一种环金属铂二甲双胍配合物及其制备方法和应用

1.本发明属于药物化学技术领域。更具体地，涉及一种环金属铂二甲双胍配合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.基于顺铂的临床成功，金属基抗癌药物的开发备受关注。其中具有类平面d8电子排布构型的环金属二价铂配合物，由于具有其辅助配体以及主配体分子结构的修饰可调性，能够获得具有较高细胞摄取率，特定亚细胞器靶向能力、较好的抗肿瘤活性、以及新颖的抗肿瘤机制，同时具有优异光物理化学性质，如较大的斯托克位移，光漂白稳定性，较长的磷光寿命等，具有可作为生物荧光成像分子潜在性质，是一类具有作为构建疾病治疗中新型诊疗一体化分子平台的潜在分子化合物。
3.二甲双胍是为治疗ii型糖尿病的一线药物，研究发现使用二甲双胍也可以抑制肿瘤生长。二甲双胍的抗癌活性与其改变癌细胞代谢的能力有关，通过抑制线粒体呼吸链的复合物ⅰ来靶向癌细胞中的能量产生，激活ampk，降低体内胰岛素的水平。而单独使用二甲双胍作为抗癌药物具有严重的缺点，由于其对于细胞膜的较低渗透性，生物利用度较低，双胍在低剂量条件下对肿瘤细胞无毒，在癌症患者的治疗中，二甲双胍仅在高剂量重复服用时才表现出抗肿瘤的作用，这可能会导致显著的副作用。为了克服这一缺点，研究者们采用了各种策略，据报道环金属化的金与铱以及芳香基钌基团与二甲双胍配位后形成的配合物能够发挥较好的抗肿瘤作用。但目前对于双胍与环金属化的金属铂(ii)配位的配合物及其抗肿瘤活性，以及细胞内的磷光示踪成像尚无相关研究报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种结构式如式ⅰ所示的环金属铂二甲双胍配合物：
5.6.其中，为中的一种。
7.本发明另一目的是提供上述环金属铂二甲双胍配合物的制备方法，方法如下：
8.(1)在惰性气氛、溶剂存在条件下，将四氯铂酸钾与芳香环类化合物混合，130-140℃下回流搅拌反应22～26h，反应完成后冷却至室温，抽滤，固体产物洗涤干燥，得到铂前体；
9.所述四氯铂酸钾与芳香环类化合物的摩尔比为1:1-3；溶剂为乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为2-4:1)；
10.(2)在惰性气氛、溶剂存在条件下，将铂前体、二甲双胍、强碱混合，在30-40℃下反应20～30h，反应完毕后，除去溶剂，柱层析法纯化后，干燥制得环金属铂二甲双胍配合物；
11.所述铂前体、二甲双胍与强碱的摩尔比为1:4:6-10；溶剂是二氯甲烷和甲醇按体积比为1-2:1的比例混合制得，强碱为叔丁醇钾。
12.所述惰性气氛为n2。
13.本发明另一目的是将上述环金属铂二甲双胍配合物应用在制备细胞诊疗成像试剂中，通过聚集诱导发光(aie)实验测试，发现为的配合物具有aie效应。
14.本发明通过实验发现环金属铂二甲双胍配合物能够很好的被肿瘤细胞摄取，且具有良好的抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性不依赖于二甲双胍，且配合物对肿瘤细胞的毒性显著高于顺铂，本发明配合物具有抗肿瘤的应用前景。
15.本发明具有以下有益效果：
16.本发明提供了一类新结构的环金属铂二甲双胍配合物，二甲双胍与金属pt配位之后得到系列具有不同磷光发发射的配合物，由于整体配合物分子结构与电荷的不同，有提高细胞内对双胍生物利用度的潜能；本发明配合物不仅能够快速地被肿瘤细胞摄取，且具有优异的抗肿瘤活性，活性甚至优于顺铂，也能有效诱导肿瘤细胞凋亡；同时在细胞成像与细胞器靶向与定位能力上具有不同的效果，该类配合物具有磷光示踪特性，其中部分化合物具有近红外光发射的特性，部分配合物在体外溶液中具有聚集诱导(aie)产生的双色磷光发射，在细胞内可以双通道磷光示踪成像，其具有在作为细胞诊疗成像试剂中的应用前景；该类配合物的制备方法简单，易操作、成本较低；适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
17.图1是配合物pt1的核磁共振氢谱(1h-nmr，d
6-dmso)图；
18.图2是配合物pt2的核磁共振氢谱(1h-nmr，d
6-dmso)图；
19.图3是配合物pt1的高分辨质谱图；
20.图4是配合物pt2的高分辨质谱图；
21.图5是配合物pt3的高分辨质谱图；
22.图6是配合物pt4的高分辨质谱图；
23.图7是配合物pt5的高分辨质谱图；
24.图8是配合物pt1-pt5在四种不同溶剂中的紫外光谱图，其中a图为h2o，b图为pbs缓冲液、c图为ch2cl2，d图为ch3cn；
25.图9是配合物pt1-pt5在四种不同溶剂中的荧光光谱图，其中a图为h2o，b图为pbs缓冲液、c图为ch2cl2，d图为ch3cn；
26.图10是配合物pt2(a)、pt4(b)在gsh还原性环境中的荧光变化的光谱图；
27.图11是配合物pt1在gsh还原性环境中24h的高分辨质谱图；图中m分别为pt1，l为二甲双胍；
