯
醇，4g单丁酸，将聚乙烯醇、单丁酸溶解在92g去离子水中后用稀盐酸调节ph至1.5，再加入0.3g硝酸镁，接着用氢氧化钠溶液将水凝胶溶液ph调至8后备用。
46.将聚酰亚胺基材放入去离子水中加热到75℃，趁热在其表面滴加0.5ml/cm2制备的水凝胶溶液，7s后水凝胶在聚酰亚胺基材上固化，再将负载水凝胶的聚酰亚胺基材放入含有0.30mg/l骨形态发生蛋白的溶液中，浸泡24h后，紫外灭菌30min得到负载水凝胶的聚酰亚胺生物活性材料。
47.对比例1
48.同实施例1，区别在于，聚酰亚胺基材未进行水热处理。
49.对比例2
50.同实施例1，区别在于，未添加水凝胶。
51.对比例3
52.同实施例1，区别在于，未添加生长因子。
53.测试实施例1～3和对比例1～3的聚酰亚胺基材的弹性模量和硬度(硬度测定方法为hardness.rockwell-e d785)，并检测细胞活性、碱性磷酸酶活性，结果汇总于表1。
54.将生物活性材料放入四十八孔板中，每孔放入一片制得的聚酰亚胺片，之后在每孔接种8000细胞数，细胞为骨髓间充质干细胞，放入培养箱培养1、3、7天，并以空白聚酰亚胺片作为对照，采用mtt法评价其细胞活性。
55.将生物活性材料放入十二孔板中，每孔放入一片制得的聚酰亚胺片，之后在每孔接种8000细胞数，细胞为骨髓间充质干细胞，放入培养箱培养7、14天，并以空白聚酰亚胺片作为对照，使用bci/nbt碱性磷酸酶染色试剂盒检测细胞内碱性磷酸酶活性。
56.抑菌实验
57.分别将1
×
105cfu/ml的e.coli和s.aureus接种在不同样品表面37℃培养24h。然后洗脱表面粘附菌，通过超声处理(10min)收集。用pbs溶液稀释后，在lb固体培养基的培养板上涂布并培养18h。抗菌率计算公式为：抗菌率(％)＝(c-t)/c
×
100％。式中c为对照组的平均菌落数cfu，t为试验组的cfu。
58.分别将含有1
×
106cfu/ml的e.coli和s.aureus的50μl菌液滴入lb固体培养基的培养板中，均匀涂布。然后将制备的负载水凝胶的聚酰亚胺片和空白聚酰亚胺片放在培养基上，37℃条件下培养18h。样品周围的抗菌面积越大，抗菌活性越好。抑菌率和抑菌环直径见表2。
59.表1
[0060][0061]
表2
[0062][0063]
由表1和表2可知，实施例组相对于对照组细胞活性和碱性磷酸酶活性大大提高，对照组不出现抑菌环，几乎没有抑菌效果，本发明实施例对e.coli和s.aureus的抑制率可以达到100％，实施例3的抑菌环直径较大，其中对e.coli的抑菌环大约12mm，对s.aureus的抑菌环大约20mm，表明抑菌性能优异。
[0064]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。