一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法与流程

1.本发明属于蛋白检测领域。更具体地，涉及一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)属于冠状病毒科，为不分节段的单股正链rna病毒。它编码4种结构蛋白(s、e、m和n蛋白)，其中，n蛋白是病毒粒子的核心成分，其蛋白全长419个氨基酸，大小为43-50kda。n蛋白有三个相对保守的结构域，其中一域可与病毒基因组rna相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒rna的合成过程中发挥着重要的作用，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。n蛋白是一个磷酸化蛋白，磷酸化能够调节n蛋白的构象，增强与病毒蛋白的构象，增强与病毒rna的亲和力。在核衣壳包装过程中，n蛋白可与m蛋白相互作用，促进核衣壳包装成病毒粒子。
3.n抗原检测呈阳性可作为新冠早期感染的直接证据。然而，新冠病毒n蛋白上出现的各种突变意味着抗原逃逸检测抗体对的几率上升，导致试剂盒面临无法检出突变株病毒的风险。因此，开发一种能够鉴别新冠突变株的试剂盒具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法。
5.在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
6.一种抗体，其中，所述抗体抗体结合新冠病毒野生株n抗原第28-36位氨基酸片段。
7.本发明还提供了一种抗体偶联物，其包括上述抗体及偶联部分；其中，所述偶联部分选自标记物，固相载体，结合配偶体之一。
8.本发明还提供了编码抗体的核酸分子。
9.本发明的另一目的是提供了一种方法，其利用抗体1、抗体2和抗体3对待测样本进行免疫检测，所述抗体1能与m种新冠病毒抗原结合；所述抗体2能与除omicron突变株外的m-1种新冠病毒抗原结合，所述抗体2选自前述抗体；所述抗体3能与m种新冠病毒抗原结合。
10.本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的检测试剂。
11.本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸，其中，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置检测线1和检测线2，所述结合垫上设置有前述抗体3，所述检测线1上包被前述抗体1、所述检测线2上包被前述抗体2；所述抗体3用标记物进行标记；可选地，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。
12.本发明还提供了上述抗体、抗体偶联物、方法、试剂或试纸在检测新冠病毒omicron突变株的应用。
13.利用本发明抗体、试剂或方法能够快速、准确地鉴定或鉴别新冠突变型抗原，且检测效率高、成本低。
具体实施方式
14.本发明涉及一种抗体，所述抗体结合新冠病毒野生株n抗原第28-36位氨基酸片段。在一些实施方案中，所述新冠病毒野生株n抗原第28-36位氨基酸片段如seq id no:5所示。本发明新冠病毒野生株n抗原的描述特指最先发现的野生株新冠病毒n抗原。
15.在一些实施方案中，所述抗体不结合新冠病毒野生株n抗原第31-33位发生缺失的氨基酸片段；在一些实施方案中，所述抗体不结合seq id no:3或4所示的氨基酸片段；在一些实施方案中，所述抗体不结合新冠病毒omicron突变株n抗原。其中，新冠病毒omicron突变株n抗原存在e31del、r32del、s33del。
16.在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。在一些实施方案中，可以采用本领域已知的方法制备本发明的抗体，例如利用其全长抗原或者已知表位的抗原片段(如本发明所述的28-36位氨基酸片段)作为免疫原免疫动物，获得结合所述抗原片段的抗体。为了增加免疫原性，可以将载体蛋白(包括但不限于bsa、卵清蛋白、klh等)与免疫反应性物质(例如表位肽)偶联。载体蛋白可以包括蛋白质或多肽，其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白和/或其片段。
17.本发明杂交瘤细胞由免疫原免疫的b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到。
18.本发明还涉及抗体偶联物，包括上述抗体及偶联部分；所述偶联部分选自标记物，固相载体，结合配偶体之一；在一些实施方案中，所述标记物选自金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，电化学标记，放射性标记，核酸标记，或酶标记；在一些实施方案中，所述标记物选自罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，胶乳微球，三联钌、鲁米诺类、eu螯合物，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记；在一些实施方案中，所述固相载体选自磁性颗粒、胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜，尼龙膜或微流控芯片；在一些实施方案中，结合配偶体选自生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；在一些实施方案中，根据应用场景对抗体进行标记物偶联或者固相载体偶联。
19.本发明还涉及一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗体。
20.本发明还涉及一种鉴别新冠突变型抗原的方法，利用抗体1、抗体2和抗体3对待测样本进行免疫检测，所述抗体1能与m种新冠病毒抗原结合；所述抗体2能与除omicron突变株外的m-1种新冠病毒抗原结合，所述抗体2选自前述抗体；所述抗体3能与m种新冠病毒抗原结合，m为大于等于2的整数。本发明所述“m种新冠病毒抗原”包括野生株和突变株新冠病毒的抗原，其中突变株不限于omicron突变株，还可以是b.1.1.7突变株、b1.351突变株或b.1.1.28突变株。本发明所述“除omicron突变株外的m-1种新冠病毒抗原”包括野生株，可选地还包括除omicron突变株外的其他突变株，如b.1.1.7突变株、b1.351突变株或b.1.1.28突变株。相关检测原理见专利申请202110315361.5。