28.图12是配合物pt2(在gsh还原性环境中24h的高分辨质谱图；图中m分别为pt2，l为二甲双胍；
29.图13是配合物pt4在gsh还原性环境中24h的高分辨质谱图；图中m分别为pt4，l为二甲双胍；
30.图14是配合物pt3(a)、pt5(b)在不同浓度的二甲基亚砜水溶液中的聚集诱导发光(aie)的荧光图；
31.图15是配合物pt1的单晶结构图，其中左图为平面单晶图，中图为斜面图，右图为轴向图；
32.图16是配合物pt3(a)、pt5(b)的聚集诱导发光(aie)在细胞中的双通道成像图；比例尺：10μm；
33.图17配合物pt1在肿瘤细胞的摄取与亚细胞器染料的荧光共定位成像图；比例尺：10μm；
34.图18配合物pt4在肿瘤细胞的摄取与亚细胞器染料的荧光共定位成像图；比例尺：10μm；
35.图19是配合物pt2、pt4对a549细胞的诱导细胞凋亡的流式结果分析图。比例尺：10μm。
具体实施方式
36.下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中制备的化合物用核磁共振氢谱、质谱确定化合物的结构；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品，使用的方法如无特殊说明均为常规方法；
37.实施例1：环金属铂二甲双胍配合物pt1的制备
38.1、在n2气氛下，将四氯铂酸钾与2-苯基吡啶按摩尔比1:2.2的比例混合，并溶解在乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为3:1)中，135℃下回流搅拌反应24h，冷却至室温，抽滤，固体产物用超纯水和乙醚分别洗涤3次，80℃真空干燥，得到铂前体；
39.2、将铂前体(76.8mg，0.1mmol)与二甲双胍(66.2mg，0.4mmol)混合，然后在二氯甲烷-甲醇混合溶剂(体积比为1.5:1)中溶解，在n2保护下加入叔丁醇钾(89.8mg，0.8mmol)，35℃进行反应25h，反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂，用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇按体积比10:1混合制得)，80℃真空干燥，即得配合物pt1，产率45.7％；配合物pt1的核磁共振氢谱图见图1，高分辨质谱图见图3；
[0040][0041]
核磁h谱和质谱数据如下：
[0042]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.74(dd,j＝17.9,5.6hz,1h),8.04(m,1h),7.73(d,j＝7.6hz,1h),7.50(d,j＝10.8hz,1h),7.34(d,j＝6.9hz,1h),7.17(t,j＝7.2hz,1h),7.00(d,j＝19.6hz,1h),6.80(s,1h),6.67(s,1h),6.46(s,1h),3.12(d,j＝17.7hz,6h).
[0043]
esi-ms：理论值：m/z＝478.1162[m-cf3so3]
+
；实验值：m/z＝478.1317[m-cf3so3]
+
。
[0044]
实施例2:环金属铂二甲双胍配合物pt2的制备
[0045]
1、在n2气氛下，将四氯铂酸钾与2-(2-噻吩基)吡啶按摩尔比为1:2.5的比例混合后，溶解在乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为2:1)中，130℃下回流搅拌反应22h，冷却至室温，抽滤，固体产物用超纯水和乙醚分别洗涤3次，80℃真空干燥，得到铂前体；
[0046]
2、将铂前体(79.4mg，0.1mmol)与二甲双胍(66.2mg，0.4mmol)混合，然后在二氯甲烷-甲醇混合溶剂(体积比为2:1)中溶解，在n2保护下加入叔丁醇钾(112.2mg，1mmol)，40℃下反应30h，反应完毕后，旋转蒸发除去反应溶剂，用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇按体积比10:1混合制得)，80℃真空干燥，即得配合物pt2，产率56.9％；配合物pt2的核磁共振氢谱图见图2，高分辨质谱图见图4；
[0047][0048]
核磁h谱和质谱数据如下：
[0049]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.58(m,1h),7.94(dt,j＝13.9,7.6hz,1h),7.71(dd,j＝14.6,4.6hz,1h),7.55(dd,j＝19.3,7.9hz,1h),7.29(d,j＝4.6hz,1h),7.14(d,j＝
6.2hz,1h),6.90(s,1h),6.68(s,1h),3.22
–
3.01(m,6h).
