载脂蛋白C3(APOC3)iRNA组合物及其使用方法与流程

载脂蛋白c3(apoc3)irna组合物及其使用方法
1.相关申请
2.本技术主张享有于2021年2月2日递交的美国临时申请第 63/144,516号及于2020年2月18日递交的美国临时申请第62/977,875 号的优先权权益。前述每个申请的全部内容通过引用并入本文。
3.序列表
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背景技术：

5.载脂蛋白c3(apoc3)是一种极低密度脂蛋白(vldl)，并且是脂蛋白代谢的重要调节剂。在人体内，apoc3由apoc3基因编码，该基因与apoa1及apoa4基因一起位于11号染色体长臂上的基因簇中。 apoc3作为一种99个氨基酸的小蛋白质在肝脏中表达并且在肠中以较低程度表达。在去除内质网中的20个氨基酸的信号肽的后，形成79 个氨基酸的成熟apoc3蛋白，其可能以非糖基化或糖基化的同种型存在。
6.apoc3的主要功能是通过对内皮结合脂蛋白脂肪酶(lpl)的非竞争性抑制作为脂肪分解的调节剂。lpl水解富含三酰基甘油(甘油三酯) 的脂蛋白(trl)中的三酰基甘油，将脂肪酸释放到血浆中，并且将富含三酰基甘油的大颗粒转化为较小的缺乏三酰基甘油的残余脂蛋白。缺乏 apoc3的个体具有低trl水平，同时伴有三酰基甘油的高效脂肪分解。此外，其中通过基因敲除apoc3基因的小鼠显示出了低血浆三酰基甘油水平以及有效的trl分解代谢。apoc3还抑制肝脂肪酶(hl)，这是一种在肝脏中合成的具有三酰基甘油脂肪酶和磷脂酶a1活性的脂肪分解酶。apoc3对hl的抑制效应进一步降低了肝脏对trl残余物的脂肪分解和摄入。apoc3还被证明能够刺激极低密度脂蛋白(vldl) 的合成。据信，与apoc3的这一作用相关的潜在机制可能与抑制蛋白酶体介导的apob降解有关，导致apob的合成和分泌增加，并且导致vldl三酰基甘油的合成增加。因此，apoc3可能在调节肝脏的 vldl输出中起关键作用。
7.细胞研究报告称，apoc3可能会干扰trl和残余物与肝脂蛋白受体的结合。apoc3可通过掩蔽或改变apob及apoe的构象而消除 apob和apoe介导的脂蛋白与低密度脂蛋白受体(ldlr)的结合。 apoc3还显著抑制乳糜微粒及vldl颗粒与脂肪分解刺激型受体 (lsr)的结合。
8.apoc3水平的增加诱导了高甘油三酯血症或甘油三酯的高(超) 血液水平(血症)的发展。甘油三酯水平升高与多种疾病相关，包括心血管疾病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压和皮肤病变(黄瘤)。极高的甘油三酯水平也会增加急性胰腺炎的风险。因此，调节apoc3代谢是管理高甘油三酯血症及相关疾病的重要治疗方法。
9.因此，本领域中需要用于治疗载脂蛋白c3相关病症诸如高甘油三酯血症的apoc3
960064.1、ad-960031.1、 ad-960063.1、ad-960293.1、ad-960288.1、ad-960445.1、 ad-960292.1、ad-960475.1、ad-960442.1、ad-960470.1、 ad-960436.1、ad-960446.1、ad-960474.1、ad-960294.1、 ad-960443.1、ad-80794.7和ad-959910.1。
17.另一方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsrna)，其用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达，其中，该dsrna包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸232至254、239至261、242至264、244至266、258至280、 264至286、268至290、429至451、430至450、430至452、433至 455、434至456、435至457、500至522、503至525、507至529和 510至532中任一核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少 15个连续核苷酸，并且该反义链包含来自seq id no：2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
18.在一个实施方案中，该反义链包含与选自由下列所组成的组的双链体的任一反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少 15个连续核苷酸：ad-80794.8、ad-959907.2、ad-959914.2、 ad-959916.2、ad-959932.2、ad-960314.2、ad-959941.2、 ad-960030.2、ad-960062.2、ad-960064.2、ad-960065.2、 ad-960066.2、ad-960294.2、ad-960471.2、ad-960474.2、ad-960478.2 和ad-960481.2。
19.一方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsrna)，其用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达，其中，该dsrna包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸429-455或504-532中的任一核苷酸序列相异不超过0、1、2或 3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，且该反义链包含来自seq id no： 2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
20.另一方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsrna)，其用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达，其中，该dsrna包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸429至451、430至452、431至451、432至452、433至455、 434至452、504至526和506至526的任一核苷酸序列相异不超过0、 1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且，该反义链包含来自 seq id no：2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
21.在一个实施方案中，该反义链包含与选自由下列所组成的组的双链体的任一反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少 15个连续核苷酸：ad-960030、ad-960064、ad-1143243、ad-1143245、 ad-1143247、ad-1143249、ad-1143256、ad-1143260、ad-1143278、 ad-1143287、ad-1143295、ad-1143299、ad-1143302和ad-1143305。
22.在一个实施方案中，该反义链包含与双链体ad-1143278或 ad-960064的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
23.在一个实施方案中，该反义链包含与seq id no：1的核苷酸429 至456的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
24.在一个实施方案中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸433 至455的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
25.在一个实施方案中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸434 至452的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
26.在一个实施方案中，该反义链包含与双链体ad-1143243的反义链核苷酸序列相异
不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
27.在一个实施方案中，该dsrna剂包含至少一个经修饰的核苷酸。
28.在一个实施方案中，该有义链的基本全部核苷酸包含修饰；该反义链的基本全部核苷酸包含修饰；或者该有义链的基本全部核苷酸和该反义链的基本全部核苷酸包含修饰。
29.在一个实施方案中，该有义链的全部核苷酸包含修饰；该反义链的全部核苷酸包含修饰；或者该有义链的全部核苷酸和该反义链的全部核苷酸包含修饰。
30.在一个实施方案中，至少一个所述经修饰的核苷酸选自由下列所组成的组：脱氧-核苷酸、3
′‑
端脱氧胸腺嘧啶(dt)核苷酸、2
′‑
o-甲基修饰核苷酸、2
′‑
氟基修饰核苷酸、2
′‑
脱氧修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2
′‑
氨基修饰核苷酸、2
′‑
o-烯丙基修饰核苷酸、2
′‑
c-烷基修饰核苷酸、2
′‑
羟基修饰核苷酸、2
′‑
甲氧基乙基修饰核苷酸、2
′‑
o-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢哌喃修饰核苷酸、1,5
‑ꢀ
脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包含硫代磷酸基团的核苷酸、包含甲基膦酸基团的核苷酸、包含5
′‑
磷酸的核苷酸、包含5
′‑
磷酸模拟物的核苷酸、热不稳定的核苷酸、二醇修饰核苷酸(gna)、及 2-o-(n-甲基乙酰胺)修饰核苷酸；及其组合。
31.在一个实施方案中，所述核苷酸上的修饰选自由下列所组成的组：lna、hna、cena、2
′‑
甲氧基乙基、2
′‑
o-烷基、2
′‑
o-烯丙基、2
′‑c‑ꢀ
烯丙基、2
′‑
氟基、2
′‑
脱氧、2
′‑
羟基和二醇；及其组合。
32.在一个实施方案中，至少一个该经修饰的核苷酸选自由下列所组成的组：脱氧-核苷酸、2
′‑
o-甲基修饰核苷酸、2
′‑
氟基修饰核苷酸、2
′‑ꢀ
脱氧修饰核苷酸、二醇修饰核苷酸(gna)(例如，ggn、cgn、tgn或agn)、以及乙烯基-膦酸核苷酸；及其组合。
33.在另一实施方案中，该核苷酸上的至少一个修饰是热不稳定的核苷酸修饰。
34.在一个实施方案中，热不稳定的核苷酸修饰选自由下列所组成的组：无碱基修饰；双链体中与相对核苷酸的错配；以及不稳定的糖修饰、 2
′‑
脱氧修饰、无环核苷酸、未锁核酸(una)、及甘油核酸(gna)。
35.所述双链区域的长度可为19至30个核苷酸对；19至25个核苷酸对；19至23个核苷酸对；23至27个核苷酸对；或21至23个核苷酸对。
36.在一个实施方案中，每条链的长度独立地为不超过30个核苷酸。
37.在一个实施方案中，有义链的长度为21个核苷酸，以及反义链的长度为23个核苷酸。
38.该互补性区域的长度可为至少17个核苷酸；19至23个核苷酸；或19个核苷酸。
39.在一个实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3
′
突出。在另一实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3
′
突出。
40.在一个实施方案中，该dsrna剂还包含配体。
41.在一个实施方案中，该配体与该dsrna剂的有义链的3
′
端缀合。
42.在一个实施方案中，该配体是n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。
43.在一个实施方案中，该配体是通过一价、二价或三价分支接头所附接的一个或多个galnac衍生物。
44.在一个实施方案中，该配体是
[0045][0046]
在一个实施方案中，该dsrna剂如以下示意图所示缀合到配体
[0047]
并且，其中，x是o或s。
[0048]
在一个实施方案中，x是o。
[0049]
在一个实施方案中，该dsrna剂还包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
[0050]
在一个实施方案中，该硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链(例如，反义链或有义链)的3
′‑
末端。
[0051]
在另一实施方案中，该硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链(例如，反义链或有义链)的5
′‑
末端。
[0052]
在一个实施方案中，硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链的5
′‑
末端及3
′‑
末端两端。在一个实施方案中，该链是反义链。
[0053]
在一个实施方案中，位于该双链体的反义链的5
′‑
端的第1位的碱基对是au碱基对。
[0054]
一方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsrna)，其用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达，其中，该dsrna包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸434-452的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少 15个连续核苷酸，且该反义链包含来自seq id no：2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，其中，该有义链的基本全部核苷酸及该反义链的基本全部核苷酸包含选自由2
′‑
o-甲基修饰、2
′‑
氟基修饰及脱氧-修饰所组成的组的修饰，其中，该有义链和反义链两者还独立
地包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合，并且其中，至少一条链缀合至配体。
[0055]
在一个实施方案中，该有义链的全部核苷酸及该反义链的全部核苷酸包含选自由2
′‑
o-甲基修饰、2
′‑
氟基修饰及2
′‑
脱氧-修饰所组成的组的修饰。
[0056]
在一个实施方案中，该有义链包含2至6个，例如，2、3、4、5 或6个2
′‑
氟基修饰核苷酸。在另一实施方案中，该有义链包含不超过6 个，例如，0、1、2、3、4、5或6个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0057]
在一个实施方案中，该有义链包含不超过2个，例如，0、1或2 个2
′‑
脱氧-修饰核苷酸。
[0058]
在一个实施方案中，该反义链包含不超过4个，例如，0、1、2、 3或4个2
′‑
脱氧-修饰核苷酸。
[0059]
在一个实施方案中，该反义链包含不超过5个，例如，0、1、2、 3、4或5个2
′‑
脱氧-修饰核苷酸。在另一实施方案中，该反义链包含1 至5个，例如，0、1、2、3、4或5个脱氧-核苷酸。
[0060]
在一个实施方案中，该有义链包含4个2
′‑
氟基修饰核苷酸，例如自5
′
端起计数的核苷酸7及9至11，并且该反义链包含2个2
′‑
氟基修饰核苷酸，例如自5
′
端起计数的核苷酸14及16，以及3个2
′‑
脱氧修饰核苷酸，例如自5
′
端起计数的核苷酸2、5和7。
[0061]
在一个实施方案中，该硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链(例如，反义链或有义链)的3
′‑
末端。
[0062]
在另一实施方案中，该硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链(例如，反义链或有义链)的5
′‑
末端。
[0063]
在一个实施方案中，该硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链的5
′‑
末端和3
′‑
末端两端。在一个实施方案中，该链是反义链。
[0064]
在一个实施方案中，该有义链包含两个位于5
′
末端的硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
[0065]
在一个实施方案中，该反义链包含两个位于5
′
末端的硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
[0066]
在另一实施方案中，该反义链包含两个位于5
′
末端和3
′
末端两端的硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
[0067]
在一个实施方案中，该有义链包含位于5
′
末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合，并且该反义链包含位于5
′
末端和3
′
末端两端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
[0068]
在一个实施方案中，配体缀合至有义链。
[0069]
在一个实施方案中，配体缀合至有义链的3
′
端。
[0070]
在一个实施方案中，配体是n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。
[0071]
在一个实施方案中，配体是通过一价、二价或三价分支接头所附接的一个或多个galnac衍生物。
[0072]
在一个实施方案中，该配体是
[0073][0074]
在一个实施方案中，该dsrna剂如以下示意图所示缀合到配体
[0075]
并且，其中，x是o或s。
[0076]
在一个实施方案中，x是o。
[0077]
在一个实施方案中，该有义链包含与 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucua-3
′
(seq id no：13)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少17个连续核苷酸。
[0078]
在一个实施方案中，该有义链包含与5
′‑
cuuaaaagggacaguauucua-3
′
(seq id no：13)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
[0079]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucua-3
′
(seq id no：13)的核苷酸序列。
[0080]
在一个实施方案中，该反义链包含与 5
′‑
uagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：14)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少17个连续核苷酸。
[0081]
在一个实施方案中，该反义链包含与5
′‑
uagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：14)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
[0082]
在一个实施方案中，该反义链包含与 5
′‑
uagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：14)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少21个连续核苷酸。
[0083]
在一个实施方案中，该反义链包含 5
′‑
uagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：14)的核苷酸序列。
[0084]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucua-3
′
(seq id no：13)的核苷酸序列，并且该反义链包含5
′‑
uagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seqid no：14)的核苷酸序列。
[0085]
在一个实施方案中，该有义链与核苷酸序列 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)相异不超过3个例如0、1、2或3个经修饰的核苷酸，其中，a、g、c及u分别是2
