一种鉴定中国华北区日本瘤姬蜂的分子方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定中国华北区日本瘤姬蜂的分子方法。


背景技术：

2.现阶段，最有效的、准确的生物多样性及物种鉴定方法是传统形态分类学鉴定。但是传统形态分类学基于生物的形态学特征、生活史及其生物学特性等进行物种鉴定，费时费力，且对标本的保存完整性及专业水平要求较高，还可能受主观因素影响，错误鉴定(schindel和miller，2005)。dna条形码是物种基因组内一段特定的dna片段序列，具有稳定变异、易扩增等特点，能够有效弥补传统分类学的不足(gere等，2013；魏明峰等，2019)。利用dna条形码技术对非成虫虫态实蝇类害虫的快速鉴定，能够明确实蝇类害虫的寄主范围(张晓曼等，2017)。
3.鳞翅目昆虫种类繁多，是仅次于鞘翅目的第2个目。绝大多数幼虫危害植物，取食叶片、植物内部组织，或钻蛀枝干。例如，美国白蛾(hyphantria cunea)是一种入侵害虫，隶属于鳞翅目、灯蛾科。它食性复杂，寄主植物涉及49科108属175种，主要危害果树(苹果树等)、行道树(柳树、杨树、白桦等)、观赏树等。该虫以幼虫群集结网的形式，取食叶片。3天内，整株叶片被吃成光杆，造成了巨大的经济损失(孟香芹等，2020)。甜菜夜蛾(spodoptera exigua)属鳞翅目、夜蛾科，具有适应性强，繁殖量大等特点。根据2019年龙口市诸由观镇、兰高镇、徐福街道、黄山馆镇等一些葡萄产区调查发现(赵严港等，2020)：当年新载葡萄植株被害柱率高达75％以上；1-2年生的葡萄植株被害株率为30％-50％；2年生及以上的葡萄园中葡萄植株被害株率为5％-10％。
4.日本瘤姬蜂(pimpla nipponica)属于姬蜂科(ichneumonidae)、黑瘤姬蜂属(pimpla sp.)，寄主广泛，可同时寄生粉蝶科pieridae、灯蛾科arctiidae、夜蛾科noctuidae、螟蛾科pyralidae、小卷蛾科olethreutidae、卷蛾科tortricidae、麦蛾科gelechiidae、巢蛾科yponomeutidae、细蛾科gracilariidae等昆虫(takatoshi u等，1994)。生物学实验结果显示，卵到成虫的发育历期为15.4
±
1.5天，雄虫寿命为24.4
±
11.9天，雌虫寿命为36.7
±
15.3天。
5.日本瘤姬蜂是群寄生。雌虫能够识别被寄生的寄主，并再次寄生。在有利环境下，雌性选择寄主范围，表现偏好性，且后代存活率和适应度高。在不利条件下，雌寄主也能够接受质量较低的寄主，提高自己的适合度，抵制不良环境。日本瘤姬蜂(pimpla nipponica)具有寄主多种多样、适应性强等特点，是大多数鳞翅目害虫预蛹和蛹的寄主，对鳞翅目昆虫的绿色防控具有重大意义。
6.姬蜂属种类繁多，分布广泛，全世界已知约40,000种，且可供识别的特征不显著，许多种形态学上差异不大，同一物种也存在形态学的变异，这些都导致姬蜂形态学鉴定不易。因此，寻找鉴定姬蜂属种类的方法成为该研究热点。


技术实现要素：

7.本发明一个目的是提供一种dna分子。
8.本发明提供的dna分子，其是如下1)-2)中任一种的dna分子：
9.1)编码区包括序列表中序列1所示的dna分子；
10.2)编码区为序列表中序列1所示的dna分子。
11.上述dna分子编码的蛋白也是本发明保护的范围。
12.上述蛋白为如下(1)或(2)：
13.(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
14.(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
15.上述dna分子或上述蛋白作为靶标在鉴定或辅助鉴定来源于中国的日本瘤姬蜂中的应用也是本发明保护的范围。
16.上述dna分子或上述蛋白作为靶标在区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和其他姬蜂属姬蜂中的应用也是本发明保护的范围。
17.上述dna分子或上述蛋白作为靶标在区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和来源于韩国的日本瘤姬蜂中的应用也是本发明保护的范围。
18.检测上述dna分子的物质在如下任一中的应用也是本发明保护的范围：
19.1)鉴定或辅助鉴定来源于中国的日本瘤姬蜂；