[0050]
esi-ms：理论值：m/z＝484.0714[m-cf3so3]
+
；实验值：m/z＝484.0723[m-cf3so3]
+
。
[0051]
实施例3：环金属铂二甲双胍配合物pt3的制备
[0052]
1、在n2气氛下，将四氯铂酸钾与2-苯基喹啉按摩尔比1:2.5的比例混合，然后溶解在乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为2:1)中，130℃下回流搅拌反应22h，冷却至室温，抽滤，固体产物用超纯水和乙醚分别洗涤3次，80℃真空干燥，得到铂前体；
[0053]
2、将铂前体(86.8mg，0.1mmol)与二甲双胍(66.2mg，0.4mmol)混合，然后在二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为2:1)中溶解，在n2保护下加入叔丁醇钾(112.2mg，1mmol)，40℃下反应30h，反应完毕后，旋转蒸发去除溶剂，用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇按体积比10:1混合制得)，80℃真空干燥，即得配合物pt3，产率35.6％；配合物pt3的高分辨质谱图见图5；
[0054][0055]
核磁h谱和质谱数据如下：
[0056]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.63(dt,j＝17.7,8.8hz,2h),8.21(dd,j＝8.7,3.6hz,1h),8.10(dd,j＝14.9,7.9hz,1h),7.93(d,j＝7.4hz,1h),7.84(t,j＝7.8hz,1h),7.66(t,j＝7.4hz,1h),7.24(t,j＝7.3hz,1h),7.21
–
7.15(m,2h),6.87(s,1h),6.76(d,j＝3.8hz,1h),3.17(s,3h),3.03(s,3h).
[0057]
esi-ms：理论值：m/z＝528.1319[m-cf3so3]
+
；实验值：m/z＝528.1471[m-cf3so3]
+
。实施例4：环金属铂二甲双胍配合物pt4的制备
[0058]
1、在n2气氛下，将四氯铂酸钾与2-苄硫基苯喹啉按摩尔比1:3的比例混合，然后溶解在乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为4:1)中，140℃下回流搅拌反应26h，冷却至室温，抽滤，固体产物用超纯水和乙醚分别洗涤3次，80℃真空干燥，得到铂前体；
[0059]
2、将铂前体(101.3mg，0.1mmol)与二甲双胍(66.2mg，0.4mmol)混合后，在二氯甲烷-甲醇混合溶剂(体积比为1:1)中溶解，在n2保护下加入叔丁醇钾(67.3mg，0.6mmol)，30℃下反应30h，反应完毕后，旋转蒸发去除溶剂，用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇按体积比10:1混合制得)，80℃真空干燥，即得配合物pt4，产率34.5％；配合物pt4的高分辨质谱图见图6；
[0060]
[0061]
核磁h谱和质谱数据如下：
[0062]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.42(d,j＝8.7hz,2h),7.99
–
7.93(m,2h),7.92
–
7.87(m,1h),7.77(d,j＝13.6hz,1h),7.57(q,j＝6.7hz,1h),7.34(dt,j＝9.0,4.0hz,2h),6.90(s,1h),3.13(d,j＝7.3hz,6h).
