一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用

一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种来源于葡萄座腔菌的腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用。
(二)

背景技术：

2.2-氯烟酸是一种重要的氮杂环类精细化工中间体，广泛应用于农药、医药化学品的合成。在农药领域，2-氯烟酸可用于合成磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺等。在医药方面，可用于合成抗生素、抗艾滋病药奈韦拉平、抗抑郁药米氮平、消炎药普拉洛芬、抗炎镇痛药尼氟灭酸等(精细与专用化学品，2018,26:10-12)。目前，2-氯烟酸的生产方法主要有烟酸氮氧化-氯化-水解法、烟腈氧化-氯化-水解法、3-甲基吡啶氯化-氧化法和烯基醚与氰乙酸乙酯成环法等，存在设备要求高、环境负担重、反应条件苛刻等缺陷(合成化学，2016，7:620-62)。因此，开发一条绿色高效的2-氯烟酸合成工艺具有重要意义。
3.腈水解酶是一类重要的工业酶，能够催化腈化合物水解生成相应的羧酸。腈水解酶生物催化过程具有反应条件温和、催化效率高、环境友好等特点，已成为生物有机合成中最为活跃的分支之一。如腈水解酶催化异丁基丁二腈不对称水解合成普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸(us10100297b2；zl201810765047.5；zl201810421118.x)。
4.腈水解酶催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸工艺具有过程简单、原子经济性高等优势，代表了2-氯烟酸绿色合成的发展方向。然而，目前已发现的腈水解酶催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸过程存在活力低、反应专一性差(生成2-氯烟酰胺)等问题。本发明通过半理性设计方法，构建了可高效合成2-氯烟酸的腈水解酶，对于开发2-氯烟酸绿色合成工艺具有重要意义。
(三)

技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种腈水解酶突变体及其在催化合成2-氯烟酸中的应用，通过蛋白质工程技术对葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)来源的腈水解酶(genbank no.kaf4311531.1)进行改造，提高腈水解酶的催化活力，同时消除副产物2-氯烟酰胺的生成，达到工业化生产的要求。
6.本发明采用的技术方案是：
7.本发明提供一种腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列第162位、第127位或第139位进行单突变或多突变获得的。本发明腈水解酶突变体是从基因文库中葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)来源的腈水解酶bd-nit基因(野生型bd-nit核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示)出发，通过定点饱和突变、构建突变体文库而筛选获得。
8.本发明通过b.dothidea腈水解酶基因(bd-nit)克隆表达，利用全质粒pcr技术对包含该基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库，利用高通量筛选模型对突变体
进行筛选，获得一系列对2-氯烟腈催化活力和反应专一性显著提升的腈水解酶突变体，优选所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第162位色氨酸突变为甘氨酸(w162g，核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示)；(2)将第127位异亮氨酸突变为缬氨酸，第162位色氨酸突变为甘氨酸(i127v/w162g，核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示)；(3)第162位色氨酸突变为甘氨酸，将第127位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第139位天冬氨酸突变为谷氨酸(i127v/d139e/w162g，核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示)。
9.本发明还涉及所述腈水解酶突变体的编码基因，编码基因构建的重组载体，以及重组载体转化宿主菌构建的重组基因工程菌，其中重组载体以pet-28a-bd-nit为基础。所述宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
10.本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸中的应用，所述应用的方法为：以腈水解酶突变体重组基因工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为催化剂，以2-氯烟腈为底物，以ph值为6-8的缓冲液(优选ph值为7.2的kh2po
4-k2hpo4缓冲液)为反应介质构成反应体系，在30-40℃、300-600rpm下反应(优选30℃、600rpm、48h)，反应结束后，反应液分离纯化获得2-氯烟酸。
11.所述反应体系中，催化剂的用量以菌体干重计为1-10g/l，优选1.15～4.6g/l；底物加入终浓度为40～160g/l，优选160g/l。所述底物采用分批方式添加，第一次添加终浓度为40g/l，之后每隔3h补料40g/l至投料总量为160g/l。