′‑o‑ꢀ
甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、 cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；并且s 是硫代磷酸酯键。
[0086]
在一个实施方案中，该反义链与 5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)相异不超过 3个例如0、1、2或3个经修饰的核苷酸，其中，a、g、c及u分别是 2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、 gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da 是2`-脱氧腺苷-3`-磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0087]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)的核苷酸序列，并且该反义链包含5-usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq idno：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、 2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑ꢀ
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2`-脱氧腺苷-3`-磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0088]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucual96-3
′
(seq id no：17)的核苷酸序列，并且该反义链包含5-usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seqid no：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2`-脱氧腺苷-3`
‑ꢀ
磷酸核苷酸；s是硫代磷酸酯键；并且l96是n-[三(galnac-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯氨醇。
[0089]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)，并且该反义链包含5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、 2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑ꢀ
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2`-脱氧腺苷-3`-磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键；其中，该有义链的3
′
端如以下示意图所示缀合到配体：
[0090][0091]
并且，其中，x是o。
[0092]
在一个实施方案中，该有义链包含与 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucuu-3
′
(seq id no：48)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少17个连续核苷酸。
[0093]
在一个实施方案中，该有义链包含与 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucuu-3
′
(seq id no：48)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
[0094]
在一个实施方案中，该有义链包含 5
′‑
cuuaaaagggacaguauucuu-3
′
(seq id no：48)的核苷酸序列。
[0095]
在一个实施方案中，该反义链包含与 5
′‑
aagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：315)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少17个连续核苷酸。
[0096]
在一个实施方案中，该反义链包含与5
′‑ꢀ
aagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：315)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少19个连续核苷酸。
[0097]
在一个实施方案中，该反义链包含与5
′‑ꢀ
aagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：315)的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少21个连续核苷酸。
[0098]
在一个实施方案中，该反义链包含 5
′‑
aagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seq id no：315)的核苷酸序列。
[0099]
在一个实施方案中，该有义链包含5
′‑
cuuaaaagggacaguauucuu-3
′
(seq id no：48)的核苷酸序列，并且该反义链包含5
′‑
aagaauacugucccuuuuaagcc-3
′
(seqid no：315)的核苷酸序列。
[0100]
在一个实施方案中，有义链与5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucuu-3
′ꢀ
(seq id no：377)的核苷酸序列相异不超过3个例如0、1、2或3个经修饰的核苷酸，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑o‑ꢀ
甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基 a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；并且s是硫代磷酸酯键。
[0101]
在一个实施方案中，反义链与 5
′‑
asdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：866)的核苷酸序列相异不超过3个例如0、1、2或3个经修饰的核苷酸，其中，a、g、 c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑o‑ꢀ
甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及 2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0102]
在一个实施方案中，有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucuu-3
′
(seq id no：377)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
asdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq idno：866)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑ꢀ
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0103]
在一个实施方案中，有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucuul96-3
′
(seq id no：377)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
asdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq idno：866)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑ꢀ
磷酸核苷酸；s是硫代磷酸酯键；并且l96是n-[三(galnac-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯氨醇。
[0104]
在一个实施方案中，有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucuu-3
′
(seq id no：377)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
asdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：866)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da
no：350)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
ascfsugagfaafufacugufccfcuuuusasa-3
′
(seq idno：351)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；并且s是硫代磷酸酯键。
[0118]
在一个实施方案中，有义链包含 5
′‑
asasaagggfacfafgfuauucucagul96
ꢀ‑3′
(seq id no：350)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
ascfsugagfaafufacugufccfcuuuusasa-3
′
(seq idno：351)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf 分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；s是硫代磷酸酯键；并且l96是n-[三(galnac-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯氨醇。
[0119]
在一个实施方案中，有义链包含 5
′‑
asasaagggfacfafgfuauucucagu-3
′
(seq id no：350)的核苷酸序列，并且反义链包含5
′‑
ascfsugagfaafufacugufccfcuuuusasa-3
′
(seq id no：351)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；并且s是硫代磷酸酯键，其中有义链的3
′
端如以下示意图所示缀合到配体：
[0120][0121]
并且，其中，x是o。
[0122]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中，该dsrna包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸429至456的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少 15个连续核苷酸，并且该反义链包含来自seq id no：2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，其中，该有义链的基本全部核苷酸及该反义链的基本全部核苷酸包含选自由2
′‑
o-甲基修饰、2
′‑
氟基修饰及脱氧-修饰所组成的组的修饰，其中该有义链及该反义链两者还独立地包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合，并且，其中，至少一条链缀合至配体。
[0123]
在一个实施方案中，该有义链包含2至6个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0124]
在一个实施方案中，该反义链包含不超过4个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0125]
在一个实施方案中，该反义链包含1至5个脱氧-修饰核苷酸。
[0126]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含与seq id no：1的核苷酸序列的核苷酸429至456的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少
15个连续核苷酸，并且该反义链包含来自seq id no：2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，其中，该有义链的全部核苷酸及该反义链的全部核苷酸包含选自由2
′‑
o-甲基修饰、2
′‑
氟基修饰及脱氧-修饰所组成的组的修饰，其中该有义链及该反义链两者还独立地包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合，并且，其中，至少一条链缀合至配体。
[0127]
在一个实施方案中，该有义链包含2至6个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0128]
在一个实施方案中，该有义链包含4个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0129]
在一个实施方案中，该反义链包含2至4个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0130]
在一个实施方案中，该反义链包含2个2
′‑
氟基修饰核苷酸。
[0131]
在一个实施方案中，该反义链包含1至5个2
′‑
脱氧-修饰核苷酸。
[0132]
在一个实施方案中，该反义链包含3个2
′‑
脱氧-修饰核苷酸。
[0133]
在一个实施方案中，该有义链包含位于自5
′
端起计数的核苷酸7及9至11处的4个2
′‑
氟基修饰核苷酸，并且该反义链包含位于自 5
′
端起计数的核苷酸14及16处的2个2
′‑
氟基修饰核苷酸以及位于自 5
′
端起计数的核苷酸2、5及7处的3个2
′‑
脱氧修饰核苷酸。
[0134]
在一个实施方案中，该有义链包含位于5
′
末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
[0135]
在一个实施方案中，该反义链包含位于5
′
末端和3
′
端两处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
[0136]
在一个实施方案中，该有义链包含位于5
′
末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合，并且该反义链包含位于 5
′
末端和3
′
末端两处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。
[0137]
在一个实施方案中，该配体与该有义链的3
′
端缀合。
[0138]
在一个实施方案中，该配体是n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。
[0139]
在一个实施方案中，该配体是通过一价、二价或三价分支接头所附接的一个或多个galnac衍生物。
[0140]
在一个实施方案中，该配体是
[0141][0142]
在一个实施方案中，该dsrna剂如以下示意图所示缀合到配体
[0143][0144]
并且，其中，x是o。
[0145]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链与5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′ꢀ
(seq id no：15)的核苷酸序列相异不超过3个经修饰的核苷酸，并且其中，该反义链与5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq idno：16)的核苷酸序列相异不超过3个经修饰的核苷酸，其中，a、g、 c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑o‑ꢀ
甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及 2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0146]
在一个实施方案中，该有义链与 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)的核苷酸序列相异不超过2个经修饰的核苷酸，并且，其中，该反义链与5
′‑ꢀ
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列相异不超过2个经修饰的核苷酸。
[0147]
在一个实施方案中，该有义链与 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)的核苷酸序列相异不超过1个经修饰的核苷酸，并且其中，该反义链与 5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列相异不超过1个经修饰的核苷酸。
[0148]
在一个实施方案中，该dsrna剂如以下示意图所示缀合到配体
[0149][0150]
并且，其中，x是o。
[0151]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸
(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′ꢀ
(seq id no：15)的核苷酸序列，并且该反义链包含 5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑o‑ꢀ
甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、 2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键。
[0152]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucual96-3
′
(seq id no：17)的核苷酸序列，并且该反义链包含5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seqid no：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome) a、2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑ꢀ
磷酸核苷酸；s是硫代磷酸酯键；并且l96是n-[三(galnac-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯氨醇。
[0153]
另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链包含 5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′
(seq id no：15)的核苷酸序列，并且该反义链包含5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、 2
′‑
o-甲基g、2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑ꢀ
氟基a、2
′‑
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键；并且其中，该有义链的3
′
端如以下示意图所示缀合到配体：
[0154]
其中，x是o。
[0155]
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中载脂蛋白c3的表达的双链核糖核酸(dsrna)剂，其中，该dsrna剂包含形成双链区域的有义链和反义链，其中，该有义链由5