[0063]
esi-ms：理论值：m/z＝584.1040[m-cf3so3]
+
；实验值：m/z＝584.1176[m-cf3so3]
+
。
[0064]
实施例5：环金属铂二甲双胍配合物pt5的制备
[0065]
1、将四氯铂酸钾与(n,n-二苯基-4-(喹啉-2-基)苯胺按摩尔比1:3的比例混合，然后溶解在乙二醇乙醚和超纯水的混合溶剂(体积比为4:1)中，140℃下回流搅拌反应26h，冷却至室温，抽滤，固体产物用超纯水和乙醚分别洗涤3次，80℃真空干燥，得到铂前体；
[0066]
2、将铂前体(120.2mg，0.1mmol)与二甲双胍(66.2mg，0.4mmol)混合，然后在二氯甲烷-甲醇混合溶剂(体积比为1:1)中溶解，在n2保护下加入叔丁醇钾(89.8mg，0.8mmol)，30℃下反应25h，反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂，用硅胶柱层析法纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇按体积比10:1混合制得)，80℃真空干燥，即得所述配合物pt5，产率32.9％；配合物pt5的高分辨质谱图见图7；
[0067][0068]
核磁h谱和质谱数据如下：
[0069]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.59
–
8.50(m,1h),8.29(d,j＝8.7hz,1h),8.11
–
7.99(m,2h),7.90
–
7.74(m,2h),7.62(t,j＝7.6hz,1h),7.45(dt,j＝12.5,7.8hz,1h),7.42
–
7.36(m,2h),7.33(q,j＝8.3hz,2h),7.20
–
7.16(m,2h),7.14(d,j＝7.5hz,1h),7.08(d,j＝5.8hz,2h),7.05(s,1h),6.72
–
6.66(m,1h),3.03(d,j＝12.3hz,6h).
[0070]
esi-ms：理论值：m/z＝695.2054[m-cf3so3]
+
；实验值：m/z＝695.2215[m-cf3so3]
+
。
[0071]
实施例6：环金属铂二甲双胍配合物在不同溶剂下的紫外吸收和荧光发射实验
[0072]
将实施例1-5中合成的配合物pt1-pt5分别称取0.5mg，加入二甲基亚砜配制成浓度20mmol/l的母液，每个母液在4个5ml的离心管分别加入3μl，加入27μl的二甲基亚砜，再分别用h2o、ch3cn、ch2cl2、pbs缓冲液(ph 7.0-7.4)配制成20μmol/l的溶液，然后用紫外分光光度计分别测定紫外吸收，获得紫外吸收光谱，结果见图8，从图中可以看出紫外光谱中的典型吸收峰，配合物pt1显示了250-300nm范围内有较高的吸收峰，属于配体的内部电子跃迁，在360-500nm范围内有较低的吸收峰，属于金属到配体的电子跃迁，即mlct(metal-to-ligand charge transfer)峰；pt2在250-350nm范围内显示着较高的吸收峰，属于配体内部电子跃迁，在360-450nm范围内表现出相对较弱的吸收峰，属于mlct跃迁；pt3在250-320nm处表现出强带，属于配体内跃迁，而在360-450nm处表现出相对较弱的带，属于mlct跃迁，pt2、pt3的吸收相对于pt1产生了一定的红移；pt4在250-350nm范围内显示着较高的吸收峰，属于配体内部电子跃迁，而在400-500nm范围内表现出相对较弱的吸收峰，属于mlct
跃迁；pt5在250-330nm范围内显示着较高的吸收峰，属于配体内部电子跃迁，而在420-500nm范围内表现出相对较弱的吸收峰，属于mlct跃迁，pt4、pt5的吸收相对于pt2、pt3也产生了一定的红移。
[0073]
将不同溶剂配制的溶液在不同激发光下用荧光分光光度计测定荧光发射光谱，结果见图9，从图中可以看出pt1在360nm激发下，在所有溶剂中均具有505
±
20nm绿色荧光发射，pt2在400nm激发下，在所有溶剂中均具有570
±
20nm橙色荧光发射，pt3在400nm激发下，在所有溶剂中均具有580
±
20nm橙色荧光发射，pt2、pt3相对于pt1发生明显的红移荧光峰，pt4在450nm激发下，具有670
±
20nm红色荧光发射，pt5在410nm激发下，在所有溶剂中均具有610
±
