1.本发明涉及药物制剂技术领域，更具体涉及一种自他克莫司菌株制备他克莫司的方法。
背景技术：
2.他克莫司又名fk－506(tacrolimus)，是从筑波链霉菌代谢产物中提取的一种大环内酯类免疫抑制剂。在分子水平，他克莫司利用与细胞性蛋白质 (fkbp12)相结合，而在细胞内蓄积产生效用。fkbp12－他克莫司复合物会专一性地结合以及抑制calcinurin，其会抑制t细胞中所产生钙离子依赖型讯息传导路径作用，因此防止不连续性淋巴因子基因的转录。他克莫司具有高度免疫抑制，其活性在体外及体内实验中都已被证实。他克莫司抑制形成主要移植排斥作用之细胞毒性淋巴球的生成；抑制t细胞的活化作用以及t辅助细胞依赖b细胞的增生作用；也能抑制如白介素－2、白介素－3及γ－干扰素等淋巴因子的生成与白介素－2受体的表达。在分子水平，他克莫司的效应似乎是由结合到细胞性蛋白质(fkbp)所产生，此蛋白质也会造成该化合物累积在细胞间。在体内试验中，他克莫司显示出对肝脏及肾脏移植有效。
3.现有技术中利用他克莫司菌株制备他克莫司的过程复杂，且他克莫司发酵产量较低，现有技术中采用的吸附材料不能够循环利用，增加了生产成本。
技术实现要素：
4.为了解决上述问题，本发明提供了一种工艺简单、提高发酵产量、吸附树脂可循环利用且降低生产成本的自他克莫司菌株制备他克莫司的方法。
5.根据本发明的一个方面，一种自他克莫司菌株制备他克莫司的方法，包括以下步骤：
6.步骤(1)、一级种子制备：投料，将培养基送至罐面，液碱调ph，进行实罐消毒，一级种子培养基灭菌28－34分钟，冷却至27－29℃开始接种；
7.步骤(2)、二级种子制备：按投料总量放水定位，边搅拌边投料，培养基调ph，用泵打至二级种子罐内，进行实罐消毒，二级种子培养基灭菌28－34 分钟，冷却至27－29℃移入一级种子；
8.步骤(3)、发酵培养：按投料总量放水定位，边搅拌边投料，培养基调 ph，用泵打至发酵罐内，进行实罐消毒，发酵培养基灭菌28－34分钟冷却至27－29℃一级种子即可移入；
9.步骤(4)、预处理：发酵液压滤至板框，用饮用水顶洗滤饼，粉碎后装入药用低密度聚乙烯袋，用于提取；
10.步骤(5)、抽提：按滤饼：乙醇＝1kg：2－3l(w/v)，投入抽提罐抽提；
11.步骤(6)、抽滤：开启真空泵，将抽提菌液排放至抽滤桶抽滤，结束后用滤饼量35％－50％体积的乙醇进行顶洗，他克莫司提取液储存于抽滤液浓缩罐中；
12.步骤(7)、陶瓷膜过滤：将抽滤液浓缩罐中他克莫司提取液放至中转桶准确计量体
积，再排至陶瓷膜料桶内，开启陶瓷膜，将陶瓷膜滤液收集至中转桶，过滤至料桶内剩余10－30l他克莫司提取液结束，用8－20l的乙醇进行顶洗2－3次，将中转桶中的他克莫司滤液转移至抽滤液浓缩罐中；
13.步骤(8)、浓缩：在浓缩罐中进行减压浓缩，浓缩至滤液显现浑浊，浓缩完成；
14.步骤(9)、大孔树脂吸附：浓缩液通过大孔吸附树脂吸附，树脂吸附量为每升树脂吸附他克莫司15－30克，流速为每小时2倍柱体积，上柱结束后，用去离子水洗涤吸附有他克莫司的树脂，水洗量为柱体积的2－4倍，流速为每小时1－3倍柱体积；
15.步骤(10)、乙醇解析：树脂水洗后用2－3倍柱体积的30％乙醇预洗，预洗流速为每小时1－2倍柱体积，预洗结束用80－95％的乙醇进行解析；
16.步骤(11)、脱色浓缩：解析液用活性碳滤芯脱色，脱色液减压浓缩，浓缩压力≤－0.06mpa，浓缩至回收瓶中无液体流出后停止浓缩；
17.步骤(12)、萃取：按脱色浓缩液：乙酸乙酯＝1：1(v/v)加入乙酸乙酯萃取，同时加氯化钠助萃取分层，取上层乙酯相加入无水硫酸镁脱水，脱水后的乙酯相过滤，滤液浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后停止浓缩，得到他克莫司乙酯浓缩物；
18.步骤(13)、正相分离：硅胶作为固定相，乙酸乙酯为流动相，进行柱层析，收集主峰段，将收集段进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出，加入浓缩液5－10倍体积的正己烷，搅拌10－20min室温静置结晶4－8h，过滤得到他克莫司粗提物；
19.步骤(14)、q5纯化：按硅胶填料：乙酸乙酯＝1kg：1.5－2.0l(m/v)匀浆完成后装柱，装柱后用含有无水甲醇的乙酸乙酯溶液作流动相，将粗提物用 200－500ml流动相溶解进样，收集主峰段作为分离液，分离液混合均匀后送检，将合格的他克莫司分离液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后取出旋蒸瓶中淡黄色晶体；
