一种与葡萄果实玫瑰香味相关的KASP分子标记与应用的制作方法

一种与葡萄果实玫瑰香味相关的kasp分子标记与应用
技术领域
1.本发明涉及kasp分子标记的应用，特别涉及一种与葡萄果实玫瑰香味相关的 kasp分子标记与应用。


背景技术：

2.葡萄是主要水果之一，对葡萄而言，果实的香气风味是吸引消费者得一种重要果 实性状。
3.目前，育种人员在葡萄育种工作中，主要采用的是传统的杂交育种手段，杂交种 子培育成苗，经过数年童期后，再对杂种单株的生长结果习性和果实性状进行评价， 以此来选择和淘汰杂种单株，该方法育种周期长，耗时耗力，耗土地资源，育种效率 低，随着分子生物学技术的迅速发展，以及葡萄基因组测序的完成，分子标记辅助育 种技术，可以对杂种单株进行早期选择，提前淘汰非目标性状单株。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的一个技术问题是如何高通量鉴定或辅助鉴定葡萄果实玫瑰香 味。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了下述a1-a3的任一种应用：
6.a1、检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型(即等位基因)的组 合物在鉴定或辅助鉴定葡萄果实玫瑰香味中的应用；
7.a2、检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型(即等位基因)的组 合物在制备鉴定或辅助鉴定葡萄果实玫瑰香味产品中的应用；
8.a3、检测葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t的多态性或基因型(即等位基因) 的组合物在葡萄育种中的应用或在制备葡萄育种产品中的应用；所述育种的目的包括 选育果实具有玫瑰香味的葡萄；
9.所述vvdxs-422g/t为葡萄基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为g或t， 为seq id no.1的第422位核苷酸；所述组合物包含所述pcr引物，所述pcr引物 为由核苷酸序列是seq id no.2的单链dna、核苷酸序列是seq id no.3的单链dna 和核苷酸序列是seq id no.4的单链dna组成的引物组合物。
10.本发明还提供鉴定或辅助鉴定葡萄果实是否具有玫瑰香味的方法，包括检测待测 葡萄的基因型，根据待测葡萄的基因型鉴定或辅助鉴定葡萄的果实是否具有玫瑰香 味；所述基因型为葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t的基因型；所述vvdxs-422g/t 为葡萄基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为g或t，为seq id no.1的第422 位核苷酸；所述组合物包含所述pcr引物，所述pcr引物为由核苷酸序列是seq idno.2的单链dna、核苷酸序列是seq id no.3的单链dna和核苷酸序列是seq idno.4的单链dna组成的引物组合物。
11.所述根据待测葡萄的基因型鉴定或辅助鉴定葡萄的果实是否具有玫瑰香味，可为 基因型为gt或者tt的待测葡萄果实具有玫瑰香味的概率高于或候选高于基因型为 gg的待
测葡萄具有玫瑰香味的概率。
12.本发明还提供上述鉴定或辅助鉴定葡萄果实玫瑰香味的方法在葡萄育种中的应 用。
13.本发明所要解决的另一个技术问题是如何进行葡萄育种，包括：检测葡萄基因组 中所述vvdxs-422g/t的基因型，选择葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t的基因型 为gt或者tt的葡萄作为亲本进行育种；所述gt是葡萄基因组中所述 vvdxs-422g/t为g和t的杂纯合型，所述tt是葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t 为t的纯合型。
14.所述育种的目的包括选育果实具有玫瑰香味的葡萄。
15.下述含有检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型(即等位基因)的 组合物的1)-3)中任一种产品也属于本发明的保护范围：
16.1)检测与葡萄果实是否具有玫瑰香味相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
17.2)鉴定或辅助鉴定葡萄是否具有果实玫瑰香味的产品；
18.3)用于葡萄育种的产品。
19.上述应用、方法和产品中，所述vvdxs-422g/t是葡萄基因组中的一个snp位 点，其核苷酸种类为g或t，为seq id no.1的第422位核苷酸；所述检测葡萄基因 组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型(即等位基因)具体可为检测vvdxs-422g/t 的核苷酸种类。葡萄基因组中vvdxs-422g/t的基因型可为gg、tt或gt。所述 gg是葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t为g的纯合型，所述tt是葡萄基因组中所 述vvdxs-422g/t为t的纯合型，所述gt是葡萄基因组中所述vvdxs-422g/t为 g和t的杂纯合型。
20.上述应用、方法和产品中，所述葡萄育种为培育选育果实具有玫瑰香味的葡萄。
21.上述应用、方法和产品中，所述检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基 因型(即等位基因)的组合物可为通过下述至少一种方法确定vvdxs-422g/t的多态 性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象 多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯 片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一 步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋 白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。