20nm橙色荧光发射，而pt4、pt5相对于pt2、pt3的荧光峰又发生了明显的红移。
[0074]
实施例7：配合物在体外gsh还原性环境中的荧光变化和在gsh还原性环境中的高分辨质谱图
[0075]
将实施例2、4中合成的配合物pt2、pt4分别称取0.5mg，加入二甲基亚砜配制成20mmol/l的母液，每种母液分别取3μl加入2个5ml的离心管中，加入27μl的二甲基亚砜，再分别用h2o配制成20μmol/l的溶液(3ml)，滴加入100mmol/l的gsh的水溶液0.1ml，用荧光光度计测定pt2在20min内的荧光变化，以及pt4在10min内的荧光变化，如图10所示，在还原性水溶液中，配体双胍的离去会导致配合物在溶液中的荧光强度下降，结果表明pt2在gsh还原性环境中的荧光强度在20min内下降了71.2％，pt4在gsh还原性环境中的荧光强度在10min内减少了74.4％，可知pt4中二甲双胍解离的速率大于pt2。
[0076]
将实施例1、2、4中合成的配合物pt1、pt2、pt4分别称取0.5mg，加入二甲基亚砜配制成20mmol/l的母液，每种母液分别取1μl加入2个5ml的离心管中，加入9μl的二甲基亚砜，再分别用h2o配制成20μmol/l的溶液(1ml)，滴加入20mmol/l的gsh的水溶液2μl，避光放置24h后，将水溶液用微孔过滤膜过滤到3ml棕色小瓶中，用lc-ms测出各自的高分辨质谱。
[0077]
结果见图11-13，从图中可以看出配合物会受到还原性物质gsh的影响释放二甲双胍，二甲双胍和gsh形成加合物。
[0078]
实施例8：配合物pt3、pt5的聚集诱导发光(aie)测试
[0079]
分别称取0.8mg的配合物pt3、pt5，加入dmso，配制成100mmol/l的母液，取3μl的到离心管中，加入27μl的二甲基亚砜，再分别向离心管中加入h2o:dmso体积比为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、99％的溶剂(3ml)配制成100μmol/l的溶液，在400nm激发下，配合物pt3在良溶剂dmso中的发绿色荧光(em＝485
±
20nm)伴随着不良溶剂h2o体积比增加，逐渐红移至580
±
20nm处橙色荧光发射；pt5配合物在495
±
20nm发射的绿色荧光，伴随着不良溶剂h2o体积比的增加，荧光峰逐渐红移610
±
20nm处，具有橙色荧光发射，双色荧光通道变化荧光光谱见图14，表明配合物pt3、pt5在体外溶液中具有aie效应。
[0080]
实施例9：配合物pt1的单晶结构表征
[0081]
称取3mg的配合物pt1，溶解于1ml三种不同溶剂(ch2cl2、ch3cn、ch3oh)中，超声使其溶解完全，然后使用微孔过滤膜过滤后加入5ml小烧杯中，用封口膜密封并用细针戳两个孔，烧杯放入含乙醚的封口罐中，使乙醚缓慢挥发入小烧杯中，72h后培养出pt1单晶，通过x射线单晶衍射仪对所得单晶进行结构解析，如图15所示，结果表明其相邻距离最近两个分子之间pt与pt原子的距离为且与pt原子配位的cn、nn原子形成平面之间的二面角几乎为0，单个晶体的中各个双胍的原子与ppy配体的原子几乎在同一平面上。
[0082]
实施例10：环金属铂二甲双胍配合物的抗肿瘤活性测定
[0083]
以实施例1、2、3、4、5制备得到的环金属铂二甲双胍配合物pt1-pt5为实验组，以二甲双胍、顺铂为对照组，分别测定上述化合物对受试肿瘤细胞hela(人宫颈癌细胞株)、a549(人肺癌细胞株)、hlf(人胚肺成纤维细胞)的细胞毒性，具体测定方法如下：
[0084]
采用四唑盐(mtt)比色法测定，将受试肿瘤细胞分别用胰酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行计数，调整细胞浓度为5
×
104/ml，接种于96孔板，每孔160μl，培养24h后，再加入不同浓度的药物(配合物pt1-pt5、二甲双胍或顺铂)，置于含有5％co2的培养箱中培养，于37℃下孵育48h，于孵育结束前4h加入mtt 20μl/孔；4h后弃上清液，加入dmso 150μl/孔，振动5min后用酶标仪测定od值，波长设置为595nm；
[0085]
计算受试肿瘤细胞的存活率，同时作图并求出ic
50
值，评价环金属铂二甲双胍配合物的抗肿瘤活性。
[0086]
实施例1-5的环金属铂二甲双胍配合物对hela(人宫颈癌细胞株)、a549(人肺癌细胞株)、hlf(人胚肺成纤维细胞)的ic