′‑
csusuaaaafggfgfafcaguauucua-3
′ꢀ
(seq id no：15)的核苷酸序列组成，并且该反义链由 5
′‑
usdasgadaudacugucccfuufuuaagscsc-3
′
(seq id no：16)的核苷酸序列组成，其中，a、g、c及u分别是2
′‑
o-甲基(2
′‑
ome)a、2
′‑
o-甲基g、 2
′‑
o-甲基c及2
′‑
o-甲基u；af、gf、cf及uf分别是2
′‑
氟基a、2
′‑ꢀ
氟基g、2
′‑
氟基c及2
′‑
氟基u；da是2
′‑
脱氧腺苷-3
′‑
磷酸核苷酸；并且s是硫代磷酸酯键；并且其中，该有义链的3
′
端如以下示意图所示缀合到配体：
[0156]
其中，x是o。
[0157]
本发明还提供了含有本发明的任何dsrna剂的细胞及包含本发明的任何dsrna剂的药物组合物。
[0158]
本发明的药物组合物可包括在非缓冲溶液中(例如盐水或水中)的dsrna剂，或者本发明的药物组合物可包括在缓冲溶液中的 dsrna剂，该缓冲溶液是例如包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白(prolamine)、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
[0159]
一方面，本发明提供了抑制细胞中载脂蛋白c3(apoc3)基因的表达的方法。该方法包括使细胞与本发明的任何dsrna或本发明的任何药物组合物接触，从而抑制细胞中apoc3基因的表达。
[0160]
在一个实施方案中，细胞位于受试者体内，该受试者是，例如人类受试者，例如患有载脂蛋白c3相关病症例如选自由下列所组成的组的载脂蛋白c3相关病症的受试者：高甘油三脂血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2 型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎。
[0161]
在一个实施方案中，使所述细胞与所述dsrna剂接触以将 apoc3的表达抑制至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0162]
在一个实施方案中，抑制载脂蛋白c3的表达使该受试者的血清中的apoc3蛋白质水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％或 95％。
[0163]
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于载脂蛋白c3表达降低的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的任何dsrna或本发明的任何药物组合物，从而治疗患有将受益于 apoc3表达降低的病症的受试者。
[0164]
另一方面，本发明提供了预防患有将受益于载脂蛋白c3 (apoc3)表达降低的病症的受试者的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量的本发明的任何dsrna或本发明的任何药物组合物，从而预防患有将受益于apoc3表达降低的病症的受试者的至少一种症状。
[0165]
在一个实施方案中，该病症是载脂蛋白c3相关病症，例如，载脂蛋白c3相关病症选自由下列所组成的组：高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎。
[0166]
在一个实施方案中，载脂蛋白c3相关病症是高甘油三酯血症。
[0167]
在一实施方案中，受试者是人。
[0168]
在一实施方案中，将dsrna剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg 的剂量施用给该受试者。
[0169]
在一个实施方案中，将dsrna剂经皮下施用给受试者。
[0170]
在一个实施方案中，本发明的方法还包括测定来自该受试者的一个或多个样本中的载脂蛋白c3的水平。
[0171]
在一个实施方案中，所述一个或多个受试者样本中的载脂蛋白c3的水平是指一个或多个血液或血清样本中的载脂蛋白c3蛋白质水平。
[0172]
在某些实施方案中，本发明的方法还包括将额外治疗剂施用给受试者。在一个实施方案中，该额外治疗剂是靶向pcsk9的dsrna 剂，例如，因利斯然(inclisiran)。在一个实施方案中，该额外治疗剂是 pcsk9抑制剂。在一个实施方案中，该pcsk9抑制剂是抗pcsk9单克隆抗体，例如依洛尤单抗(evolocumab)及阿利库单抗 (alirocumab)。在另一实施方案中，该pcsk9抑制剂是靶向 pcsk9的dsrna剂，例如，因利斯然。在又一实施方案中，该额外治疗剂选自由下列所组成的组：hmg-coa还原酶抑制剂、贝特类 (fibrate)、胆酸螯合剂、烟酸、抗血小板剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素ii受体拮抗剂、乙酰辅酶a胆固醇乙酰转移酶(acat)抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(cetp)抑制剂、微粒体甘油三酯转移蛋白(mttp)抑制剂、胆固醇调节剂、胆酸调节剂、过氧化物酶体增殖激活受体(ppar)激动剂、基因疗法、复合血管保护剂、糖蛋白 ilb/iiia抑制剂、阿斯匹林或类阿斯匹林化合物、ibat抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、单核细胞趋化蛋白(mcp)-i抑制剂、或鱼油。
[0173]
本发明还提供了一种试剂盒，其包含本发明的任何dsrna及本发明的任何药物组合物以及任选的使用说明书。
附图说明
[0174]
图1是显示经皮下施用单次3mg/kg剂量的所示dsrna双链体的小鼠(每组n＝3)体内，在给药后第14天，人apoc3 mrna水平的图。人apoc3 mrna水平以相对于用pbs治疗的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
[0175]
图2是显示经皮下施用单次3mg/kg剂量的所示dsrna双链体的小鼠(每组n＝3)体内，在给药后第14天，人apoc3 mrna水平的图。人apoc3 mrna水平以相对于用pbs治疗的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
[0176]
图3是显示经皮下施用单次3mg/kg剂量的所示dsrna双链体的小鼠(每组n＝3)体内，在给药后第14天，人apoc3 mrna水平的图。人apoc3 mrna水平以相对使用pbs治疗的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
具体实施方式
[0177]
本发明提供了irna组合物，其影响编码载脂蛋白c3(apoc3) 的基因的rna转录物的rna诱导沉默复合体(risc)所介导的裂解。该基因可在细胞内，例如在受试者(如人类受试者)的细胞内。此类irna 的使用使得在哺乳动物体内对应基因(载脂蛋白c3基因)的mrna的靶向降解成为可能。
[0178]
本发明的irna已被设计为靶向人载脂蛋白c3基因，包括在其他哺乳动物物种的载脂蛋白c3同源物中保守的基因部分。不受限于理论，据信，前述特性与此类irna中的具体靶标位点或具体修饰的组合或子组合赋予了本发明的irna以改善的功效、稳定性、效价、耐久性及安全性。
[0179]
因此，本发明提供了使用影响载脂蛋白c3基因的rna转录本的rna诱导沉默复合体(risc)介导的裂解的irna组合物治疗及预防载脂蛋白c3相关病症的方法，所述载脂蛋白c3相关病症包括例如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎。
[0180]
本发明的irna包括rna链(反义链)，其具有长度最多为约 30个核苷酸或更少的区域，例如，19至30、19至29、19至28、19 至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、 19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、 20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个核苷酸的长度的区域，该区域与apoc3基因的mrna转录本的至少一部分基本上是互补的。
[0181]
在某些实施方案中，本发明的双链rnai剂的一条链或两条链的长度最多为66个核苷酸，例如，36至66、26至36、25至36、31 至60、22至43、27至53个核苷酸，并具有一个与apoc3基因的mrna 转录本的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中，此类具有较长长度的反义链的irna剂优选可包括长度为20至60个核苷酸的第二条rna链(有义链)，其中该有义链与该反义链形成18至30个连续核苷酸的双链体。
[0182]
本发明的irna的使用使得哺乳动物体内对应的基因(载脂蛋白c3基因)的mrna的靶向降解成为可能。使用体外分析，本发明人已经证明，靶向apoc3基因的irna可有效地介导rnai，导致对 apoc3基因表达的显著抑制。因此，包括此类irna的方法及组合物可用于治疗患有载脂蛋白c3相关病症的受试者，例如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎。
[0183]
因此，本发明提供了用于治疗患有将受益于apoc3基因表达降低的病症的受试者的方法及联合疗法，该病症为例如载脂蛋白c3相关病症，诸如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎，该方法通过使用影响apoc3基因的 rna转录本的rna诱导沉默复合体(risc)介导的裂解的irna组合物。
[0184]
本发明还提供了预防患有将受益于apoc3基因表达的抑制或降低的病症的受试者的至少一种症状的方法，该病症为例如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压、动脉粥样硬化及胰腺炎。例如，在患有高甘油三酯血症的受试者中，本发明的方法可减轻该受试者的至少一种症状，例如，降低甘油三酯水平。
[0185]
下文的详细描述公开了如何制备并使用含有抑制apoc3基因表达的irna的组合物，以及用于治疗受试者的组合物、用途和方法，该受试者将受益于apoc3基因表达的抑制和/或降低，例如易患或已诊断患有载脂蛋白c3相关病症的受试者。
[0186]
i.定义
[0187]
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。此外，应当注意，每当列举参
数的数值或数值范围时，意图是介于所列举数值中间的数值及范围也旨在成为本发明的一部分。
[0188]
本文中使用的冠词“a(一)”和“an(一个)”是指该冠词的语法对象的一个或超过一个(即，至少一个)。例如，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素如多个要素。
[0189]
本文中使用的术语“包括”意指“包括但不限于”，且与后者可互换地使用。
[0190]
除非上下文另外明确指出，本文中使用的术语“或”意指“和 /或”，且与后者可互换地使用。例如，“有义链或反义链”应理解为有义链或反义链，或者，有义链和反义链”。
[0191]
本文中使用的术语“约”意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可理解为与平均值相差2个标准偏差。在某些实施方案中，“约”意指
±
10％。在某些实施方案中，“约”意指
±
5％。当“约”存在于一系列数字或范围之前时，应理解为“约”可修饰该系列数字或范围中的每个数字。
[0192]
如从上下文清楚可见的，在数字或一系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与该术语“至少”相邻的数字，以及从逻辑上可包括的所有后续数字或整数。例如，核酸分子中的核苷酸的数目必须为整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少19个核苷酸”意指19、 20或21个核苷酸具有所指的特性。当“至少”存在于一系列数字或范围之前时，应理解为“至少”可修饰该系列数字或范围中的每个数字。
[0193]
如本文所用，“不超过”或“少于”应理解为与该短语相邻的数值以及逻辑上更小的数值或整数，如从上下文逻辑来看，到零为止。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出的双链体具有2、1或0个核苷酸突出。当“不超过”存在于一系列数字或范围之前时，应理解为“不超过”可修饰该系列数字或范围中的每个数字。如本文中所用，范围包括上限及下限两者。
[0194]
如本文所用，检测方法可包括确定所存在的分析物的量低于该方法的检测水平。
[0195]
在所指示的靶标位点与正义链或反义链的核苷酸序列之间存在矛盾的情况下，以所指示的序列为准。
[0196]
在序列与其在转录物或其他序列所指示的位点之间存在矛盾的情况下，以在本说明书中所提及的核苷酸序列为准。
[0197]
如本文所用，术语“apoc3”是指编码载脂蛋白c3的公知的基因，也指代其蛋白质产物，本领域中也被称为halp2或apociii。
[0198]
术语“apoc3”包括人apoc3，其氨基酸及完整编码序列可见于例如genbank登录号gi：4557322(nm_000040.3；seq id no：1；反向互补，seq id no：2)；食蟹猴(macaca fascicularis)apoc3，其氨基酸及完整编码序列可见于例如genbank登录号gi： 544489959(xm_05579730.1，seq id no：3；反向互补，seq id no： 4)；恒河猴(macaca mulatta)apoc3，其氨基酸及完整编码序列可见于例如genbank登录号gi：297269260(xm_001090312.4；seq id no： 5；反向互补，seq id no：6)；小鼠(mus musculus)apoc3，其氨基酸及完整编码序列可见于例如genbank登录号gi： 577019555(nm_023114.4，seq id no：7；反向互补，seq id no：8)；大鼠(rattus norvegicus)apoc3，其氨基酸及完整编码序列可见于例如 genbank登录号gi：402534545(nm_012501.2，seq id no：9；反向互补，seq id no：2-10)；以及兔(oryctolagus cuniculus)，genbank 登录号gi：655601498(xm_002708371.3，seq id no：11；反向互补， seq id no：12)。
[0199]
apoc3的其他信息可见于，例如， www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/345。
[0200]
apoc3 mrna序列的其他示例可通过公共数据库轻松获得，例如，genbank、uniprot、omim以及猕猴属基因组计划网站。
[0201]
如本文中所用，术语“apoc3”也指apoc3基因中天然出现的dna序列变异，诸如apoc3基因中的单核苷酸多态性(snp)。apoc3 dna序列中的示例性snp可通过于www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp/获得的dbsnp数据库找到。apoc3基因内的序列变异的非限制性实例包括，例如，在petersen,k.f.et al.,(2010),n.engl.j.med.362(12)： 1082-1089中描述的两个变异rs2854116和rs2854117，该文献的全部内容通过引用并入本文。
[0202]
示例性apoc3核苷酸序列也可见于seq id no：1至seq idno：12。seq id no：2、4、6、8、10及12分别是seq id no：1、 3、5、7、9及11的反向互补序列。
[0203]
自本技术的提交日起，每个前述genbank登录号及gene数据库号的全部内容均通过引用并入本文。如本文中所用，“靶标序列”是指在载脂蛋白c3基因的转录过程中形成的mrna分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的rna加工产物的mrna。序列的靶标部分将至少足够长以在apoc3基因的转录过程中形成的mrna分子的核苷酸序列的部分或其附近用作irna引导裂解的底物。在一个实施方案中，靶标序列位于apoc3的蛋白质编码区域内。
[0204]
靶标序列可为约19至36个核苷酸的长度，例如，优选为约 19至30个核苷酸的长度。例如，靶标序列可为约19至30个核苷酸， 19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、 19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、 20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、 21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、 21至23、或21至22个核苷酸的长度。在某些实施方案中，靶标序列为19至23个核苷酸的长度，任选地21至23个核苷酸的长度。介于上文列举的范围及长度之间的范围及长度也被视为是本公开的一部分。
[0205]
如本文中所用，术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，其中该核苷酸通过参照使用标准核苷酸命名法的序列来描述。
[0206]
通常，“g”、“c”、“a”、“t”及“u”分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”亦可指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或代理替换部分(surrogate replacement moiety)(参见，例如，表1)。技术人员熟知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可以被其他部分替换而基本上不改变包含带有此替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的核苷酸进行碱基配对。因此，本发明表征的dsrna的核苷酸序列中的含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替换为含有例如肌苷的核苷酸。在另一实例中，寡核苷酸中任意位置的腺嘌呤及胞嘧啶可分别被替换为鸟嘌呤及尿嘧啶，以与靶标mrna 形成g-u摇摆(wobble)碱基配对。含有此类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物及方法。
[0207]
如本文中可互换使用的术语“irna”、“rnai剂”、“irna 剂”、“rna干扰剂”是指含有如本文中术语所定义的rna的剂，且其通过rna诱导沉默复合物(risc)途径介导了rna转录本的靶向裂解。 irna通过被称为rna干扰(rnai)的过程而引导mrna的序列特异性降解。irna调节例如抑制细胞(如受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞)中的载脂蛋白c3基因
的表达。
[0208]
在一个实施方案中，本发明的rnai剂包括单链rna，其与靶标rna序列(如载脂蛋白c3靶标mrna)相互作用，以引导该靶标rna的裂解。不欲受缚于理论，据信，被引入细胞内的长双链rna 通过被称为切丁酶(dicer)的iii型核酸内切酶分解为sirna(sharp et al. (2001)genes dev.15：485)。切丁酶，一种核酸酶iii样酶，其将dsrna 加工为19至23个碱基对的短干扰rna，该短干扰rna具有特征性的二碱基3
′
突出(bernstein,et al.,(2001)nature 409：363)。随后，将sirna 插入rna诱导沉默复合物(risc)中，在其中一种或多种解旋酶解开 sirna双链体，使得互补的反义链能够引导靶向识别(nykanen,et al., (2001)cell 107：309)。在与适当的靶标mrna结合后，risc内的一种或多种核酸内切酶裂解靶标以诱导沉默(elbashir,et al.,(2001)genes dev.15：188)。因此，在一方面，本发明涉及一种单链rna(sirna)，其在细胞内生成且促进risc复合物的形成，以有效沉默靶标基因即载脂蛋白c3(apoc3)基因。因此，本文中，术语“sirna”也用于指代上述的irna。