20.2)区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和其他姬蜂属姬蜂；
21.3)区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和来源于韩国的日本瘤姬蜂；
22.4)制备鉴定或辅助鉴定来源于中国的日本瘤姬蜂产品；
23.5)制备区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和其他姬蜂属姬蜂产品；
24.6)制备区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和来源于韩国的日本瘤姬蜂产品。
25.上述应用中，所述物质为如下1)或2)：
26.1)用于直接测序的物质；
27.2)扩增上述dna分子的引物对或含有引物对的试剂或试剂盒。
28.本发明另一个目的是提供如下方法。
29.本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定来源于中国的日本瘤姬蜂的方法，包括如下步骤：检测待测蜂中是否含有上述dna分子，若含有，则所述待测蜂为或候选为来源于中国的日本瘤姬蜂，若不含有，则所述待测蜂不为或候选不为来源于中国的日本瘤姬蜂。
30.或，本发明提供了一种区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和其他姬蜂属姬蜂的方法，包括如下步骤：检测待测蜂中是否含有上述dna分子，若含有，则所述待测蜂为或候选为来源于中国的日本瘤姬蜂，若不含有，则所述待测蜂为或候选为其他姬蜂属姬蜂。
31.或，本发明提供了一种区分或辅助区分来源于中国的日本瘤姬蜂和来源于韩国的日本瘤姬蜂的方法，包括如下步骤：检测待测蜂中是否含有上述dna分子，若含有，则所述待测蜂为或候选为来源于中国的日本瘤姬蜂，若不含有，则所述待测蜂为或候选为来源于韩国的日本瘤姬蜂。
32.上述来源于中国的日本瘤姬蜂为来源于中国华北区的日本瘤姬蜂，在本发明的实
chemical ecology,2012,38:253-261。
43.花胫蚜蝇姬蜂记载在如下文献中，在文献中的名称为diplazon latatorius。丁冬荪,罗俊根,孙淑萍.江西省姬蜂昆虫资源.江西林业科技,2009,5:25-30。
44.下面实施例中的中国华北的日本瘤姬蜂样本来自石家庄鹿泉区和邯郸市滏东区(2018年和2019年)，已经过形态学鉴定为日本瘤姬蜂。
45.实施例1、日本瘤姬蜂的线粒体coi基因的获得
46.1、dna提取
47.提取选取保存完整的来源于中国华北石家庄鹿泉区2只日本瘤姬蜂样本和来源于邯郸市滏东区的1只日本瘤姬蜂样本，利用北京艾瑞克有限公司动物全基因组提取试剂盒，进行单头dna提取。基因组dna的浓度和质量采用nanodrop spectrophotometer(ds-11envivx)检测，基因组dna的完整性采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。
48.2、线粒体coi基因片段的扩增
49.以上述1的基因组dna为模板，用如下通用引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
50.上述线粒体coi基因片段的pcr扩增采用通用引物，
51.上游引物lco1490：ggtcaacaaatcataaagatattgg；
52.下游引物hco2198：taaacttcagggtgaccaaaaatca。
53.pcr扩增体系为25μl：
[0054]2×
taq pcr mastermix(康为世纪，https://www.cwbio.com)，2
×
taq plus mastermix(商品货号：cw2849)12.5μl；上下游引物各1.0μl(10μm)；
[0055]
ddh2o 8.5μl；
[0056]
dna模板2.0μl。
[0057]
pcr反应程序为：
[0058]
94℃预变性2min，94℃变性30s
→
50℃退火30s
→
72℃延伸1min
→
35次pcr循环，最后72℃延伸10min。
[0059]
9μl产物用于1％的琼脂糖凝胶电泳检测，选取清晰，明亮条带的pcr产物送于北京擎科生物技术有限公司进行正反向测序。
[0060]