20.步骤(15)、c18纯化：按c18填料：异丙醇＝1：2.1－2.2(m/v)匀浆完成后装柱，装柱后用乙腈水溶液作流动相，按实际分离情况调整收集主峰，纯化液混合均匀后送检，将合格的他克莫司纯化液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后，室温结晶4－10h，过滤得到析出晶体，将晶体放入真空干燥箱中干燥8－16h得到他克莫司粗品；
21.步骤(16)、重结晶：将粗品按他克莫司粗品在丙酮中溶解，溶解后的样品经过滤芯过滤进入结晶罐，向结晶罐中匀速滴加纯化水，滴加速度控制在 1－3小时内完成，0－10℃搅拌结束后静置析晶1－2天，过滤析出晶体，并用 2－3倍晶体量的纯化水洗涤晶体2－3遍，得到白色结晶固体；
22.步骤(17)、干燥：将重结晶的固体放入真空干燥箱中，干燥至水分＜4％，得到成品固体。
23.在一些实施方式中，步骤(1)中的接种量控制在3－5％，培养2－3天。
24.在一些实施方式中，步骤(2)中接种量控制在7％－9％，培养1－2天，确认种子生长符合质量要求后，再用蒸汽对移种管道灭菌40－60min。
25.在一些实施方式中，步骤(3)中接种量控制在9％－15％，培养4－9天，确认种子生长符合质量要求后，再用蒸汽对移种管道灭菌40－60min。
26.在一些实施方式中，步骤(10)中解析速度为每小时0.5－1倍柱体积，解析至0.5－1倍柱体积后开始收集，解析3倍bv后停止解析。
27.在一些实施方式中，步骤(14)中含有无水甲醇的乙酸乙酯溶液流动相中含有45－
55％无水甲醇。
28.在一些实施方式中，步骤(15)中所述的乙腈水溶液含有55－65％乙腈。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：工艺简单、提高发酵产量、吸附树脂可循环利用且降低生产成本。在本发明中，将他克莫司菌株经过培养后得到的发酵液经过提取纯化处理，并用丙酮重结晶得到他克莫司，质量可靠、收率高达75％以上，适于工业化规模生产药用级他克莫司原料的生产；同时利用大孔树脂进行吸附，吸附材料能够循环利用，有效地降低生产成本。
具体实施方式
30.下面结合所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
31.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解所述术语的具体含义。
32.本发明所述的一种自他克莫司菌株制备他克莫司的方法，包括以下步骤：
33.步骤(1)、一级种子制备：投料，将培养基送至罐面，液碱调ph，进行实罐消毒，一级种子培养基灭菌28－34分钟，冷却至27－29℃开始接种；
34.步骤(2)、二级种子制备：按投料总量放水定位，边搅拌边投料，培养基调ph，用泵打至二级种子罐内，进行实罐消毒，二级种子培养基灭菌28－34 分钟，冷却至27－29℃移入一级种子；
35.步骤(3)、发酵培养：按投料总量放水定位，边搅拌边投料，培养基调 ph，用泵打至发酵罐内，进行实罐消毒，发酵培养基灭菌28－34分钟冷却至 27－29℃一级种子即可移入；
36.步骤(4)、预处理：发酵液压滤至板框，用饮用水顶洗滤饼，粉碎后装入药用低密度聚乙烯袋，用于提取；
37.步骤(5)、抽提：按滤饼：乙醇＝1kg：2－3l(w/v)，投入抽提罐抽提；
38.步骤(6)、抽滤：开启真空泵，将抽提菌液排放至抽滤桶抽滤，结束后用滤饼量35％－50％体积的乙醇进行顶洗，他克莫司提取液储存于抽滤液浓缩罐中；
39.步骤(7)、陶瓷膜过滤：将抽滤液浓缩罐中他克莫司提取液放至中转桶准确计量体积，再排至陶瓷膜料桶内，开启陶瓷膜，将陶瓷膜滤液收集至中转桶，过滤至料桶内剩余10－30l他克莫司提取液结束，用8－20l的乙醇进行顶洗2－3次，将中转桶中的他克莫司滤液转移至抽滤液浓缩罐中；
40.步骤(8)、浓缩：在浓缩罐中进行减压浓缩，浓缩至滤液显现浑浊，浓缩完成；
41.步骤(9)、大孔树脂吸附：浓缩液通过大孔吸附树脂吸附，树脂吸附量为每升树脂吸附他克莫司15－30克，流速为每小时2倍柱体积，上柱结束后，用去离子水洗涤吸附有他克莫司的树脂，水洗量为柱体积的2－4倍，流速为每小时1－3倍柱体积；
42.步骤(10)、乙醇解析：树脂水洗后用2－3倍柱体积的30％乙醇预洗，预洗流速为每