[0209]
在某些实施方案中，rnai剂可以是单链sirna(ssrnai)，其被引入细胞或有机体内以抑制靶标mrna。单链rnai剂与risc核酸内切酶argonaute 2结合，随后后者裂解靶标mrna。该单链sirna通常为15至30个核苷酸且经化学修饰。单链sirna的设计及测试描述于美国专利第8,101,348号及lima et al.,(2012)cell 150：883894中，这些文献各自的全部内容通过引用而并入本文。本文中描述的任何反义核苷酸序列可用作本文所述单链sirna或通过由lima et al.,(2012)cell 150：883-894中描述的方法进行化学修饰后再使用。
[0210]
在某些实施方案中，用于本发明的组合物、用途及方法中的“irna”是双链rna，且在本文中被称为“双链rna剂”、“双链rna (dsrna)分子”、“dsrna剂”或“dsrna”。术语“dsrna”是指具有双链体结构的核糖核酸分子的复合体，该双链体结构包含两条反向平行且基本互补的核酸链，这两条核酸链是指具有相对于靶标rna即载脂蛋白c3(apoc3)基因的“有义”定向及“反义”定向。在本发明的一些实施方案中，双链rna(dsrna)通过在本文中被称为rna干扰或 rnai的转录后基因沉默机制而触发靶标rna(如mrna)的降解。
[0211]
通常，dsrna分子的每条链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中所详述的，每条链或双链还可包括一个或多个非核糖核苷酸，如脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。此外，如本说明书所用，“irna”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；irna可包括在多个核苷酸上的实质性修饰。如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键合、或经修饰的核酸碱基或其任意组合的核苷酸。因此，术语“经修饰的核苷酸”涵盖了核苷酸间键合、糖部分或核酸碱基的例如官能基或原子的取代、添加或移除。适用于本发明的剂中的修饰包括本文公开或本领域已知的所有类型的修饰。就本说明书和权利要求而言，“irna”或“rnai剂”涵盖了用于 sirna类型分子的任何此类修饰。
[0212]
在本公开的某些实施方案中，将脱氧核苷酸(若存在)包含在 rnai剂中可被视为构成经修饰的核苷酸。
[0213]
双链体区域可以是允许所期望的靶标rna通过risc途径特异性降解的任意长度，且可以为约19至36个碱基对的长度范围，如约19至30个碱基对的长度，例如，约9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、或36个碱基对的长度，例如约19至30、19至29、19 至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、 19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、 20至25、20至24、20
至23、20至22、20至21、21至30、21至29、 21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至 22个碱基对的长度。在某些实施方案中，双链体区域具有19至21个碱基对的长度，例如，21个碱基对的长度。介于上文列举的范围及长度中间的范围及长度亦被视为本公开的一部分。
[0214]
形成该双链体结构的双链可以是一个较大rna分子的不同部分，或它们可以是单独的rna分子。若该双链是一个较大分子的一部分，并因此而通过在一条链的3
′
端与相对的另一条链的5
′
端的之间的不间断核苷酸链相连接形成该双链体结构，则该连接rna链被称为“发夹环”。发夹环可包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以是10个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以是8个或更少的未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以是4至10个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以是4至8个核苷酸。
[0215]
若dsrna的两条基本上互补的链是由单独的rna分子所构成的，则那些分子不必要是共价连接的，但可以是共价连接的。若双链通过在一条链的3
′
端与相对的另一条链的5
′
端之间的未中断核苷酸链来形成双链体结构以外的方式进行共价连接，则该连接结构被称为“接头”。rna链可具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是 dsrna的最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任意突出的数目。除了双链体结构外，rnai可包含一个或多个核苷酸突出。在rnai剂的一个实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3
′
突出。在另一实施方案中，至少一条链包含具有至少2个核苷酸，例如2、3、4、5、 6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的3
′
突出。在其他实施方案中，rnai剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5
′
突出。在某些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如2、5、4、5、6、 7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的5
′
突出。在其他实施方案中，rnai剂的一条链的3
′
端及5
′
端均包含至少1个核苷酸的突出。
[0216]
在某些实施方案中，本发明的irna剂是dsrna，其每条链包含19至23个核苷酸，其与靶标rna序列例如载脂蛋白c3(apoc3) 基因相互作用以引导靶标rna的裂解。
[0217]
在一些实施方案中，本发明的irna剂是24至30个核苷酸的 dsrna，其与靶标rna序列例如apoc3靶标mrna序列相互作用以引导靶标rna的裂解。
[0218]
如本文所用，术语“核苷酸突出”是指从双链irna的双链体结构凸出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsrna的一条链的3
′
端延伸到超过另一条链的5
′
端，或反之亦然，则存在核苷酸突出。dsrna 可包含至少一个核苷酸的突出；或者该突出可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷类似物或由核苷酸/核苷类似物组成，其中该核苷酸/ 核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。突出可位于有义链、反义链或其任意组合上。此外，突出的核苷酸可存在于dsrna的反义链或有义链的 5
′
端、3
′
端或两端。
[0219]
在一个实施方案中，dsrna的反义链具有突出在3
′
端或5
′
端的1至10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在一个实施方案中，dsrna的有义链具有突出在3
′
端或5
′
端的1至10 个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在另一实施方案中，该突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸酯。
[0220]
在某些实施方案中，该dsrna的反义链具有突出在3
′
端或5
′
端的1至10个核苷酸，
例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、 5至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在一个实施方案中，dsrna的有义链具有突出在3
′
端或5
′
端的1至10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在另一实施方案中，该突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸酯。
[0221]
在某些实施方案中，dsrna的反义链具有突出在3
′
端或5
′
端的1至10个核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在某些实施方案中，位于有义链或反义链或两者中的突出可包括大于 10个核苷酸的延伸长度，例如，1至30个核苷酸、2至30个核苷酸、 10至30个核苷酸、10至25个核苷酸、10至20个核苷酸或10至15 个核苷酸的长度。在某些实施方案中，延伸的突出位于双链体的有义链。在某些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的有义链的3
′
端。在某些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的有义链的5
′
端。在某些实施方案中，延伸的突出位于双链体的反义链。在某些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的反义链的3
′
端。在某些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的反义链的5
′
端。在某些实施方案中，延伸的突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸酯。在某些实施方案中，突出包括自我互补的部分，使得该突出能够形成在生理学条件下稳定的发夹结构。
[0222]“钝”或“钝端”意指在双链rna剂的末端没有未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出。“钝端”双链rna剂在其整个长度上都是双链，即，在其分子的任一端均没有核苷酸突出。本发明的rnai剂包括在一端没有核苷酸突出(即，有一个突出端及一个钝端的剂)或在任一端均没有核苷酸突出的rnai剂。大多数情况下，此类分子将于其整个长度上都是双链的。
[0223]
术语“反义链”或“引导链”是指irna例如dsrna的链，其包括与靶标序列如apoc3 mrna基本上互补的区域。
[0224]
如本文所用，术语“互补性区域”是指反义链上的与序列例如本文所定义的靶标序列(如载脂蛋白c3核苷酸序列)基本上互补的区域。如果互补性区域与靶标序列不完全互补，则错配可存在于分子的内部区域或末端区域。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，如在 irna的5
′
端或3
′
端的5、4或3个核苷酸内。在一些实施方案中，本发明的双链rna剂包括位于反义链中的核苷酸错配。在一些实施方案中，本发明的双链rna剂的反义链包括不超过4个与靶标mrna的错配，例如，反义链包括4、3、2、1或0个与靶标mrna的错配。在一些实施方案中，本发明的双链rna剂的反义链包括不超过4个与有义链的错配，例如，反义链包括4、3、2、1或0个与有义链的错配。在一些实施方案中，本发明的双链rna剂包括位于有义链中的核苷酸错配。在一些实施方案中，本发明的双链rna剂的有义链包括不超过4 个与反义链的错配，例如，有义链包括4、3、2、1或0个与反义链的错配。在一些实施方案中，核苷酸错配位于例如自irna的3
′
端开始计数的5、4、3个核苷酸内。在另一实施方案中，核苷酸错配是例如位于 irna剂的3
′‑
端核苷酸中。在一些实施方案中，错配不在种子区域中。
[0225]
因此，本文所述rnai剂可含有与靶标序列的一个或多个错配。在一个实施方案中，本文所述的rnai剂含有不超过3个错配(即， 3、2、1或0个错配)。在一个实施方案中，本文所述的rnai剂含有不超过2个错配。在一个实施方案中，本文所述的rnai剂含有不超过1 个错配。在一个实施方案中，本文所述的rnai剂含有0个错配。在某些实施方案中，如果rnai剂的反义链含有与靶标序列的错配，则可任选地将该错配限制在距互补性区域的5
′
端或3
′
端的最后5个核苷酸内。例如，在此类实施方案中，对于23个核苷酸的rnai剂，与apoc3 基因区域互补的链通常在中心的13个核苷酸处不含任何错配。本文所述的方法或本领域中已知的方
法可用于确定含有与靶标序列的错配的 rnai剂是否可有效抑制apoc3基因的表达。考虑有错配的rnai剂在抑制apoc3基因的表达中的效力是重要的，尤其是如果apoc3基因中的特定互补性区域已知在群体内具有多态性序列变异。
[0226]
如本文所用，术语“有义链”或“过客链”是指irna的链，其包括与如本文所定义的反义链的区域基本互补的区域。
[0227]
如本文所用，“基本上所有核苷酸都经修饰”是大多数并非全部都经修饰，且可包括不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
[0228]
如本文所用，术语“裂解区域”是指位于紧邻裂解位点的区域。裂解位点是在靶标裂解发生处的位点。在一些实施方案中，裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的三个碱基。在一些实施方案中，裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的两个碱基。在一些实施方案中，裂解位点特异性地出现在反义链的核苷酸10 和11所结合的位点，且裂解区域包含核苷酸11、12及13。
[0229]
如本文所用且除非明确说明，当术语“互补”被用来描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时，是指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，正如技术人员所理解的那样。此类条件可以是例如严格条件，其中严格条件可包括：400mmnacl，40mm pipes ph 6.4，1mm edta，50℃或70℃，持续12至 16小时，然后进行洗涤(参见，例如，“molecular cloning：a laboratorymanual,sambrook,et al.(1989)cold spring harbor laboratory press)。也可施加其他条件，例如可在生物体内遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据所杂交的核苷酸的最终应用来确定最适用于两个序列的互补性测试的条件设置。
[0230]
如本文所述的irna如dsrna内的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长碱基配对。在本文中，此类序列可被称为彼此是“完全互补的”。然而，在本文中，如果第一序列相对于第二序列被称为是“基本互补的”，则这两个序列可以是完全互补的，或在杂交形成多达30个碱基对的双链体时，它们可形成一个或多个但通常不超过5、4、3或2个错配的碱基对，同时保留在最适于其最终应用(例如通过risc途径的基因表达的抑制)的条件下杂交的能力。然而，如果两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出，则就确定互补性而言，此类突出不应被视为错配。例如，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的 dsrna，其中较长的核苷酸包含一个与较短的核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文所述目的，其仍可被称为是“完全互补的”。
[0231]
如本文所用，“互补的”序列也可包括非watson-crick碱基对或由非天然核苷酸及经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由非 watson-crick碱基对或由非天然核苷酸及经修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于它们的杂交能力的要求。此类非 watson-crick碱基对包括但不限于，g：u摇摆 碱基配对或 hoogstein碱基配对。
[0232]
在本文中，术语“互补的”、“完全互补的”及“基本互补的”可用于描述dsrna的有义链与反义链之间或双链rna剂的反义链与靶标序列之间的碱基匹配，如从其使用的上下文中将理解的。
[0233]
如本文所用，与信使rna(mrna)的“至少一部分是基本互补的”多核苷酸是指与感
兴趣的mrna(例如，编码载脂蛋白c3基因的mrna)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果多核苷酸序列与编码载脂蛋白c3基因的mrna的不间断部分是基本互补的，则该多核苷酸与载脂蛋白c3 mrna的至少一部分是互补的。
[0234]
因此，在一些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标apoc3序列是完全互补的。在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标apoc3序列是基本互补的，且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与下列序列的等同区域是至少80％互补的：seq id no:1、3、5、7、9或11中的任何一个，或seq id no:1-1、 3、5、7、9或11中的任何一个的片段，例如是约85％、约90％、约 91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补的。
[0235]
在一些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标 apoc3序列的片段是基本互补的，并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自seq id no：1的核苷酸232至254、233 至255、238至260、239至261、242至264、243至265、244至266、 264至286、268至290、426至448、431至453、432至454、433至 455、435至457、436至458、499至521、500至522、503至525、504 至526、507至529、510至532和511至533的组的seq id no：1的片段是至少约80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％或约99％互补的。
[0236]
在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标 apoc3序列的片段是基本互补的，并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自seq id no：1的核苷酸235至257、238 至260、242至264、243至265、244至266、426至448、430至450、 431至453、432至454、433至455、435至457、436至458、499至 521、503至525和504至526的组的seq id no：1的片段是至少约 80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％或约99％互补的。在一些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标apoc3序列的片段是基本互补的，并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自seq id no：1的核苷酸232至254、239至261、242至264、 244至266、258至280、264至286、268至290、429至451、430至 450、430至452、433至455、434至456、435至457、500至522、503 至525、507至529、510至532和504至526的组的seq id no：1的片段是至少约80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％或约99％互补的。