21.在一些实施方案中，所述抗体1和抗体3夹心检测新冠病毒抗原；所述抗体2和抗体3夹心检测新冠病毒抗原；这里所述的新冠病毒抗原不限于n抗原，或者也可以是s抗原，不限于野生株，也可以是突变株。在一些实施方案中，所述新冠病毒抗原为新冠病毒抗原n抗原。
22.利用本发明的抗体，任何免疫检测方法均可适用。在一些实施方案中，所述方法可以是免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光法、胶乳免疫比浊法。
23.例如在一些实施方案中，采用免疫层析法，制备一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置检测线1和检测线2，所述结合垫上设置有前述抗体3，所述检测线1上包被前述抗体1、所述检测线2上包被前述抗体2；所述抗体3用标记物进行标记，例如金属粒子，荧光标记，例如胶体金，荧光素，荧光微球，胶乳微球。在一些实施方案中，将免疫层析试纸与待测样本接触，当检测线1和检测线2同时显色或检测线1和2显色基本一致(例如相差1个色卡以内)，则判定为样品中不含有新冠病毒omicron突变株；当检测线1显色，检测线2不显色时或者检测线1和2显色存在明显差异(例如相差3个色卡以上)，则判定为样品中含有新冠病毒omicron突变株。
24.在一些实施方案中，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。所述质控线包被有捕获内参的试剂；所述内参可以是配对抗体，或其他抗原或抗体类物质；所述内参用可检测标记物进行直接或间接标记；在一些实施方案中，所述内参用胶体金标记；在一些实施方案中，所述胶体金标记的内参设于结合垫上；在一些实施方案中，所述内参为特定物种来源的抗体或抗原；在一些实施方案中，所述特定物种来源可以是牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；在一些实施方案中，所述内参为小鼠来源的抗体或抗原(例如配对抗体为鼠源)，所述质控线包被有抗小鼠igg；例如质控线包被有羊抗小鼠igg。
25.本发明还涉及一种鉴别新冠突变型抗原的检测试剂，所述试剂包含前述抗体或前述抗体1、抗体2和抗体3。本发明所述试剂应做广义理解，其主要指承载免疫检测相关试剂的工具；在一些实施方案中，还可以进一步包括一些配套试剂，其可以是例如工作液，但不限于此。
26.前述抗体，抗体偶联物、方法，试剂或试纸在检测新冠病毒omicron突变株或制备新冠病毒omicron突变株检测产品中的应用。
27.一种检测新冠病毒omicron突变株的方法，包括将待测样本分别与抗体1、抗体2和抗体3接触，检测免疫反应，当抗体1和抗体3夹心反应结果和抗体2和抗体3夹心反应结果均为阳性时，则待测样本中不含新冠病毒omicron突变株。当抗体1和抗体3夹心反应结果为阳性，抗体2和抗体3夹心反应结果为阴性时，则待测样本中含新冠病毒omicron突变株。在一些实施方案中，待测样本采用稀释液进行稀释后进行测定，例如稀释液为pbs。
28.在一些实施方案中，也可以采取酶联免疫吸附方法进行测定，例如将抗体1和抗体2分别用hrp进行标记，抗体3用elisa板固定。
29.本发明中，待测样本包括健康或病理状态的鼻咽拭子、痰、唾液、下呼吸道分泌物、血液(包括血清、血浆或全血)、尿液或粪便。
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
31.实施例1单克隆抗体的制备
32.1、免疫动物
33.取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的balb/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的2019-ncov n蛋白重组抗原(seq id no:1，全长1-419aa，下称2019-ncovn)与等量福氏完全佐剂
充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的2019-ncovn与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接elisa法)，滴度在1∶2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
34.2、饲养细胞的制备
35.以balb/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，balb/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入rpmi 1640基础培养液5ml，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用rpmi 1640筛选培养液(含hat的rpmi 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1
×
105个/ml，加入96孔板，150μl/孔，37℃，5％co2培养过夜。
36.3、免疫脾细胞的制备
37.小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，rpmi 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，rpmi 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
38.4、细胞融合
39.(1)取40ml hat培养液，15ml dmem无血清培养液和1ml50％peg(m12000)分别置于37℃水浴中预温；
40.(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2～5
×
107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50ml离心管中混匀，并加dmem无血清培养液至40ml。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