22.上述应用、方法和产品中，所述检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基 因型(即等位基因)的组合物如下1)、2)或3)：
23.d1)所述检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型的组合物含有扩 增包括所述vvdxs-422g/t在内的葡萄基因组dna片段的pcr引物；
24.d2)所述检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态性或基因型的组合物为含有 所述pcr引物的pcr试剂；
25.d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
26.上述应用、方法和产品中，所述pcr引物可被标记物标记。所述标记物指可用于 提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料； 放射性标记，诸如
32
p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)； 发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移 (fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、 放射性、比色、重量测定、x射线衍
射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可 以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括 核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中， 核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
27.所述pcr引物为由序列表中seq id no.2所示的单链dna、序列表中seq idno.3所示的单链dna和序列表中seq id no.4所示的单链dna组成的引物组合物。 其中，序列表中seq id no.2由23个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为fam接头序 列(作为标记物)，第22-44位核苷酸为特异序列；序列表中seq id no.3由25个 核苷酸组成，第1-21位核苷酸为hex接头序列(作为标记物)，第22-46位核苷酸 为特异序列。
28.上述应用、方法和产品中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括 试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试 剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的 产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr 仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测葡萄基因组中vvdxs-422g/t的多态 性或基因型的组合物。
29.本发明公开了一种新的用于检测葡萄果实玫瑰香味的kasp标记。本发明提供的 特异引物组，由seq id no.2所示的单链dna、seq id no.3所示的单链dna和seqid no.4所示的单链dna组成，其中seq id no.2所示的单链dna和seq id no.3 所示的单链dna带有荧光标记接头。本发明的一个实施例中，上述使用带有荧光标 记接头的引物组扩增两组多个样品包括vvdxs-422g/t在内的葡萄基因组dna，利 用高通量基因分型检测仪pherastar snp进行荧光信号处理，确定了vvdxs-422g/t 的核苷酸类型，并测定了每个待测样品的发芽指数。实验证明，在210个葡萄品种组 成的群体中，41个品种是gt或者tt基因型，其中35个有玫瑰香味，159个品种 是gg基因型，全部没有玫瑰香味，说明vvdxs-422g/t为基因型gt或者tt葡 萄品种的果实有玫瑰香味的概率显著高于snp位点vvdxs-422g/t基因型为gg的 葡萄品种。194个杂种后代植株的实验结果也验证了上述结果，说明vvdxs-422g/t 是与葡萄果实玫瑰香味相关的snp分子标记，本发明提供的特异引物组可用于鉴定 或辅助鉴定葡萄果实玫瑰香味，可用于葡萄果实玫瑰香味品种的筛选，可用于葡萄分 子标记辅助育种，可用于果实具有玫瑰香味葡萄的选育和培育。本发明对于利用分子 标记辅助选择果实具有玫瑰香味的葡萄品种具有重要的理论意义和经济价值。
具体实施方式
30.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.下述实施例中使用的葡萄品种均为公知品种，记载于“张晓利，刘崇怀，刘强， 樊秀彩，张颖，孙磊，牛生洋，姜建福.葡萄果实有机酸组分及其含量特性.食品科 学”等非专利文献中，公众可以从北京市林业果树科学研究院(即申请人处)获得， 以重复本技术实验。
34.实施例1、基于kasp技术开发的用于扩增snp分子标记的引物及其验证
35.本发明基于葡萄果实玫瑰香味相关的snp位点，提供一种kasp引物与反应体系，所述snp位点位于葡萄vvdxs基因上，具体位于seqidno.1第422位核苷酸，该处核苷酸种类为g或t，以字母n表示。将该snp位点命名为vvdxs-422g/t。