[0237]
在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标 apoc3序列的片段是基本互补的，并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自seq id no：1的核苷酸429至451、430 至452、431至451、432至452、433至455、504至526和506至526 的组的seq id no：1的片段是至少约80％互补的，例如约85％、约 90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％或约99％互补的。
[0238]
在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶标 apoc3序列是基本互补的，并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列是在其全长上与表2至表5、表14和表15中任一者的任一有义链核苷酸序列或表2至表5、表14和表15中任一者的任一有义链核苷酸序列的片段是至少约80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约 92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％、约99％、或100％互补的。
[0239]
在一个实施方案中，本公开的rnai剂包括与反义多核苷酸基本互补的有义链，该
反义多核苷酸又反过来与靶标apoc3序列相同，其中该有义链多核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与seq id no：2、4、6、8、10或12或者seq id no：2、4、6、 8、10或12中任一者的片段的核苷酸序列的等同区域是至少约80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约 95％、约96％、约95％、约97％、约98％、约99％、或100％互补的。
[0240]
在一些实施方案中，本发明的irna包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，该反义多核苷酸又反过来与靶标载脂蛋白c3序列互补，其中该有义链多核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与表2至表5、表14或表15中任一者的任一反义链核苷酸序列或表2至表5、表14或表15中任一者的任一反义链核苷酸序列的片段是至少约80％互补的，例如约85％、约90％、约91％、约92％、约 93％、约94％、约95％、约96％、约95％、约97％、约98％、约99％、或100％互补的。
[0241]
在某些实施方案中，该有义链和反义链选自下列任一双链体：ad-959917.1、ad-959918.1、ad-960096.1、ad-960064.1、 ad-959914.1、ad-959941.1、ad-960031.1、ad-960063.1、 ad-960293.1、ad-960288.1、ad-960445.1、ad-960292.1、 ad-960475.1、ad-960442.1、ad-960470.1、ad-960436.1、 ad-960446.1、ad-960474.1、ad-960294.1、ad-960471.1、 ad-960314.1、ad-960443.1、ad-960282.1、ad-960283.1、ad-80794.7、 ad-960478.1、ad-960481.1或ad-960482.1。
[0242]
在其他实施方案中，该有义链和反义链选自下列任一双链体：ad-959917.1、ad-960064.1、ad-960031.1、ad-960063.1、 ad-960293.1、ad-960288.1、ad-960445.1、ad-960292.1、 ad-960475.1、ad-960442.1、ad-960470.1、ad-960436.1、 ad-960446.1、ad-960474.1、ad-960294.1、ad-960443.1、ad-80794.7 和ad-959910.1。
[0243]
在一些实施方案中，该有义链和反义链选自下列任一双链体：ad-80794.8、ad-959907.2、ad-959914.2、ad-959916.2、 ad-959932.2、ad-960314.2、ad-959941.2、ad-960030.2、 ad-960062.2、ad-960064.2、ad-960065.2、ad-960066.2、ad-960294.2、ad-960471.2、ad-960474.2、ad-960478.2和 ad-960481.2。
[0244]
在其他实施方案中，该有义链和反义链选自下列任一双链体：ad-960030、ad-1143243、ad-1143245、ad-1143247、ad-1143249、 ad-1143256、ad-1143260、ad-1143278、ad-1143287、ad-1143295、 ad-1143299、ad-1143302和ad-1143305。
[0245]
在一个实施方案中，该有义链和反义链是双链体ad-1143243。
[0246]
通常，“irna”包括具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可包括本文中公开或本领域中已知的全部类型的修饰。出于本说明书及权利要求范围的目的，在dsrna分子中所用的任何此类修饰均包括在“irna”中。
[0247]
在本公开的某些实施方案中，如果脱氧核苷酸存在于rnai 剂内则可被视为构成经修饰的核苷酸。
[0248]
在本发明的一方面，用于本发明的方法和组合物中的剂是单链反义寡核苷酸分子，其通过反义抑制机制来抑制靶标mrna。该单链反义寡核苷酸分子与靶标mrna内的序列是互补的。该单链反义寡核苷酸可通过与mrna碱基配对并从物理上阻碍翻译机制从而以化学计量学方式抑制翻译，参见dias,n.et al.,(2002)mol cancer ther 1： 347-355。单链反义寡核苷酸分子可为约14至约30个核苷酸的长度，并且具有与靶标序列互补的序列。例
如，单链反义寡核苷酸分子可包含来自本文所述反义序列中任一序列的至少约14、15、16、17、18、19、 20或更多个连续核苷酸的序列。
[0249]
如本文所用，短语“使细胞与irna接触”，例如dsrna，包括通过任意可能的方式与细胞接触。使细胞与irna接触包括使细胞与 irna在体外接触或使细胞与irna在体内接触。接触可直接或间接地完成。因此，例如，irna可通过方法执行人使其与细胞进行物理接触，或者，可将irna置于将允许或导致其随后与细胞接触的条件下。
[0250]
可以通过例如将细胞与irna一起孵育来完成体外细胞接触。体内接触细胞可以通过例如将irna注射至细胞所在的组织内或邻近该组织处，或通过将irna注射至另一区域如血流或皮下空间内，从而使得该剂将随后到达待接触的细胞所在的组织来完成。例如，irna 可含有配体或与配体偶联，如galnac，该配体能够引导irna至感兴趣的位点如肝脏。体外接触方法与体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞可在体外与irna接触，并随后移植到受试者体内。
[0251]
在某些实施方案中，使细胞与irna接触包括，通过促进或影响细胞的摄取或吸收而“将irna引入”或“将irna递送至细胞内”。 irna的吸收或摄取可通过无辅助的地扩散或主动的细胞过程发生，或通过辅助剂或辅助装置发生。将irna引入细胞可以是体外的或体内的。例如，对于体内引入，可将irna注射到组织部位或将其全身性施用。体外引入细胞包括本领域中已知的方法，如电穿孔及脂质转染。更多方法描述于下文中或在本领域中是已知的。
[0252]
术语“脂质纳米颗粒”或“lnp”是包含脂质层的囊泡，该脂质层封装有药学活性分子如核酸分子如irna或转录出irna的质粒。 lnp描述于，例如，美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第 8,158,601号及第8,058,069号，其全部内容通过引用并入本文。
[0253]
如本文所用，“受试者”是内源性地或异源性地表达靶标基因的动物如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、非人灵长类动物例如猴和黑猩猩)、非灵长类动物(诸如牛、猪、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、或小鼠)或禽类。在一个实施方案中，受试者是人，例如因疾病或病症正接受治疗或正被评估的人，而该疾病或病症将受益于apoc3表达降低；有患将受益于apoc3表达降低的疾病或病症风险的人；患有将受益于apoc3表达降低的疾病或病症的人；或因将受益于apoc3表达降低的疾病或病症正在进行治疗的人，如本文所述。在一些实施方案中，受试者是女性。在在一些实施方案中，受试者是男性。在一个实施方案中，受试者是成人受试者。在其他实施方案中，受试者是儿童受试者。
[0254]
如本文所用，术语“(进行)治疗(treating)”和“治疗(过程) (treatment)”是指有益或期望的结果，例如减轻受试者体内apoc3相关病症的至少一种体征或症状。治疗也包括减轻一种或多种与不希望的 apoc3表达相关的体征或症状；减轻不希望的apoc3激活或稳定化的程度；缓解或缓和不希望的apoc3激活或稳定化。“治疗”还可意指与没有治疗的预期生存期相比延长生存期。在受试者的apoc3或疾病标志物或症状水平的上下文中，术语“较低”是指该水平在统计学上的显著降低。降低可以是，例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％或更多。在某些实施方案中，降低为至少20％。在某些实施方案中，疾病标志物例如蛋白质或基因表达水平的降低为至少50％。在受试者体内的apoc3水平的上下文中，“较低”优选是降低至无此病症的个体的正常范围内可接受的水平。在某些实施方案中，“较低”是患有疾病的
受试者的标志物或症状水平与处于个体的正常范围内可接受水平之间的差异的减小，例如，肥胖个体的体重与具有正常范围内可接受体重的个体之间的体重降低的水平。
[0255]
如本文所用，当用于形容疾病、病症或其病况可通过降低 apoc3基因的表达来治疗或缓解时，“预防(过程)”或“(进行)预防”是指降低受试者将发展出与此疾病、病症或病况相关的症状的可能性，例如不希望或过度的apoc表达的症状，例如高甘油三酯血症。降低发展成例如高甘油三酯血症的可能性，例如，当具有一种或多种高甘油三酯血症风险因素的个体相对于具有相同风险因素但未接受如本文所述治疗的群体，不发展成高甘油三酯血症或发展成严重程度较低的高甘油三酯血症。不发展成疾病、病症或病况，或降低与此疾病、病症或病况相关的症状的发展(例如，将该疾病或病症的临床可接受量表降低至少约10％)，或显现出症状的延迟(例如，延迟数天、数周、数月或数年)，被认为是有效的预防。
[0256]
如本文所用，术语“载脂蛋白c3相关疾病”或“apoc3相关疾病”是由不希望或过度的apoc3表达造成的或与之相关的疾病、病症或病况。术语“apoc3相关疾病”包括可通过降低apoc3表达来治疗或缓解的疾病、病症或病况。术语“apoc3相关疾病”包括高甘油三酯血症或高甘油三酯水平。
[0257]
在oh,r.c.et al.,(2007)american family physician, 75(9):1366-1371中描述了可指示高甘油三酯血症的受试者(例如人类受试者)血清中的甘油三酯水平。具体地，高甘油三酯血症可与“临界
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高血清甘油三酯水平(即，150mg/dl至199mg/dl或者1.70mg/dl至 2.25mmol/l)；“高血清甘油三酯水平”(即，200mg/dl至499mg/dl 或者2.26mg/dl至5.64mmol/l)；或“极高甘油三酯水平”(即，500 mg/dl或更高，或者5.65mmol/l或更高)有关。
[0258]
在一个实施方案中，apoc3相关疾病是原发性高甘油三酯血症。“原发性甘油三酯血症”是由环境或遗传性因素所导致的(例如，无明显潜在医学因素的结果)。特征为原发性高甘油三酯血症的示例性疾病包括但不限于，家族性乳糜微粒血症(i型高脂蛋白血症)、原发性混合型高脂血症(5型)、家族性高甘油三酯血症(4型高脂蛋白血症)、家族性结合型高脂蛋白血症(2b型)及家族性异常β脂蛋白血症(3型高脂蛋白血症)。
[0259]
在另一实施方案中，apoc3相关疾病是继发性高甘油三酯血症。“继发性甘油三酯血症”是由其他潜在病症及病况造成的或与之相关。此类病症和/或病况包括，例如，肥胖症、代谢综合征、糖尿病、脂肪肝、饮酒、肾病、妊娠、非酒精性脂肪性肝病、甲状腺功能减退、副蛋白血症(例如巨球蛋白血症中的高γ-球蛋白血症、骨髓瘤、淋巴瘤和淋巴细胞性白血病)、自体免疫疾病(例如系统性红斑狼疮)、药物摄入 (例如抗逆转录病毒药物，包括利托那韦(ritonavir)及洛匹那韦 (lopinavir)；以及抗精神病药物，包括氯氮平及奥氮平)，参见g.yuan etal.,(2007)canadian medical association journal,176(8):1113-1120。
[0260]
任何可以导致高甘油三酯血症(例如，继发性高甘油三酯血症) 或者可以是高甘油三酯血症(例如，原发性或继发性高甘油三酯血症)的后果的病症均包括在术语“apoc3相关病症”中。apoc3相关病症的非限制性示例包括代谢障碍，例如，非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管疾病，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。
[0261]
如本文所用，“治疗有效量”旨在包括，当将rnai剂施用给患有apoc3相关疾病的受试者时，足以有效治疗该疾病的rnai剂的量(例如，通过减轻、缓解或维持现有疾病或疾病
的一种或多种疾病症状)。“治疗有效量”可根据rnai剂、该剂的施用方式、疾病及其严重程度及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族病史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、以及其他个体特征而变化。
[0262]
如本文所用，“预防有效量”旨在包括，当将rnai剂施用给患有apoc3相关病症的受试者时，足以预防或缓解该疾病或该疾病的一种或多种疾病症状的rnai剂的量。缓解疾病包括减缓该疾病的进程或降低后发疾病的严重程度。“预防有效量”可根据rnai剂、该剂的施用方式、疾病风险程度及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、以及其他个体特征而变化。
[0263]“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理效益/风险比率产生一些预期效果的rnai剂的量。本发明方法中所采用的irna可以以足以产生适用于这种治疗的合理效益/风险比率的量来施用。
[0264]
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指，在合理的医学判断范围内，那些适用于与人类受试者和动物受试者的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，即符合合理效益/风险比的化合物、材料、组合物或剂型。
[0265]
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂(vehicle)，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料，涉及将受试化合物从一个器官或身体的一部分携带或运送至另一器官或身体的另一部分。就与制剂的其他成分兼容且不损害被治疗的受试者而言，每种载体必须是“可接受的”。此类载体是本领域已知的。药学上可接受的载体包括用于通过注射施用的载体。
[0266]
如本文所用，术语“样本”包括从受试者分离出的相似的体液、细胞或组织，以及存在于受试者体内的体液、细胞或组织的集合。生物体液的实例包括血液、血清及浆膜液、血浆、脑脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。组织样本可包括来自组织、器官或局部区域的样本。例如，样本可源自特定的器官、器官的一部分、或那些器官内的液体或细胞。在某些实施方案中，样本可源自肝脏(例如，全肝或肝脏的特定区段或肝脏中特定类型的细胞，例如，肝细胞)。在一些实施方案中，“源自受试者的样本”是指从受试者获得的尿液。“源自受试者的样本”可指来自受试者的血液或源自血液的血清或血浆。
[0267]
ii.本发明的irna
[0268]
本发明提供了抑制载脂蛋白c3基因的表达的irna。在优选实施方案中，irna包括用于抑制细胞中apoc3基因表达的双链核糖核酸(dsrna)分子，所述细胞为例如受试者体内的细胞，例如哺乳动物体内的细胞，例如易患apoc3相关疾病例如高甘油三酯血症的人体内的细胞。该dsrnai剂包括具有互补性区域的反义链，该互补性区域与在apoc3基因表达中所形成的mrna的至少一部分是互补的。该互补性区域为约19至30个核苷酸的长度(例如，约30、29、28、27、26、 25、24、23、22、21、20或19个核苷酸的长度)。当与表达apoc3基因的细胞接触时，该irna将apoc3基因(例如，人类、灵长类、非灵长类或大鼠apoc3基因)的表达抑制了至少约50％，如通过例如pcr 或基于分支dna(bdna)的方法所测定的，或通过基于蛋白质的方法例如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白印迹法或流式细胞术所测定的。在优选实施方案中，通过本文实施例中提供的qpcr方法，用其中提供的合适生物细胞系中的sirna(例如10nm浓度)来测定表达的抑制。在优选实施方案中，通过敲低表达人类基因的啮齿动物
(例如，表达人靶标基因的小鼠或经aav转染的小鼠)体内的人类基因来测定体内表达的抑制，例如，当以单次剂量给药时，例如，在rna表达的最低点时以3mg/kg给药。
[0269]
dsrna包括两条互补的rna链，其在使用该dsrna的条件下杂交以形成双链体结构。dsrna的一条链(反义链)包含互补性区域，该互补性区域与靶标序列是基本互补的且通常是完全互补的。靶标序列可源自在apoc3基因表达过程中形成的mrna序列。另一条链(有义链)包括与该反义链互补的区域，使得两条链在适当条件下结合时杂交并形成双链体结构。如本文其他部分所述和本领域已知的，dsrna的互补序列也可作为单个核酸分子的自身互补区，而非位于单独的寡核苷酸上。
[0270]
通常，双链体结构为15至30个碱基对的长度，如15至29、 15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、 15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、 18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、 18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、 19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、 20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、 20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、 21至25、21至24、21至23、或21至22个碱基对的长度。在某些优选实施方案中，双链体结构为18至25个碱基对的长度，例如，18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19 至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24、 20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、 22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25个碱基对的长度，例如，19至21个碱基对的长度。介于上文列举的范围和长度之间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