小时1－2倍柱体积，预洗结束用80－95％的乙醇进行解析；
43.步骤(11)、脱色浓缩：解析液用活性碳滤芯脱色，脱色液减压浓缩，浓缩压力≤－0.06mpa，浓缩至回收瓶中无液体流出后停止浓缩；
44.步骤(12)、萃取：按脱色浓缩液：乙酸乙酯＝1：1(v/v)加入乙酸乙酯萃取，同时加氯化钠助萃取分层，取上层乙酯相加入无水硫酸镁脱水，脱水后的乙酯相过滤，滤液浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后停止浓缩，得到他克莫司乙酯浓缩物；
45.步骤(13)、正相分离：硅胶作为固定相，乙酸乙酯为流动相，进行柱层析，收集主峰段，将收集段进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出，加入浓缩液5－10倍体积的正己烷，搅拌10－20min室温静置结晶4－8h，过滤得到他克莫司粗提物；
46.步骤(14)、q5纯化：按硅胶填料：乙酸乙酯＝1kg：1.5－2.0l(m/v)匀浆完成后装柱，装柱后用含有无水甲醇的乙酸乙酯溶液作流动相，将粗提物用 200－500ml流动相溶解进样，收集主峰段作为分离液，分离液混合均匀后送检，将合格的他克莫司分离液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后取出旋蒸瓶中淡黄色晶体；
47.步骤(15)、c18纯化：按c18填料：异丙醇＝1：2.1－2.2(m/v)匀浆完成后装柱，装柱后用乙腈水溶液作流动相，按实际分离情况调整收集主峰，纯化液混合均匀后送检，将合格的他克莫司纯化液用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至回收瓶中无液体流出后，室温结晶4－10h，过滤得到析出晶体，将晶体放入真空干燥箱中干燥8－16h得到他克莫司粗品；
48.步骤(16)、重结晶：将粗品按他克莫司粗品在丙酮中溶解，溶解后的样品经过滤芯过滤进入结晶罐，向结晶罐中匀速滴加纯化水，滴加速度控制在 1－3小时内完成，0－10℃搅拌结束后静置析晶1－2天，过滤析出晶体，并用 2－3倍晶体量的纯化水洗涤晶体2－3遍，得到白色结晶固体；
49.步骤(17)、干燥：将重结晶的固体放入真空干燥箱中，干燥至水分＜4％，得到成品固体。
50.步骤(1)中的接种量控制在3－5％，培养2－3天。其中一级种子制备的投料组分为药用糊精1.0、葡萄糖0.5、甘油1.0、酵母抽提物0.5、玉米浆粉0.25、碳酸钙0.1。
51.步骤(2)中接种量控制在7％－9％，培养1－2天，确认种子生长符合质量要求后，再用蒸汽对移种管道灭菌40－60min。二级种子制备的投料组分为药用糊精1.0、葡萄糖0.5、甘油1.0、酵母抽提物0.5、玉米浆粉0.25、碳酸钙0.1。
52.步骤(3)中接种量控制在9％－15％，培养4－9天，确认种子生长符合质量要求后，再用蒸汽对移种管道灭菌40－60min。发酵培养的投料组分为药用糊精7.0、干酵母1.0、玉米浆粉0.5、磷酸氢二钾0.2、磷酸二氢钾0.2、酵母抽提物0.5、异亮氨酸1.0、碳酸钙0.2。
53.步骤(4)中预处理，需要利用草酸调节发酵液ph至4.0－5.0。
54.步骤(5)中抽提需要将滤饼和乙醇投入抽提罐中，搅拌2－4h后再进行抽提。
55.在步骤(6)中抽滤结束后，用滤饼量30％－50％体积的乙醇进行顶洗。
56.在步骤(7)中陶瓷膜过滤，采用无机陶瓷膜，无机陶瓷膜具有优良的热稳定性与孔稳定性能，不但强度高、且耐化学腐蚀，清洗再生性能好，兼备有高效过滤与精密过滤的双重优点。
57.在步骤(8)中浓缩压力≤－0.06mpa，浓缩温度不高于60℃。
58.在步骤(10)中解析速度为每小时0.5－1倍柱体积，解析至0.5－1倍柱体积后开始
收集，解析3倍bv后停止解析。
59.在步骤(14)中含有无水甲醇的乙酸乙酯溶液流动相中含有45－55％无水甲醇。
60.在步骤(15)中所述的乙腈水溶液含有55－65％乙腈。
61.在步骤(16)中粗品溶解条件，他克莫司粗品：丙酮＝300g：7000ml.
62.在步骤(17)中干燥温度30－40℃，真空度≤－0.06mpa，真空干燥时间 12－48h。
63.按照上述方法制得的他克莫司成品固体经hplc检测，其纯度为99.26％。
64.以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。