50
值如表1所示，可以看出，单独二甲双胍在200μmol/l的浓度下仍然对肿瘤细胞无毒性，铂前体与溶剂乙腈配位的ptcn在50μmol/l的浓度下也对肿瘤细胞无毒性，而在与环金属铂配位后得到的系列配合物pt1-pt5均具有较好的抗肿瘤活性，且对hela细胞的毒性分别比顺铂增加了(1.5，5.2，12.5，60，15.6)倍，且pt4的抗肿瘤效果最好，该系列配合物对正常细胞hlf的毒性相对于肿瘤细胞较低；
[0087]
表1本发明制备得到的环金属铂二甲双胍配合物对肿瘤细胞的ic
50
值
[0088][0089]
结果说明：本发明环金属铂二甲双胍配合物pt1-pt5均具有良好的抗肿瘤活性。
[0090]
实施例11：配合物pt3、pt5的聚集诱导发光(aie)在细胞中的双通道成像
[0091]
通过激光共聚焦显微镜拍摄配合物pt3、pt5在肿瘤细胞中的双通道成像情况，具体实验方法和结果如下：
[0092]
准备2个干净、灭菌的激光共聚焦培养皿，将生长状态良好的hela(人宫颈癌细胞株)用胰酶消化下来，传代于激光共聚焦培养皿中，用含有5％co2的培养箱37℃培养，当hela细胞密度培养至70％时，加入配合物pt3、pt5，最终药物孵育细胞的浓度为20μmol/l，
继续培养10-15min，然后去除培养基，用pbs洗涤两次，立刻用激光共聚焦显微镜观察，采用405nm激发，对配合物pt3、pt5分别测定485
±
20nm(绿光)、580
±
20nm(橙色)双通道荧光成像情况，结果见图16，pt3、pt5在细胞中具有绿色荧光和橙色荧光的成像，表明配合物pt3、pt5在细胞中具有aie效应。
[0093]
实施例12：配合物pt1、pt4在肿瘤细胞中的摄取与定位情况
[0094]
通过激光共聚焦显微镜拍摄配合物pt1、pt4在肿瘤细胞中的摄取与定位情况，具体实验方法和结果如下：
[0095]
将生长状态良好的hela(人宫颈癌细胞株)用胰酶消化下来，接种于共聚焦培养皿中，用含有5％co2的培养箱37℃培养，当hela细胞的密度培养至70％时，分别加入配合物pt1、pt4，最终药物孵育细胞的浓度为20μmol/l，继续培养10-15min，按200nmol/l的比例添加亚细胞器荧光染料[溶酶体绿色荧光染料(ex＝504nm，em＝511nm
±
20nm)，线粒体绿色荧光染料(ex＝490nm，em＝516
±
20nm)，内质网蓝色染料(ex＝374nm，em＝430
±
20nm)]进行染色，孵育10-15min后去除培养基，用pbs洗涤两次，立刻用激光共聚焦显微镜观察，结果见图17、18，结果显示配合物pt1的绿色荧光与内质网商业染料的红色荧光有较好的共定位，能够很好地定位于内质网；配合物pt4的红色荧光与线粒体商业染料的绿色荧光有较好的共定位，能够很好地定位于线粒体。
[0096]
实施例13：配合物pt2、pt4的抗肿瘤作用研究
[0097]
通过流式细胞仪测定配合物pt2、pt4诱导a549细胞凋亡能力，具体实验方法和结果如下：
[0098]
取生长状态良好的a549细胞用胰酶消化下来，用dmem培养基稀释成单细胞悬液，接种于corning六孔板中，每个孔200μl，于37℃下培养24h后，分别加入浓度为5μmol/l、10μmol/l和15μmol/l的配合物pt2以及浓度为6μmol/l、1.2μmol/l和2μmol/l的配合物pt4进行细胞凋亡刺激，孵育24h后，用胰酶消化并收集细胞，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞，然后加入5μl annexin v-fitc和10μl碘化丙啶(pi)染色液，轻轻混匀；于室温下避光孵育10～20min，随后置于冰浴中，并用铝箔进行避光。之后用流式细胞仪进行检测。
[0099]
配合物pt2、pt4对a549细胞的诱导细胞凋亡能力的影响结果如图19所示，可以看出，经过不同浓度配合物pt2、pt4处理后，a549细胞凋亡的比例随着配合物pt2、pt4浓度的增大而逐渐升高，与空白对照相比，pt2处理过后细胞早期凋亡的比例由45.2％增加到54.6％，晚期凋亡的比例由27.6％增加至43.8％，pt4处理过后细胞早期凋亡的比例由60.5％增加到72.0％，晚期凋亡的比例由14.6％增加至16.5％。
[0100]
以上结果表明：本发明配合物pt2、pt4能够显著诱导肿瘤细胞凋亡，具有有效诱导a549细胞发生凋亡的能力。