[0271]
类似地，靶标序列的互补性区域为15至30个核苷酸的长度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至 23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18 至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、 18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、 19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、 19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、 20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、 21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个核苷酸的长度，例如，19至23个核苷酸的长度或21至23个核苷酸的长度。介于上文列举的范围及长度之间的范围及长度也被认为是本公开的一部分。
[0272]
在一些实施方案中，双链体结构为19至30个碱基对的长度。类似地，靶标序列的互补性区域为19至30个核苷酸的长度。
[0273]
在一些实施方案中，dsrna为约19至约23个核苷酸的长度，或约25至约30个核苷酸的长度。通常，dsrna足够长以用作切丁酶的底物。例如，本领域中已知，长度长于约21至23个核苷酸的dsrna 可用作切丁酶的底物。作为本领域技术人员还应认识到，作为裂解靶标的rna区域通常是较大rna分子(通常是mrna分子)的一部分。在相关的情况下，mrna靶标的“一部分”是mrna靶标的连续序列，其长度足以允许其成为rnai引导的裂解(即，通过risc途径的裂解) 的底物。
[0274]
本领域技术人员还应认识到，双链体区域是dsrna的主要功能部分，例如，约19至约30个碱基对的双链体区域，例如，约19至 30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19 至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、 20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、 21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至
24、 21至23或21至22个碱基对的双链体区域。因此，在一个实施方案中，就其被加工为靶向所期望用于裂解的rna的例如15至30个碱基对的功能性双链体的程度而言，具有超过30个碱基对的双链体区域的rna 分子或多rna分子的复合体是dsrna。因此，本领域普通技术人员将认识到，在一个实施方案中，mirna是dsrna。在另一实施方案中， dsrna不是天然存在的mirna。在另一实施方案中，可用于靶向载脂蛋白c3基因表达的irna剂并不是在靶细胞内通过较大dsrna的裂解生成的。
[0275]
本文所述的dsrna还可包括一个或多个单链核苷酸突出，其具有例如1至4、2至4、1至3、2至3、1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出的dsrna相对于其钝端的对应物可具有更好的抑制特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷类似物或由核苷酸/核苷类似物组成，其中该核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。突出可位于有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出的核苷酸可存在于dsrna 的反义链或有义链的5
′
端、3
′
端或两端。
[0276]
dsrna可通过本领域中已知的标准方法合成。本发明的双链 rnai化合物可使用两步法来制备。首先，分别制备双链rna分子的两条单链。随后，将组成链退火。该sirna化合物的单链可使用溶液相有机合成、固相有机合成或两者来制备。有机合成的优点是：可容易地制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。类似地，本发明的单链寡核苷酸可使用溶液相有机合成、固相有机合成或两者来制备。
[0277]
一方面，本发明的dsrna包括至少两个核苷酸序列：有义序列及反义序列。有义链选自表2至表5、表14及表15的任一者中提供的序列的组，并且有义链的对应反义链序列选自表2至表5、表14及表15中任一者的序列的组。在此方面，两个序列中的一个序列与该两个序列中的另一个序列是互补的，其中一个序列与在载脂蛋白c3基因的表达中生成的mrna序列是基本互补的。因此，在此方面，dsrna 将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2至表5、表14及表15 中任一者中被描述为有义链，而第二个寡核苷酸在表2至表5、表14 及表15中任一者中被描述为有义链的对应反义链。
[0278]
在某些实施方案中，dsrna的基本互补的序列包含在单独的寡核苷酸上。在其他实施方案中，dsrna的基本互补的序列包含在单个寡核苷酸上。
[0279]
在某些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：ad-959917.1、ad-959918.1、ad-960096.1、 ad-960064.1、ad-959914.1、ad-959941.1、ad-960031.1、 ad-960063.1、ad-960293.1、ad-960288.1、ad-960445.1、 ad-960292.1、ad-960475.1、ad-960442.1、ad-960470.1、 ad-960436.1、ad-960446.1、ad-960474.1、ad-960294.1、 ad-960471.1、ad-960314.1、ad-960443.1、ad-960282.1、 ad-960283.1、ad-80794.7、ad-960478.1、ad-960481.1或ad-960482.1。
[0280]
在其他实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：ad-959917.1、ad-960064.1、ad-960031.1、 ad-960063.1、ad-960293.1、ad-960288.1、ad-960445.1、 ad-960292.1、ad-960475.1、ad-960442.1、ad-960470.1、 ad-960436.1、ad-960446.1、ad-960474.1、ad-960294.1、 ad-960443.1、ad-80794.7和ad-959910.1。
[0281]
在一些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：ad-80794.8、ad-959907.2、ad-959914.2、 ad-959916.2、ad-959932.2、ad-960314.2、ad-959941.2、 ad-960030.2、ad-960062.2、ad-960064.2、ad-960065.2、 ad-960066.2、ad-960294.2、ad-960471.2、ad-960474.2、ad-960478.2 和ad-960481.2。
[0282]
在一些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：ad-960030、ad-1143243、ad-1143245、 ad-1143247、ad-1143249、ad-1143256、ad-1143260、ad-1143278、 ad-1143287、ad-1143295、ad-1143299、ad-1143302和ad-1143305。
[0283]
在一些实施方案中，有义链或反义链是选自双链体 ad-1143243的有义链或反义链。
[0284]
应当理解，尽管表2、表4及表14中的序列未被描述为经修饰或缀合的序列，但本发明的irna的rna如本发明的dsrna可包含表2至表5、表14及表15中任一者所列出的任何一个未经修饰的、未缀合的、或与本文所述不同的经修饰的或缀合的序列。换言之，本发明包括表2至表5、表14及表15的dsrna，其是未经修饰的、未缀合的、经修饰的或缀合的，如本文所述。
[0285]
技术人员已知，具有约20至23个碱基对如21个碱基对的双链体结构的dsrna被认为在诱导rna干扰方面尤其有效(elbashir et al.,embo2001,20：6877-6888)。但是，其他人已经发现，较短或较长的rna双链体结构也可以是有效的(chu and rana(2007)rna 14： 1714-1719；kim et al.(2005)nat biotech23：222-226)。在上述实施方案中，凭借表2至表5、表14及表15中任一者中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述dsrna可包括至少一条长度为最少21个核苷酸的链。可合理地预期，具有表2至表5、表14及表15中任一者的任一序列且在该序列的一端或两端仅减去几个核苷酸的较短双链体与上述dsrna 相比可以同样有效。因此，具有源自表2至表5、表14及表15中任一者的任一序列的至少19、20或更多个连续核苷酸的序列且其抑制载脂蛋白c3基因表达的能力与包含全序列的dsrna相差不超过约5％、 10％、15％、20％、25％或30％的dsrna，预期被包括在本发明的范围内。
[0286]
此外，表2至表5、表14及表15中提供的rna识别了载脂蛋白c3转录本中对risc介导的裂解敏感的一个或多个位点。因此，本发明还提出了靶向这些位点之一的irna。如本文所用，如果irna 促进在该特定位点内任意处的转录本的裂解，则称该irna为靶向rna 转录本的特定位点内。这样的irna通常将包括来自表2至表5、表14 及表15中任一者所提供的任一序列的至少约19个连续核苷酸，该连续核苷酸与取自载脂蛋白c3基因中所选择序列相邻的区域的另一核苷酸序列偶联。
[0287]
iii.本发明的经修饰irna
[0288]
在某些实施方案中，本发明的irna的rna例如dsrna是未经修饰的，且不包含例如本领域中已知和本文所述的化学修饰或缀合。在其他实施方案中，本发明的irna的rna如dsrna经化学修饰以增强稳定性或其他有益特性。在本发明的某些实施方案中，本发明的 irna的基本上所有核苷酸都经修饰。在本发明的其他实施方案中， irna的所有核苷酸或irna的基本上所有核苷酸都经修饰，即，在 irna的链内存在不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
[0289]
本发明提出的核酸可通过本领域中已完善建立的方法来合成或修饰，例如在“current protocols in nucleic acid chemistry”,beaucage, s.l.et al.(edrs.),john wiley&sons,inc.,new york,ny,usa中所描述的那些方法，该文献通过引用并入本文。修饰包括，例如，末端修饰，例如，5
′
末端修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3
′
末端修饰(缀合、dna 核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用以下进行替换：稳定碱基、去稳定碱基、或与扩展的配偶体库进行碱基配对的碱基、移除碱基(无碱基核苷酸)，或缀合碱基；糖
修饰(例如，在2
′‑
位置或4
′‑
位置)或糖替换；或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本文所述实施方案中的irna化合物的具体实例包括，但不限于，含有经修饰的主链或不含天然核苷间键合的rna。具有经修饰主链的rna除此之外还包括那些在主链中没有磷原子的rna。出于本说明书的目的，且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中没有磷原子的经修饰的rna也可被认为是寡核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的rna将在其核苷间主链中具有磷原子。
[0290]
经修饰的rna主链包括，例如，具有正常3
′‑5′
键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3
′‑
亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯的甲基磷酸酯和其他烷基磷酸酯、亚膦酸酯、包括3
′‑
氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、以及硼磷酸酯，这些的2
′‑5′
连接类似物，以及其中相邻的核苷单元对是以 3
′‑5′
连接至5
′‑3′
或以2
′‑5′
连接至5
′‑2′
的具有反向极性的那些。也可包括各种盐、混合盐及游离酸形式。在本发明的一些实施方案中，本发明的 dsrna剂是游离酸形式。在本发明的其他实施方案中，本发明的dsrna 剂是盐形式。在一个实施方案中，本发明的dsrna剂是钠盐形式。在某些实施方案中，当本发明的dsrna剂是钠盐形式时，钠离子可作为该剂中存在的基本所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子而存在于该剂中。其中基本所有磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键都具有钠抗衡离子的剂包含不超过5、4、3、2或1个没有钠抗衡离子的磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，当本发明的dsrna剂是钠盐形式时，钠离子可作为该剂中存在的所有磷酸二酯基团和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子而存在于该剂中。
[0291]
教导制备上述含磷键合的代表性美国专利包括但不限于，美国专利第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243 号、第5,177,195号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019 号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676 号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677 号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,316 号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第6,028,188号、第6,124,445号、第6,160,109号、第 6,169,170号、第6,172,209号、第6,239,265号、第6,277,603号、第 6,326,199号、第6,346,614号、第6,444,423号、第6,531,590号、第 6,534,639号、第6,608,035号、第6,683,167号、第6,858,715号、第 6,867,294号、第6,878,805号、第7,015,315号、第7,041,816号、第 7,273,933号、第7,321,029号、以及美国专利re39464，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0292]
其中不包括磷原子的经修饰的rna主链具有通过短链烷基或环烷基的核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基的核苷间键合、或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间键合形成的主链。这些主链包括具有吗啉键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基及硫代甲酰乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸盐及磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合了n、o、s及ch2组成成分的其他主链。
[0293]
教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于，美国专利第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134 号、第5,216,141号、第5,235,033号、第
5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第 5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第 5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第 5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、和第 5,677,439号，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0294]
合适的rna模拟物预期可用于本文提供的irna中，其中核苷酸单元的糖及核苷间键合即主链均被替换为新基团。碱基单元维持不变以便与适当的核酸靶标化合物杂交。一种此类寡聚化合物被称为肽核酸(pna)，其中的rna模拟物已经显示出具有优异杂交特性。在pna 化合物中，rna的糖主链被替换为含有酰胺的主链，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基得以保留，且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备pna化合物的代表性美国专利包括但不限于，美国专利第5,539,082号、第5,714,331号、及第5,719,262号，每个专利的全部内容通过引用并入本文。适用于本发明的irna中的其他 pna化合物描述于，例如，nielsen et al.,science,1991,254,1497-1500 中。
[0295]
本发明提出的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的rna 以及具有杂原子主链的寡核苷，尤其是上文引用的美国专利第 5,489,677号的
‑‑
ch2‑‑
nh
‑‑
ch
2-、
‑‑
ch2‑‑
n(ch3)
‑‑o‑‑
ch2‑‑
[被称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链]、
‑‑
ch2‑‑o‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2‑‑
、
ꢀ‑‑
ch2‑‑
n(ch3)
‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2‑‑
和
‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2‑‑
ch2‑‑
[其中，原生磷酸二酯主链表示为
‑‑o‑‑
p
‑‑o‑‑
ch2‑‑
]，以及上文引用的美国专利第 5,602,240号的酰胺主链。在一些实施方案中，本文提出的rna具有上文引用的美国专利第5,034,506号的吗啉基主链结构。
[0296]
经修饰的rna还可含有一个或多个取代的糖部分。本文提出的irna，例如dsrna，可在2
′
位置处包含下述之一：oh；f；o-、s
‑ꢀ
或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中该烷基、烯基及炔基可以是经取代的或未经取代的c1至c
10
烷基或 c2至c
10
烯基和炔基。合适的示例性修饰包括o[(ch2)no]mch3、 o(ch2).