结果，所有来源于中国华北的日本瘤姬蜂的pcr产物均具有序列表中序列1所示的核苷酸，该序列即为658bp的日本瘤姬蜂(pimpla nipponica)线粒体coi基因序列。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列2，该蛋白命名为coi蛋白。
[0061]
将该序列1与ncbi数据库核酸序列比对，与pimpla sp.相似度高达94％，结果是可信的。
[0062]
将该序列1与ncbi数据库其它姬蜂属其它种的coi核酸序列比对，结果如图1所示，其中，pn代表：pimpla nipponica，pn-ku753343.1代表：pimpla nipponica，pa-km996724代表：pimpla aequalis，pa-jn294278代表：pimpla aequalis，pa-km996536代表：pimpla annulipes，pa-kj166512代表：pimpla annulipes，ps-kf604468代表：pimpla sodalis，pa-kr788532代表：pimpla annulipes，pa-kr800220代表：pimpla aequalis，ps-jn300239代表：pimpla stricklandi，pn-kr801924代表：pimpla nuda，相似度达到91.29％，结果可信。
[0063]
将该序列1与ncbi数据库中姬蜂属韩国种群coi基因序列(pn-kr801924)比较情况，结果如图2所示，p.nipponica-korea代表韩国日本瘤姬蜂；p.nipponica-china代表中
国华北区日本瘤姬蜂；可以看出，韩国日本瘤姬蜂与本研究所测序列相似性比对结果，序列差异较大(80.84％)。表明，本发明序列1所示的基因为来源于中国华北的日本瘤姬蜂的特异序列。
[0064]
从上述可以看出，序列1所示的coi基因为来源于中国华北的日本瘤姬蜂的特异序列，其可以用于区分中国华北的日本瘤姬蜂和姬蜂属其它种，具体检测方法如下：
[0065]
提取待测姬蜂的基因组dna，用上游引物lco1490和下游引物hco2198进行pcr扩增，测序检测pcr扩增产物，若待测姬蜂的pcr扩增产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，则该待测姬蜂为或候选为中国华北的日本瘤姬蜂，若待测姬蜂的pcr扩增产物不具有序列表中序列1所示的核苷酸，则该待测姬蜂不为或候选不为中国华北的日本瘤姬蜂。
[0066]
序列1所示的coi基因为来源于中国华北的日本瘤姬蜂的特异序列，其可以用于区分中国华北的日本瘤姬蜂和韩国日本瘤姬蜂，具体检测方法如下：
[0067]
其可以用于区分中国华北的日本瘤姬蜂和韩国日本瘤姬蜂，具体检测方法如下：
[0068]
提取待测姬蜂的基因组dna，用上游引物lco1490和下游引物hco2198进行pcr扩增，测序检测pcr扩增产物，若待测姬蜂的pcr扩增产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，则该待测姬蜂为或候选为中国华北的日本瘤姬蜂，若待测姬蜂的pcr扩增产物不具有序列表中序列1所示的核苷酸，则该待测姬蜂为或候选为韩国日本瘤姬蜂。
[0069]
实施例2、线粒体coi基因在鉴定日本瘤姬蜂中的应用
[0070]
1、提取基因组dna
[0071]
提取3只来源于石家庄鹿泉区和邯郸市滏东区(2018年和2019年)的日本瘤姬蜂(pimpla nipponica)、3只舞毒蛾瘤姬蜂(pimpla disparis)、3只花胫蚜蝇姬蜂(diplazon latatorius)的基因组dna。
[0072]
2、线粒体coi基因的扩增
[0073]
分别以上述基因组dna为模板，用如下通用引物按照实施例1的方式进行扩增：
[0074]
上游引物lco1490：ggtcaacaaatcataaagatattgg；
[0075]
下游引物hco2198：taaacttcagggtgaccaaaaatca。
[0076]
得到pcr扩增产物。
[0077]
测序不同蜂的pcr扩增产物。
[0078]
结果如下：
[0079]
3只日本瘤姬蜂的测序结果均为序列1；
[0080]
3只舞毒蛾瘤姬蜂的测序结果均为序列3；
[0081]
3只花胫蚜蝇姬蜂的测序结果均为序列4。
[0082]
经过比对，结果如图3所示，序列1与序列3和序列4相差很大，表明序列1能够特征区分中国华北的日本瘤姬蜂。