36.vvdxs-422g/t的一个等位基因型为gg(即seqidno.1第422位核苷酸为g的纯合型)，该基因型对应的葡萄果实没有玫瑰香味。vvdxs-422g/t的另一种等位基因型为tt(即seqidno.1第422位核苷酸为t的纯合型)，vvdxs-422g/t的第三种等位基因型为gt(即seqidno.1第422位核苷酸为g和t的杂合型)，gt基因型或tt基因型对应的葡萄果实有玫瑰香味。
37.利用kasp标记批量检测北京市林业果树科学研究院葡萄资源圃内的210个葡萄品种，具体步骤如下：
38.设计可用于kasp技术的特异引物：
39.正向引物f1：5
′‑
gaaggtgaccaagttcatgctgagaattacgagaggttgccaag-3
′’
(如seqidno.2所示，其中下划线指示的为fam接头序列)；
40.正向引物f2：正向引物f2：(如seqidno.3所示，其中双下划线指示的为hex接头序列)；
41.反向引物r：5
′‑
ccaattcatgcatcggtccgcc-3
′’
(如seqidno.4所示)。
42.上述seqidno.2与seqidno.4所示的单链dna分子扩增seqidno.1第422位核苷酸为g的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到与fam序列结合的荧光基团的荧光信号；
43.上述seqidno.3与seqidno.4所示的单链dna分子扩增seqidno.1第422位核苷酸为t的片段，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到与hex序列结合的荧光基团的荧光信号。
44.kasp反应在384微孔板中进行(货号04729749001，roche)，pcr反应体系为：总体系3μl，dna模板1μl，浓度为4ng/μl，kaspprimermix1μl，2
×
kaspmastermix1μl；其中所述kaspprimermix中正向引物f1、f2和反向引物r的浓度均为10μm，kaspmastermix(购自lgc公司,www.lgcgroup.com，货号kbs-1016-002)。
45.pcr反应条件见表1：
46.表1
[0047][0048]
[0049]
利用酶标仪或荧光定量pcr仪对parms反应产物进行荧光数据读取，用在线软 件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行荧光信号处理，若显示 只有与fam序列结合的荧光基团的荧光信号，则待测葡萄的vvdxs-422g/t的基因 型为gg(即葡萄基因组中vvdxs-422g/t为g的纯合型，以下简称基因型gg)； 若显示只有与hex序列结合的荧光基团的荧光信号，则待测葡萄的vvdxs-422g/t 的基因型为tt(即葡萄基因组中vvdxs-422g/t为t的纯合型，以下简称基因型 tt)；若显示既有与fam序列结合的荧光基团的荧光信号又有与hex序列结合的荧 光基团的荧光信号，则待测葡萄的vvdxs-422g/t的基因型为gt(即葡萄基因组中 vvdxs-422g/t为g和t的杂合型，以下简称基因型gt)。
[0050]
针对北京市林业果树科学研究院葡萄资源圃内的210个葡萄品种的kasp分型 结果和表型见表2，结果表明其中41个品种是gt或者tt基因型，其中35个有 玫瑰香味，159个品种是gg基因型，全部没有玫瑰香味。说明vvdxs-422g/t基 因型为gt或者tt葡萄品种的果实有玫瑰香味的概率显著高于snp位点 vvdxs-422g/t基因型为gg的葡萄品种。
[0051]
表2
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056][0057]
实施例2、基于kasp技术开发的用于扩增snp分子标记的引物及应用
[0058]
为了进一步证实标记snp位点vvdxs-422g/t可用于葡萄果皮香味性状的选 育，以北京市农林科学院林业果树研究所杂种圃中保存的194个杂种后代(母本是塔 米娜，父本是瑞都无核怡，杂种后代是f1代)植株进行验证，具体如下：
[0059]
1、dna提取
[0060]
选取待测品种的幼嫩叶片，约0.1g，使用新型植物基因组dna提取试剂盒 (aidlab，货号dn15)，用检测dna质量，a260/280介于1.7-1.9之间，将dna稀 释成10ng/l备用。
[0061]
2、基于kasp技术的pcr反应
[0062]
按照lgc公司提供的标准实验流程，整个实验步骤按照genetyping assay,manualpart#15004070进行。kasp反应在384微孔板中进行，反应体系为3μl：dna模板1μl， 浓度为4ng/μl，kasp primer mix 1μl，2
×
kasp mastermix 1μl；其中所述kasp primermix中正向引物f1、f2和反向引物r的浓度均为10μm，kasp mastermix(购自lgc公 司,www.lgcgroup.com，货号kbs-1016-002)。
[0063]
pcr反应条件见表3：
[0064]
表3
[0065]
[0066][0067]
kasp分型结果和表型见表4，其中117个后代基因型为gg，这117个后代都 没有玫瑰香味。77个后代基因型是gt，其中64个有玫瑰香味，13个没有玫瑰香味。 验证了vvdxs-422g/t基因型为gt或者tt葡萄品种的果实有玫瑰香味的概率显著 高于snp位点vvdxs-422g/t基因型为gg的葡萄品种。
[0068]
表4
[0069]
[0070]
[0071]
[0072][0073]
上述结果表明利用该标记在群体中可以有效提高有玫瑰香味株系选出的效率。
[0074]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。