n och3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2、和o(ch2)
n on[(ch2)nch3)]2，其中n和m为1至约10。在另一实施方案中，dsrna 在2
′
位置处包含下述之一：c1至c
10
低碳数烷基、取代的低碳数烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、 cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅烷基、rna 裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善irna的药物动力学特性的基团、或用于改善irna的药效动力学特性的基团、以及其他具有类似特性的取代基团。在一些实施方案中，修饰包括2
′
甲氧基乙氧基 (2
′‑o‑‑
ch2ch2och3，也被称为2
′‑
o-(2-甲氧基乙基)或2
′‑
moe)(martin etal.,helv.chim.acta,1995,78：486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰是2
′‑
二甲基氨基氧基乙氧基，即，o(ch2)2on(ch3)2基团，也被称为2
′‑
dmaoe，如下文实施例中所述；以及2
′‑
二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也被称为2
′‑
o-二甲基氨基乙氧基乙基或 2
′‑
dmaeoe)，即，2
′‑o‑‑
ch2‑‑o‑‑
ch2‑‑
n(ch2)2。更多的示例性修饰包括：5
′‑
me-2
′‑
f核苷酸、5
′‑
me-2
′‑
ome核苷酸、5
′‑
me-2
′‑
脱氧核苷酸(在这三个家族中的r异构体和s异构体)；2
′‑
烷氧基烷基；以及2
′‑
nma(n
‑ꢀ
甲基乙酰胺)。
[0297]
其他修饰包括2
′‑
甲氧基(2
′‑
och3)、2
′‑
氨基丙氧基 (2
′‑
och2ch2ch2nh2)及2
′‑
氟基(2
′‑
f)。也可在irna的rna的其他位置进行类似的修饰，尤其是3
′
末端核苷酸的糖的3
′
位置或在2
′‑5′
连接的 dsrna中以及5
′
末端核苷酸的5
′
位置。irna还可具有替代呋喃戊糖基
糖的糖模拟物如环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于，美国专利第4,981,957号、第5,118,800号、第 5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第 5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第 5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第 5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第 5,670,633号、第5,610,289号、第5,700,920号、第5,623,070号、第 5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、及第5,677,439号，其中一些为与本技术所共有的，前述每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0298]
irna还可包括核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，例如脱氧-胸腺嘧啶(dt)、5-甲基胞嘧啶(5-me-c)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5
‑ꢀ
丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、 8-羟基及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代尤其是5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤及7-甲基腺嘌呤； 8-氮杂鸟嘌呤及8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤及7-脱氮腺嘌呤；以及3
‑ꢀ
脱氮鸟嘌呤及3-脱氮腺嘌呤。更多的核碱基包括在美国专利第3,687,808 号中公开的那些、modified nucleosides in biochemistry,biotechnologyand medicine,herdewijn,p.ed.wiley-vch,2008)中公开的那些、theconcise encyclopedia of polymer science and engineering,pages 858-859,kroschwitz,j.l,ed.john wiley&sons,1990)中公开的那些、 englisch et al.,angewandte chemie,international edition,1991,30,61公开的那些、以及sanghvi,y s.,chapter 15,dsrna research andapplications,pages 289-302,crooke,s.t.and lebleu,b.,ed.,crc press, 1993中公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明提出的寡聚化合物的结合亲和力尤其有用。这些核碱基包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及n-2、n-6及o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示出将核酸双链体的稳定性提高0.6℃至1.2℃(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.andlebleu,b.,eds.,dsrna research and applications,crc press,bocaraton,1993,pp.276-278)，并且是示例性的碱基取代，尤其是当与2
′‑o‑ꢀ
甲氧基乙基糖修饰结合时尤甚。
[0299]
教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于，上面提到的美国专利第3,687,808 号、第4,845,205号、第5,130,30号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第 5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第 5,681,941号、第5,750,692号、第6,015,886号、第6,147,200号、第 6,166,197号、第6,222,025号、第6,235,887号、第6,380,368号、第 6,528,640号、第6,639,062号、第6,617,438号、第7,045,610号、第 7,427,672号、和第7,495,088号，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0300]
irna的rna还可被修饰以包括一个或多个锁核酸(lna)。锁核酸是具有经修饰的核
糖部分的核苷酸，其中的核糖部分包含连接 2
′
碳与4
′
碳的额外的桥。这一结构有效地将该核糖“锁定”在3
′‑
内部结构构象中。已经显示将锁核酸加至sirna中可增加血清中sirna的稳定性，并可降低脱靶效应(elmen,j.et al.,(2005)nucleic acids research 33(1)：439-447；mook,or.et al.,(2007)mol canc ther 6(3)：833843； grunweller,a.et al.,(2003)nucleic acids research 31(12)：3185-3193)。
[0301]
在一些实施方案中，irna的rna还可被修饰以包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过两个原子的桥接而修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“bna”)是具有糖部分的核苷，该糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环的环系统的。在某些实施方案中，桥连接糖环的4
′
碳与2
′
碳。因此，在一些实施方案中，本发明的剂可包括一个或多个锁核酸(lna)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中的核糖部分包含连结2
′
碳与4
′
碳的额外的桥。换言之，lna 是包含双环糖部分的核苷酸，其中的双环糖部分包含4
′‑
ch
2-o-2
′
桥。这一结构有效地将核糖“锁定”在3
′‑
内结构构象中。已经显示将锁核酸加至sirna中可增加血清中sirna的稳定性，并可降低脱靶效应 (elmen,j.et al.,(2005)nucleic acids research 33(1)：439-447；mook,or. et al.,(2007)mol canc ther 6(3)：833843；grunweller,a.et al.,(2003) nucleic acids research 31(12)：3185-3193)。用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包括但不限于，在4
′
核糖基环原子与2
′
核糖基环原子间的包含桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的反义多核苷酸剂包括一个或多个双环核苷，所述双环核苷包含4
′
至2
′
桥。此类4
′
至2
′
桥接的双环核苷的实例包括但不限于，4
′‑
(ch2)—o-2
′
(lna)；4
′‑
(ch2)—s-2
′
； 4
′‑
(ch2)2—o-2
′
(ena)；4
′‑
ch(ch3)—o-2
′
(也被称为“限制性乙基”或“cet”)和4
′‑
ch(ch2och3)—o-2
′
(及其类似物；参见，例如，美国专利第7,399,845号)；4
′‑
c(ch3)(ch3)—o-2
′
(及其类似物；参见，例如，美国专利第8,278,283号)；4
′‑
ch2—n(och3)-2
′
(及其类似物；参见，例如，美国专利第8,278,425号)；4
′‑
ch2—o—n(ch3)-2
′
(参见，例如，美国专利公开案第2004/0171570号)；4
′‑
ch2—n(r)—o-2
′
，其中r是h、 c1-c12烷基、或保护基团(参见，例如，美国专利第7,427,672号)； 4
′‑
ch2—c(h)(ch3)-2
′
(参见，例如，chattopadhyaya et al.,j.org.chem., 74,118-134)；以及4
′‑
ch2—c(
═
ch2)-2
′
(及其类似物；参见，例如，美国专利第8,278,426号)。前述各项的全部内容通过引用并入本文。
[0302]
教导制备锁核酸核苷酸的其他代表性美国专利及美国专利公开包括但不限于以下：美国专利第6,268,490号、第6,525,191号、第 6,670,461号、第6,770,748号、第6,794,499号、第6,998,484号、第 7,053,207号、第7,034,133号、第7,084,125号、第7,399,845号、第 7,427,672号、第7,569,686号、第7,741,457号、第8,022,193号、第 8,030,467号、第8,278,425号、第8,278,426号、第8,278,283号、us2008/0039618、及us 2009/0012281，前述各项的全部内容通过引用并入本文。
[0303]
可制备具有一种或多种立体化学糖构型，包括，例如α-l-呋喃核糖及β-d-呋喃核糖(参见，wo 99/14226)的任何前述双环核苷。
[0304]
irna的rna还可被修饰以包括一个或多个限制性乙基核苷酸。如本文所用，“限制性乙基核苷酸”或“cet”是包含双环糖部分的锁核酸，其中该双环糖部分包含4
′‑
ch(ch3)-o-2
′
桥。在一个实施方案中，限制性乙基核苷酸是s构象，在本文中被称为“s-cet”。
[0305]
本发明的irna还可被修饰以包括一个或多个“构象限制性核苷酸”(“crn”)。crn是具有连接核糖的c2
′
碳与c4
′
碳或核糖的c3 碳与c5
′
碳的接头的核苷酸类似物。crn将该核
糖锁定为稳定的构象，并增加了其对mrna的杂交亲和力。该接头足够长以将氧置于最佳的位置以获得稳定性和亲和力，从而减少核糖环的起皱(puckering)。
[0306]
教导制备上述crn的代表性专利公布包括但不限于，美国专利公布2013/0190383及pct公布wo 2013/036868，其各自的全部内容通过引用并入本文。
[0307]
在一些实施方案中，本发明的irna包含一个或多个为 una(未锁核酸)核苷酸的单体。una是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一实例中，una还包括c1
′‑
c4
′
键(即，c1
′
碳与c4
′
碳之间的碳-氧-碳共价键)已被去除的单体。在另一实例中，糖的c2
′‑
c3
′
键(即，c2
′
碳与c3
′
碳之间的碳-碳共价键)已被去除(参见，nuc.acids symp.series,52,133-134(2008)和fluiter etal.,mol.biosyst.,2009,10,1039，通过引用并入本文)。
[0308]
教导制备una的代表性美国专利公布包括但不限于，美国专利第8,314,227号及美国专利公布2013/0096289、2013/0011922、和 2011/03130200，其各自的全部内容通过引用并入本文。
[0309]
潜在的对rna分子末端的稳定化修饰可包括n-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-nhac)、n-(己酰基-4-羟基脯氨醇 (hyp-c6)、n-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(hyp-nhac)、胸腺嘧啶-2
′‑
0-脱氧胸腺嘧啶(醚)、n-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-氨基)、2-二十二酰基-尿苷-3"-磷酸、倒置碱基dt(idt)等。这一修饰的公开可见于pct公布wo 2011/005861中。
[0310]
本发明的irna的核苷酸的其他修饰包括5
′
磷酸或5
′
磷酸模拟物，例如位于irna剂的反义链的5
′
末端磷酸或磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物公开于例如美国专利公布2012/0157511中，其全部内容通过引用并入本文。
[0311]
a.本发明的包含模体的经修饰的irna
[0312]
在本发明的某些方面，本发明的双链rna剂包括具有如例如 wo2013/075035中所公开的化学修饰的剂，该公布的各项的全部内容通过引用并入本文。wo2013/075035提供了dsrnai剂的有义链或反义链中位于三个连续核苷酸的三个相同的修饰模体，尤其是在裂解位点处或邻近裂解位点处。在一些实施方案中，dsrnai剂的有义链和反义链可以被完全修饰。这些模体的引入中断了有义链或反义链的修饰模式 (如果存在)。dsrnai剂可任选地与galnac衍生物配体缀合，例如在有义链上。
[0313]
更具体地，当双链rna剂的有义链和反义链被完全修饰以在 dsrnai剂的至少一条链的裂解位点处或邻近裂解位点处具有一个或多个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的模体时，观察到了dsrnai 剂的基因沉默活性。
[0314]
因此，本发明提供了能在体内抑制靶标基因(即，apoc3基因) 的表达的双链rna剂。rnai剂包含有义链和反义链。rnai剂的每一条链可具有，例如，17至30个核苷酸的长度、25至30个核苷酸的长度、27至30个核苷酸的长度、19至25个核苷酸的长度、19至23个核苷酸的长度、19至21个核苷酸的长度、21至25个核苷酸的长度、或21至23个核苷酸的长度。
[0315]
有义链和反义链通常形成双链体双链rna(“dsrna”)，在本文中也被称为“dsrnai剂”。dsrnai剂的双链体区域可具有，例如，双链体区域可具有27至30个核苷酸对的长度；19至25个核苷酸对的长度；19至23个核苷酸对的长度；19至21个核苷酸对的长度；21至 25个核苷酸对的长度；或21至23个核苷酸对的长度。在另一实例中，该双链体区域的长度选自
19、20、21、22、23、24、25、26及27个核苷酸。
[0316]
在某些实施方案中，dsrnai剂可含有位于一条链或两条链的 3
′
端、5
′
端或两端的一个或多个突出区域或封端基团。突出可独立地为1 至6个核苷酸的长度，例如，2至6个核苷酸的长度、1至5个核苷酸的长度、2至5个核苷酸的长度、1至4个核苷酸的长度、2至4个核苷酸的长度、1至3个核苷酸的长度、2至3个核苷酸的长度、或1至 2个核苷酸的长度。在某些实施方案中，突出区域可包括上文提供的延伸的突出区域。突出可以是一条链比另一条链长的结果，或是相同长度的两条链错开的结果。突出可与靶标mrna形成错配，或其可与作为靶标的基因序列互补或可以是另一序列。第一条链与第二条链也可以连接，例如通过另外的碱基以形成发夹，或通过其他非碱基接头。
[0317]
在某些实施方案中，dsrnai剂的突出区域中的核苷酸可各自独立地为经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于，2
′‑
糖修饰，例如 2
′‑
f、2
′‑
o-甲基、胸苷(t)、2
′‑
o-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(teo)、2
′‑
o-甲氧基乙基腺苷(aeo)、2
′‑
o-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5ceo)、及其任意组合。
[0318]
例如，tt可以是任一条链的任一端的突出序列。突出可与靶标mrna形成错配，或其可与作为靶标的基因序列互补或可以是另一序列。
[0319]
dsrnai剂的有义链、反义链或两条链的5
′
突出或3
′
突出可被磷酸化。在一些实施方案中，一个或多个突出区域含有两个核苷酸且在该两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯，其中，两个核苷酸可以相同或相异。在一些实施方案中，突出存在于有义链、反义链或两条链的3
′
端。在一些实施方案中，该3
′
突出存在于反义链。在一些实施方案中，该3
′
突出存在于有义链。
[0320]
dsrnai剂可仅含有单个突出，该突出可强化rnai剂的干扰活性而不影响其整体稳定性。例如，单链突出可位于有义链的3
′
端，或者位于反义链的3
′
端。rnai剂也可具有钝端，位于反义链的5
′
端(或有义链的3
′
端)，反之亦然。通常，dsrnai剂的反义链具有位于3
′
端的核苷酸突出，且5
′
端是钝端。尽管不希望受缚于理论，但反义链5
′
末端的不对称钝端以及反义链的3
′
端突出有助于将引导链加载至risc过程中。
[0321]
在某些实施方案中，dsrnai剂是19个核苷酸长度的双端钝体，其中，有义链含有至少一个位于从5
′
端起的7、8、9位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
f修饰的模体。反义链含有至少一个位于从5
′
端起的 11、12、13位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
o-甲基修饰的模体。
[0322]
在其他实施方案中，dsrnai剂是20个核苷酸长度的双端钝体，其中，有义链含有至少一个位于从5
′
端起的8、9、10位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
f修饰的模体。反义链含有至少一个位于从5
′