12.所述催化剂按如下方法制备：将腈水解酶突变体重组基因工程菌接种到含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养过夜，随后以2％(体积浓度)的接种量转接到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，180rpm培养至菌体浓度od
600
为0.6～0.8，随后向培养基中加入终浓度为0.1mm的iptg，于28℃，180rpm诱导培养12h；将发酵液于4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体；lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
13.与现有技术相比，本发明具备的有益效果主要体现在：
14.本发明提供的腈水解酶突变体i127v/d139e/w162g，消除亲本腈水解酶对2-氯烟腈的水合活力，催化过程无副产物2-氯烟酰胺产生，且腈水解活力大幅提高(催化活力提高34倍)，可专一性催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸，在酶法工业化合成2-氯烟酸中具有重要潜力。
(四)附图说明
15.图1野生型腈水解酶及突变体i127v/d139e/w162g全细胞催化2-氯烟腈制备2-氯烟酸的补料反应进程。
16.图2突变体i127v/d139e/w162g在不同菌体浓度下全细胞催化2-氯烟腈制备2-氯烟酸的补料反应进程。
(五)具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此：
18.本发明lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。
19.lb固体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 10g/l，琼脂18g/l，ph 7.0。
20.实施例1、腈水解酶突变文库的构建
21.将基因文库中葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)来源的腈水解酶(genbank no.kaf4311531.1)bd-nit氨基酸序列(核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示)，利用rosettafold预测模型及分子对接，表明腈水解酶的催化活性位点分别是第44位的谷氨酸、第127位的赖氨酸和第162位的半胱氨酸。根据前期研究结果(专利cn202011074098.7)，第162位的色氨酸对催化活力及反应专一性具有较大影响。因此，以bd-nit腈水解酶基因(核苷酸序列seq id no.1)的pet-bd-nit质粒为模板，对第162位的色氨酸进行饱和突变，即对162位对应的核苷酸利用nnk代替原有密码子，设计简并引物，进行全质粒pcr扩增。
22.表1、162位点定点饱和突变引物设计表
[0023][0024]
注：n＝a/g/c/t，k＝g/t，m＝a/c
[0025]
pcr反应体系(50μl)：2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mixture(10mm)1μl，如表1所示的突变引物10μm各2μl，质粒pet28-bd-nit 1μl，phanta max dna聚合酶0.5μl，ddh2o补至50μl。
[0026]
pcr条件：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性15s，59℃退火5s，72℃延伸30s，步骤(2)共30个循环；(3)最后72℃延伸3min，4℃保存。反应结束后，用0.9％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物后，再用dpn i消化原始模板，割胶回收，纯化pcr产物，热击导入e.coli bl21(de3)感受态中，涂布于含有50ug/ml卡那霉素lb平板上，30℃培养过夜，筛选阳性克隆，得到饱和突变库。
[0027]
实施例2、突变体w162g的筛选
[0028]
挑取上述实施例1饱和突变库单菌落至96深孔板中，每孔加入1ml含终浓度50μg/ml卡那霉素的lb培养基，37℃培养12h，取200μl菌液转接到800μl新鲜lb培养基(含终浓度50μg/ml卡那霉素，0.1mm iptg)，28℃培养18h。将96深孔板的菌液离心30min(4000rpm，4℃)，弃去上清后，用kh2po
4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph 7.0)洗涤并用200μl的kh2po
4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph 7.0)重悬菌体。
[0029]
各孔中加入终浓度为40mm的底物2-氯烟腈，30℃反应30min。反应结束后加入10μl 6m hcl终止反应，将96深孔板的反应液离心15min(4000rpm，4℃)，取30μl上清液转移至每孔中含有150μl邻苯二甲醛与巯基乙醇混合液(体积比1：5)的96孔微量反应板中，放置于37℃保温30min。随后利用酶标仪(激发波长412nm，发射波长467nm)测定荧光强度，将荧光强度提高的突变体利用液相色谱复筛验证后，进行测序分析。
[0030]
液相复筛反应体系(20ml)：100mm kh2po
4-k2hpo4缓冲液(ph 7.2)，50mm 2-氯烟
腈，湿菌体0.1g。反应液于30℃预热10min后，600rpm反应15min。取样500μl，加入10μl 6m hcl终止，hplc检测产物2-氯烟酸含量。液相色谱流动相为乙腈：水：磷酸＝250:750:1(v/v/v)，流速为1ml/min，检测波长为230nm。结果表明，突变株e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit-w162g水解活力最高(41.7u/g)，为野生型14倍。同时反应专一性也大幅提高，腈水合活力完全消除，反应液中未检测到酰胺副产物。同样条件下，以野生型腈水解酶bd-nit(核苷酸序列如seq id no.1所示)的工程菌e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit进行反应，hplc测试水解活力和水合活力，结果见表4。
