用于细胞扩增培养的3D水凝胶的制备方法及其产品和应用

用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法及其产品和应用
技术领域
1.本发明涉及生物材料领域，具体涉及用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法，还涉及制得的3d水凝胶和应用。


背景技术：

2.干细胞，包括胚胎干细胞、诱导多功能干细胞和间充质干细胞等干细胞已在癌症、老年疾病、神经系统疾病等各种疾病的治疗中显示出巨大的潜力和卓越的治疗效果。然而，直接移植干细胞进入损伤或疾病部位不是由于缺乏支持细胞活动的3d结构导致细胞保留时间低。为了解决这个问题，已经开发了多种水凝胶系统以提供用于保护移植细胞的3d生长支架和增强细胞功能。目前，常见的用于培养干细胞的3d支架大都由3d生物打印的策略制备而成。虽然3d打印水凝胶能够得到复杂的网络结构并实现对干细胞的三维培养，但是由于3d打印水凝胶存在较大的网络空间结构，使得活细胞在生物材料中的分布并不能完全真实地模拟自然细胞微环境增强细胞-细胞或细胞-基质相互作用，且不能实现营养液的快速扩散。鉴于传统3d水凝胶系统的关键问题，一种具有高度生物相容性且能实现细胞营养液有效扩散的3d生物相容性水凝胶对于促进干细胞增殖和增强细胞功能具有重要的意义。然而，3d生物打印的一个重要挑战是促进细胞的增殖，特别是在缺乏营养的环境中。虽然修饰具有生物活性分子可以赋予水凝胶一定的生物相容性，但是复杂的修饰过程及化学试剂的使用通常会导致不良的副作用从而影响干细胞的增殖。因此，设计新的3d水凝胶体系改善细胞营养液的扩散，促进干细胞的增殖，仍然是干细胞研发领域的关键问题。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法，本发明结合天然生物大分子明胶(gel)和具有高持水性和高透气性的三维网状结构细菌纤维素构建了新型的3d水凝胶干细胞培养系统；本发明的目的之二在于提供由所述用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法制得的用于细胞扩增培养的3d水凝胶，制备的3d水凝胶能够形成很多“孔道”促进细胞营养液的快速扩散，分子内存有大量的亲水基团能够保持较高的透水性和持水性且根据条件的不同可吸收比自身干重大数十倍至数百倍的水分，此外还具有良好的透气性为细胞的增殖提供了良好的三维微环境，该3d水凝胶干细胞培养系统不仅具有良好的生物相容性还具有一定的体外和体内生物降解性；本发明的目的之三在于提供用于细胞扩增培养的3d水凝胶在细胞三维扩增培养中的应用。
4.为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
5.1、用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
6.1)将甲基丙烯酸酐化明胶与光引发剂和细菌纤维素混合形成混合液；
7.2)将步骤1)的混合液置于0～8℃下20-120min使gelma发生物理交联；
8.3)将步骤2)的产物在紫外光照射使混合物中的gelma交联固化，冷冻干燥，得到具有细胞扩增培养的3d水凝胶。
9.本发明优选的，步骤(1)的混合液中所述甲基丙烯酸酐化明胶的质量分数为1～5％。
10.本发明优选的，步骤(1)的混合液中所述光引发剂质量分数计为1～3％。
11.本发明优选的，步骤(1)中，甲基丙烯酸酐化明胶与细菌纤维素的质量比为2：1～1：10。
12.本发明优选的，所述光引发剂选自但不限于irgacure 2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂lap。
13.2、由所述用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法制得的用于细胞扩增培养的3d水凝胶。
14.3、所述用于细胞扩增培养的3d水凝胶在细胞三维扩增培养中的应用。
15.本发明的有益效果在于：本发明公开了用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备方法，以gelma和细菌纤维素为原料，gelma具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)序列，类似于细胞外基质，非常有利于细胞的增殖、迁移和分化；gelma具有生物相容性好，细菌纤维素具有高持水性和高透气性特点，制得具有三维网络状的3d水凝胶培养体系，三维网状结构能够使3d水凝胶培养系统中形成很多“孔道”促进细胞营养液的快速扩散，含有的大量亲水基团能够保持较高的透水性和持水性可以储存大量细胞营养液为细胞实时提供营养物质，此外还具有良好的透气性为细胞的高效扩增提供了良好的三维微环境。突出显示了该3d水凝胶培养体系对于细胞(特别是干细胞)的扩增培养具有重要的作用，在临床上癌症、老年疾病、神经系统疾病等各种疾病的治疗中显示出巨大的应用潜力。
附图说明
16.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
17.图1为3d水凝胶形貌图。
18.图2为3d水凝胶培养细胞后的荧光显微镜图(a：未培养细胞组；b：细胞培养组)。
19.图3为细胞核染色共聚焦显微镜图(a：细胞培养24小时；b：细胞培养72小时)。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
21.实施例1、一种用于细胞扩增培养的3d水凝胶的制备
22.构建用于细胞扩增培养3d水凝胶的方法，具体步骤如下：
23.(1)首先，用明胶和甲基丙烯酸酐合成gelma，冷冻干燥后在0～-20℃下保存；
24.(2)将步骤(1)制备的gelma配制成质量分数为1～5％的溶液；
25.(3)在gelma溶液中加入光引发剂和细菌纤维素，光引发剂加入后终浓度以质量分数计为1～3％，细菌纤维素按gelma与细菌纤维素的质量比为2：1～1：10加入；
26.(4)将步骤(3)的混合物置于0～8℃冰箱20-120min使gelma发生物理交联；
27.(5)用紫外光照射使混合物中的gelma交联固化，进一步进行冻干得到具有三维网络结构的细胞培养系统，即用于细胞扩增培养的3d水凝胶。
28.本实施例中，光引发剂选自但不限于irgacure 2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂lap。
29.3d水凝胶形貌图如图1所示。
30.实施例2、三维网络结构的细胞培养系统在干细胞三维扩增培养中的应用
31.实验前，将3d水凝胶培养系统置于细胞培养皿中进行消毒处理后，在生物安全柜内进行细胞的接种操作，接种的细胞a549密度为3-5ml 1
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105个/ml，接种后将该3d水凝胶培养系统置于细胞培养箱内培养24～72h；同时以未接种细胞的三维扩增培养基为对照，荧光显微镜观察结果如图2所示。由图2可知，细胞株在3d水凝胶培养系统中贴附生长。待细胞在三维网状结构的水凝胶中完成贴附生长和扩增后，对该细胞培养体系进行细胞核染色实验，并通过共聚焦显微镜观察细胞的三维生长状态，结果如图3所示。结果显示，细胞株在3d水凝胶培养系统能够扩增。
32.综上所述，细胞扩增培养3d水凝胶可以通过上述构建方法1得到，该构建方法简单、操作性强且成本低；此外通过细胞核染色法发现细胞在该3d水凝胶体系中的维持了较好的三维生长状态且有效实现了细胞的扩增培养。与传统的3d生物打印水凝胶相比，本发明结合生物相容性好的明胶和具有三维网络结构、高持水性和高透气性的细菌纤维素开发新型3d水凝胶培养体系，有效实现细胞营养液的快速扩散和对三维生长细胞的扩增培养。
33.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。