41.(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7ml预温的50％peg溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15ml预温的无血清培养液；
42.(4)补加dmem无血清培养液至40ml，离心10分钟，倒尽上清液。加40ml含15％～20％胎牛血清的hat培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％co2的培养箱中培养。
43.5、杂交瘤细胞的选择培养
44.免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经peg处理后，形成多种细胞成分的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞；骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体，以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的异核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此，在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体，并选择出真正的杂交细胞。因此，在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的hat培养液换液培养。
45.6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
46.吸取每个培养孔的上清液，用间接elisa法检测出培养液中含特异性识别2019-ncovn的抗体的培养孔。采用间接elisa法鉴定细胞培养上清的交叉反应性，用2019-ncovn包被96孔板，封闭，加入杂交瘤细胞培养液上清孵育，加二抗，测405nm反应值，挑选反应值(0.5以上)比较高的细胞株制备抗体进行下一轮筛选实验。筛选得到以下有较好反应性的抗体。
47.实施例2抗体结合片段确认
48.将实施例2筛选得到的抗体，进一步进行特异性表位筛选，用新冠抗原野生株n抗原1-43位对应的氨基酸片段(seq id no:2)、及新冠抗原野生株n抗原1-419位，且31-33位
缺失的氨基酸片段(seq id no:3)筛选抗体，获得与seq id no:2结合，但不与seq id no:3结合的抗体，进一步将抗体与1-419，且e31del、g204r、p13l、r32del、r203k、s33del(seq id no:4)结合，看其与新冠病毒omicron突变株n抗原的反应，具体反应值如下：
[0049][0050]
注：od450大于0.5为强反应，od450小于0.1为不反应。
[0051]
可见以上抗体对新冠病毒omicron突变株n抗原不反应，对新冠病毒野生株n抗原强反应，采用elisa方法，可以实现新冠病毒omicron突变株的鉴定。
[0052]
对获得的抗体进一步鉴定结合片段，最终确认其结合片段为新冠抗原野生株n抗原28-36位对应氨基酸片段(seq id no:5)。
[0053][0054]
注：“+”表示od450大于1。
[0055]
因此，本发明提供了一类结合新冠抗原野生株n抗原28-36位的抗体，且不结合新冠抗原野生株n抗原31-33位缺失的片段。
[0056]
以上结合实验是将0.2ug/ml待结合的氨基酸片段分别包被微孔，以pbs+20％nbs为稀释液，稀释单抗为一抗浓度到1ug/ml，以羊抗鼠igg-hrp为二抗，鉴定抗体的反应情况。
[0057]
实施例3鉴定突变型抗原
[0058]
本实施例的标记抗体为15c8或mb117(菲鹏自产)能结合新冠病毒野生株n抗原和新冠病毒omicron突变株n抗原，t1线包被抗体为mb30(菲鹏自产)能结合新冠病毒野生株n抗原和新冠病毒omicron突变株n抗原，t2线包被实施例1获得的抗体237或548。
[0059]
1、抗体标记：取5ml浓度为4/万的胶体金，加入30-40ul 0.2m k2co3，搅拌5min，加入标记抗体(所加抗体体积＝50μg/抗体浓度)，搅拌5min，再加入50ul 10％bsa封闭终止标记；离心10000rpm，7min，去上清，沉淀用金子复溶液复溶，最后用金子复溶液定容到0.5ml(即1/10胶体金溶液体积)。
[0060]
2、配制金子工作液：用金子复溶液将标记抗体浓缩金以20％的稀释比例配制成金子工作液，铺于玻璃纤维上。
[0061]
3、制备干燥好的金子：将铺好的金子放入冻干机冻干(1-2h)或者放37℃干燥房干
燥过夜。
[0062]
4、抗体包被：将硝酸纤维素膜与pvc底板组装好备用；将mb30抗体稀释至1.0-1.5mg/ml，用喷金画膜仪在nc膜上均匀地划t1线；再将237或548抗体稀释至1.0-1.5mg/ml，用喷金画膜仪在nc膜上均匀地划t2线；放37℃恒温箱60min。
[0063]
5、制备金标条：用切条机将金标条按需要的宽度切条，组装后加样进行检测。
[0064]
6、检测
[0065]
(1)检测品：5ng/ml的新冠病毒omicron突变株n抗原(seq id no:4)，和新冠病毒野生株n抗原(2019-ncovn)；
[0066]
(2)检测方法：根据色卡比对，肉眼判读显色读值。
[0067]
7、结果：
[0068][0069]
注：数字代表显色，数字越大，显色越弱(活性越低)，b为阴性。
[0070]
以上结果可以看出，237和548抗体对omicron突变株n抗原不反应，对新冠病毒野生株n抗原反应，由此可以实现对omicron突变株的快速鉴定。
[0071]
利用新冠抗原野生株n抗原28-36位氨基酸片段作为免疫原，可以快速筛选到结合28-36位氨基酸片段的抗体，如抗体28d3和28e11，对31-33位缺失的氨基酸片段无反应，利用这些抗体按前述方法进行omicron突变株的快速鉴定，具有预期的检测结果。
[0072]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0073]
序列表如下：
[0074]
seq id no:1
[0075][0076]
seq id no:2
[0077][0078]
seq id no:3
[0079][0080]
seq id no:4
[0081][0082]
seq id no:5
[0083]