[0031]
实施例3、腈水解酶迭代饱和突变
[0032]
在实施例2获得活力和反应专一性均提高的突变株w162g基础上，进一步选取催化活性中心周围氨基酸i127和d139位点进行改造。以w162g质粒作为突变模板，以i127位点饱和突变引物(表2)作为引物进行全质粒pcr扩增。
[0033]
表2、127位点定点饱和突变引物设计表
[0034][0035]
注：n＝a/g/c/t，k＝g/t，m＝a/c
[0036]
pcr条件：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性15s，60℃退5s，72℃延伸3.5min，步骤(2)共35个循环；(3)最后72℃延伸5min，4℃保存。扩增得到的pcr产物经内切酶dpn i 37℃消化3h，65℃灭活10min，转化导入e.coli bl21(de3)，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培养过夜。采用实施例2方法筛选获得活力最高的突变体i127v/w162g，水解活力达72.4u/g，未检测到水合活力。
[0037]
以pet-bd-nit-i127v/w162g质粒作为突变模板，以d139位点饱和突变引物(表3)作为引物进行pcr反应，引物序列如下表3：
[0038]
表3、139位点定点饱和突变设计引物
[0039][0040]
注：n＝a/g/c/t，k＝g/t，m＝a/c
[0041]
pcr条件：(1)95℃预变性5min；(2)95℃变性15s，60℃退火5s，72℃延伸3.5min，步骤(2)共35个循环；(3)最后72℃延伸5min，4℃保存。扩增得到的pcr产物经内切酶dpn i 37℃消化3h，65℃灭活10min，转化导入e.coli bl21(de3)，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培养过夜。经实施例2方法筛选，获得活力最高的突变体e.colibl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g，活力达100.3u/g，相比野生型提高34倍，未检测到水合活力(表4)。
[0042]
表4腈水解酶的活力对比
[0043][0044]
实施例4重组腈水解酶突变体的诱导表达
[0045]
取实施例3方法制备的10μl甘油管保藏的e.colibl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g菌液接种至10ml液体lb培养基(含有50μg/ml的卡那霉素)，37℃，200rpm培养过夜，以体积浓度2％接种量转接至100ml新鲜lb培养基中(含有50μg/ml的卡那霉素)，继续培养至od
600
为0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg，于28℃下诱导培养12h。培养结束后，4℃下8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％的生理盐水洗涤2次，得到重组腈水解酶基因工程菌e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g湿菌体细胞。
[0046]
同样条件，制备野生型e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit湿菌体细胞。
[0047]
实施例5含腈水解酶重组大肠杆菌在制备2-氯烟酸中的应用(一)
[0048]
转化体系组成及转化操作如下：20ml的kh2po
4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph 7.2)中，加入4.6g/l(干重)实施例4中获得的e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g，底物的初始加入终浓度为40g/l，每隔3h补料底物40g/l至投料总量为160g/l，于30℃，600rpm反应48h。利用实施例2所述hplc检测反应进程，结果见图1所示。
[0049]
同样条件下，以e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit湿菌体细胞为对照。
[0050]
结果表明，反应48h，突变体i127v/d139e/w162g和野生型bd-nit的2-氯烟酸浓度分别为172.4g/l和13.1g/l(图1)。
[0051]
实施例6含腈水解酶重组大肠杆菌在制备2-氯烟酸中的应用(二)
[0052]
转化体系组成及转化操作如下：20ml的kh2po
4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph 7.2)中，加入实施例4中获得的e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g湿菌体细胞，添加量为2.3g/l(干重)，底物的初始加入终浓度为40g/l，每隔3h补料底物40g/l至投料总量为160g/l，于30℃，600rpm反应48h。利用实施例2所述hplc检测反应进程，结果见图2。结果表明，反应48h后产物浓度为106.4g/l(图2)。
[0053]
实施例7含腈水解酶重组大肠杆菌在制备2-氯烟酸中的应用(三)
[0054]
转化体系组成及转化操作如下：20ml的kh2po
4-k2hpo4缓冲溶液(100mm，ph 7.2)中，加入实施例4中获得的e.coli bl21(de3)-pet-bd-nit-i127v/d139e/w162g湿菌体细胞，其添加量为1.15g/l(干重)，底物的初始加入终浓度为40g/l，每隔3h补料底物40g/l至投料总量为160g/l，于30℃，600rpm反应48h。利用实施例2所述hplc检测反应进程，结果见图2所示。结果表明，反应48h后产物浓度为76.5g/l(图2)。