端起的11、12、13位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
o-甲基修饰的模体。
[0323]
在其他实施方案中，dsrnai剂是21个核苷酸长度的双端钝体，其中，有义链含有至少一个位于从5
′
端起的9、10、11位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
f修饰的模体。反义链含有至少一个位于从5
′
端起的11、12、13位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
o-甲基修饰的模体。
[0324]
在某些实施方案中，dsrnai剂包含21个核苷酸的有义链及 23个核苷酸的反义链，其中，有义链含有至少一个位于从5
′
端起的9、10、11位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
f修饰的模体；反义链含有至少一个位于从5
′
端起的11、12、13位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑o‑ꢀ
甲基修饰的模体，其中，rnai剂的一端是钝端而另一端包含2个核苷酸的突出。优选
地，该2个核苷酸的突出位于反义链的3
′
端。
[0325]
当所述2个核苷酸的突出位于反义链的3
′
端时，在末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代硫酸酯核苷酸间键合，其中三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，且第三个核苷酸是紧邻突出核苷酸的成对核苷酸。在一个实施方案中，rnai剂在有义链的5
′
端和反义链的5
′
端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在某些实施方案中，dsrnai剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为模体的一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，每个残基均独立地在例如交替模体中被2
′‑
o-甲基或3
′‑
氟基修饰。任选地， dsrnai剂还包含配体(优选galnac3)。
[0326]
在某些实施方案中，dsrnai剂包含有义链和反义链，其中，有义链为25至30个核苷酸残基的长度，其中，从5
′
末端核苷酸(位置 1)开始，第一条链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链为 36至66个核苷酸残基的长度，且从3
′
末端核苷酸开始，与有义链的位置1至23配对以形成双链体的那些位置包含至少8个核糖核苷酸；其中，至少反义链的3
′
末端核苷酸未与有义链配对，且最多达6个连续的 3
′
末端核苷酸未与有义链配对，从而形成1至6个核苷酸的3
′
单链突出；其中，反义链的5
′
末端包含未与有义链配对的10至30个连续核苷酸，从而形成10至30个核苷酸的单链5
′
突出；其中，当将有义链与反义链对齐以达到最大互补性时，至少有义链的5
′
末端和3
′
末端的核苷酸与反义链的核苷酸进行碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上是双链体的区域；并且，反义链在沿着反义链的至少19个核苷酸的长度与靶标rna是充分互补的，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞内时降低靶标基因的表达；并且，其中，有义链含有至少一个位于三个连续核苷酸的三个2
′‑
f修饰的模体，其中，至少一个模体出现在裂解位点或邻近该裂解位点处。反义链含有至少一个位于裂解位点或邻近该裂解位点处的三个连续核苷酸的三个2
′‑
o-甲基修饰的模体。
[0327]
在某些实施方案中，dsrnai剂包含有义链和反义链，其中，rnai剂包含长度为至少25个且最多29个核苷酸的第一条链，以及长度为最多30个核苷酸且具有至少一个位于从5
′
端起的11、12、13位置的三个连续核苷酸的三个2
′‑
o-甲基修饰的模体的第二链；其中，第一条链的3
′
端及第二链的5
′
端形成钝端，且第二链在其3
′
端比第一条链长 1至4个核苷酸，其中，双链体区域的长度为至少25个核苷酸，且第二链在沿着第二链的至少19个核苷酸的长度与靶标rna是充分互补的，以在将rnai剂引入哺乳动物细胞内时降低靶标基因的表达，并且，其中，dsrnai剂的切丁酶裂解优先产生包含第二链的3
′
端的 sirna，从而降低了哺乳动物体内的靶标基因的表达。任选地，dsrnai 剂还包含配体。
[0328]
在某些实施方案中，dsrnai剂的有义链含有至少一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体，其中一个模体出现在有义链的裂解位点处。
[0329]
在某些实施方案中，dsrnai剂的反义链也可含有至少一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体，其中一个模体出现在反义链的裂解位点或邻近该裂解位点处。
[0330]
对于长度为19至23个核苷酸的双链体区域的dsrnai剂，反义链的裂解位点通常位于从5
′
端起的位置10、11、12附近。因此，具有三个相同修饰的模体可出现在反义链的位置9、10、11，位置10、11、 12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，从反义链的5
′
端的第一个核苷酸开始计数，或在双链体区域内从反义链的5
′
端的第一个成对核苷酸开始计数。反义链的裂解位点也可根据dsrnai 从5
′
端起的双链体区域的长度而改变。
[0331]
dsrnai剂的有义链可含有至少一个位于该链的裂解位点处的三个连续核苷酸的
三个相同修饰的模体；且反义链可具有至少一个位于该链的裂解位点或邻近该裂解位点处的三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体。当有义链和反义链形成dsrna双链体时，有义链和反义链可如此对齐，使得位于有义链的一个三核苷酸的模体与位于反义链的一个三核苷酸的模体具有至少一个核苷酸重叠，即，有义链中模体的三个核苷酸的至少一个与反义链中模体的三个核苷酸的至少一个形成碱基配对。或者，至少两个核苷酸可重叠，或全部三个核苷酸都可重叠。
[0332]
在一些实施方案中，dsrnai剂的有义链可含有超过一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体。第一模体可出现在该链的裂解位点或邻近该裂解位点处，而其他模体可以是翼修饰。本文中，术语“翼修饰(wing modification)”在本文中是指出现在该链的另一部分的与位于同一条链的裂解位点或邻近该裂解位点处的模体分隔开来的模体。翼修饰或与第一模体相邻或被至少一个或多个核苷酸与第一模体分隔开。当模体彼此紧邻时，则这些模体的化学性彼此不同；而当模体被一个或多个核苷酸分隔开时，则化学性质可相同或相异。可存在两个或多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可出现在相对于位于裂解位点或邻近该裂解位点处的第一模体的一端，或出现在主模体 (lead motif)的任一侧。
[0333]
与有义链相似，dsrnai剂的反义链可含有超过一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体，且至少一个模体出现在该链的裂解位点或邻近该裂解位点处。该反义链还可含有一个或多个翼修饰，该翼修饰的对齐方式类似于可以存在于有义链的翼修饰。
[0334]
在一些实施方案中，dsrnai剂的有义链或反义链的翼修饰通常不包括位于该链的3
′
端、5
′
端或两端的第一个或前两个末端核苷酸。
[0335]
在其他实施方案中，dsrnai剂的有义链或反义链的翼修饰通常不包括位于该链的3
′
端、5
′
端或两端的双链体区域内的第一个或前两个已配对的核苷酸。
[0336]
当dsrnai剂的有义链和反义链各含有至少一个翼修饰时，该翼修饰可落入双链体区域的相同末端，且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
[0337]
当dsrnai剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链与反义链可如此对齐，使得来自一条链的两个修饰各自落入双链体区域的一端且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；来自一条链的两个修饰各自落入双链体区域的另一端且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一条链的两个修饰分别落入主模体的两端且在双链体区域内具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
[0338]
在一些实施方案中，dsrnai剂的有义链和反义链中的每一个核苷酸，包括作为模体的一部分的核苷酸，都可以是经修饰的。每个核苷酸可通过相同或不同的修饰而被修饰，所述修饰可包括一个或两个非链接的磷酸氧或一个或多个链接的磷酸氧的一种或多种改变；核糖成分的改变，如核糖上2
′‑
羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模替换磷酸部分；天然碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸主链的替换或修饰。
[0339]
由于核酸是亚单元的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，如，碱基、磷酸部分、或磷酸部分的非链接的o的修饰。在一些情形中，修饰将发生在该核酸的所有主体位置，但在多数情形中并非如此。例如，修饰可仅发生在3
′
或5
′
末端位置，可仅发生在末端区域，例如，出现在末端核苷酸的位置或出现在一条链的最后2、3、4、5或 10个核苷酸的位置。修饰可发生在双链区域、单链区域、或两者。修饰可仅发生在rna的双链区域，或仅发生在
rna的单链区域。例如，位于非链接的o位置的硫代磷酸修饰可仅发生在一个末端或两个末端；可仅发生在末端区域，例如发生在末端核苷酸的位置或发生在一条链的最后2、3、4、5或10个核苷酸的位置；或可发生在双链区域及单链区域，尤其是在末端。5
′
端或两个末端可被磷酸化。
[0340]
例如，为了增强稳定性，可以在突出中包括特定的碱基，或在单链突出如5
′
突出或3
′
突出或两者中包括经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出中包括嘌呤核苷酸是可取的。在一些实施方案中，可以例如利用本文所述的修饰，来对3
′
或5
′
突出中的全部或一些碱基进行修饰。修饰可包括，例如，在核糖的2
′
位置使用本领域已知的修饰，例如使用2
′‑
脱氧-2
′‑
氟(2
′‑
f)或2
′‑
o-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸来替代核碱基的核糖，以及使用磷酸基团的修饰如硫代磷酸修饰。突出无需与靶标序列同源。
[0341]
在一些实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地通过 lna、crn、cet、una、hna、cena、2
′‑
甲氧基乙基、2
′‑
o-甲基、 2
′‑
o-烯丙基、2
′‑
c-烯丙基、2
′‑
脱氧、2
′‑
羟基或2
′‑
氟基来修饰。这些链可含有超过一个的修饰。在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地通过2
′‑
o-甲基或2
′‑
氟基来修饰。
[0342]
有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2
′‑
o-甲基或2
′‑
氟基修饰，或其他修饰。
[0343]
在某些实施方案中，na或nb包含交替模式的修饰。如本文所用，术语“交替模体”是指具有一个或多个修饰的模体，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔三个核苷酸一个或类似的模式。例如，如果a、b和c分别代表对核苷酸的一种类型的修饰，则交替模体可以是“abababababab
…”
、“aabbaabbaabb
…”
、“aabaabaabaab
…”
、“aaabaaabaaab
…”
、“aaabbbaaabbb
…”
或“abcabcabcabc
…”
等。
[0344]
交替模体中含有的修饰的类型可以相同或不同。例如，如果 a、b、c、d分别代表对核苷酸的一种类型的修饰，则交替模体，即每隔一个核苷酸的修饰可以是相同的，但有义链或反义链可各自选自交替模体内的几种可能的修饰，例如“ababab
…”
、“acacac
…”
、“bdbdbd
…”
或“cdcdcd
…”
等。
[0345]
在一些实施方案中，本发明的dsrnai剂包含有义链的交替模体的修饰模式，其相对于反义链的交替模体的修饰模式是偏移的。这种偏移可使得有义链的核苷酸的修饰基团与反义链的核苷酸的不同修饰基团相对应，反之亦然。例如，当有义链与反义链在dsrna双链体中配对时，在双链体区域内，有义链的交替模体可从该链的5
′
至3
′
以“ababab”开始，且反义链的交替模体可从该链的5
′
至3
′
以“bababa”开始。作为另一实例，在双链体区域内，有义链的交替模体可从该链的5
′
至3
′
以“aabbaabb”开始，且反义链的交替模体可从该链的5
′
至3
′
以“bbaabbaa”开始，因此有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分的偏移。
[0346]
在一些实施方案中，dsrnai剂包含有义链的2
′‑
o-甲基修饰与 2
′‑
f修饰的交替模体的初始模式，该模式具有相对于反义链的2
′‑
o-甲基修饰与2
′‑
f修饰的交替模体的初始模式的位移，即，有义链的2
′‑o‑ꢀ
甲基修饰的核苷酸与反义链的2
′‑
f修饰的核苷酸进行碱基配对，反之亦然。有义链的位置1可从2
′‑
f修饰开始，且反义链的位置1可从2
′‑o‑ꢀ
甲基修饰开始。
[0347]
将一个或多个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体引入有义链或反义链，中断了有义链或反义链中存在的初始修饰模式。通过将一个或多个位于三个连续核苷酸的
三个相同修饰的模体引入有义链或反义链而中断有义链或反义链的修饰模式，可增强对于靶标基因的基因沉默活性。
[0348]
在一些实施方案中，在将位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体引入任一条链中时，与模体相邻的核苷酸的修饰是与该模体的修饰不同的修饰。例如，含有模体的序列部分是
“…
nayyynb…”
，其中，“y”代表位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体，且“n
a”及“n
b”代表与模体“yyy”相邻的核苷酸的修饰，其不同于y的修饰，并且其中na与nb可以是相同或不同的修饰。或者，当存在翼修饰时，na或nb可存在或不存在。
[0349]
irna还可包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键合。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰可出现在有义链或反义链或双链的位于该链任意位置的任意核苷酸上。例如，核苷酸间键合修饰可出现在有义链或反义链的每一个核苷酸上；每个核苷酸间键合修饰可以以交替模式出现在有义链或反义链上；或有义链或反义链可包含交替模式的两种核苷酸间键合修饰。有义链的交替模式的核苷酸间键合修饰可与反义链相同或相异，其有义链的交替模式的核苷酸间键合修饰相对于反义链的交替模式的核苷酸间键合修饰可具有偏移。在一个实施方案中，双链rnai剂包含6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一些实施方案中，反义链包括位于5
′
端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合以及位于3
′
端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合，且有义链包含位于5
′
端或 3
′
端的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0350]
在一些实施方案中，dsrna剂包含位于突出区域内的硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰。例如，突出区域可含有两个核苷酸且在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。核苷酸间键合修饰也可将突出核苷酸与双链体区域内的末端已配对核苷酸连接起来。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可通过硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合而连接，且任选地，可存在连接突出核苷酸与紧邻该突出核苷酸的已配对核苷酸的另外的硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代硫酸酯核苷酸间键合，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，且第三个核苷酸是紧邻该突出核苷酸的已配对核苷酸。这些末端三个核苷酸可位于反义链的3
′
端、有义链的3
′
端、反义链的5
′
端或有义链的5
′
端。
[0351]
在一些实施方案中，2-核苷酸的突出位于反义链的3
′
端，且在末端三个核苷酸之间存在两个硫代硫酸酯核苷酸间键合，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，且第三个核苷酸是紧邻该突出核苷酸的已配对核苷酸。任选地，dsrnai剂可在有义链的5
′
端和反义链的5
′
端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0352]
在一个实施方案中，dsrnai剂包含与靶标的一个或多个错配、双链体中的一个或多个错配、或其组合。错配可出现在突出区域中或双链体区域中。可基于碱基对促进解离或解链的倾向性将碱基对排序 (例如，基于特定配对的结合自由能或解离自由能，最简单的手段是在单个配对的基础上来检查该配对，尽管也可使用相邻分析或类似分析)。就促进解离而言：a：u优于g：c；g：u优于g：c；且i：c 优于g：c(i＝肌苷)。错配如非典型配对或除典型配对之外的配对(如在本文中他处所描述)优于典型的(a：t、a：u、g：c)配对；且包括通用碱基的配对优于典型的配对。
[0353]
在某些实施方案中，dsrnai剂包含，位于双链体区域内的从反义链5
′
端起的前1、
2、3、4或5个碱基对中的至少一个，所述碱基对独立地选自以下的组：a：u、g：u、i：c、以及错配的对例如非典型配对或除典型配对之外的配对或包括通用碱基的配对，以促进反义链在双链体5
′
末端的解离。
[0354]
在某些实施方案中，位于双链体区域内的从反义链5
′
端起的位置1的核苷酸选自a、da、du、u和dt。或者，位于双链体区域内的从反义链5
′
端起的前1、2或3个碱基对中的至少一个是au碱基对。例如，位于双链体区域内的从反义链5
′
端起的第一个碱基对是au碱基对。
[0355]
在其他实施方案中，位于有义链的3
′
端的核苷酸是脱氧胸苷 (dt)，或位于反义链的3
′
端的核苷酸是脱氧胸苷(dt)。例如，在有义链、反义链或双链的3
′
端存在脱氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，两个 dt核苷酸。
[0356]
在某些实施方案中，有义链序列可由式(i)来表示：
[0357]5′np-n
a-(xxx)i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q 3
′ꢀꢀꢀ(i)[0358]
其中：
[0359]
i和j各自独立地为0或1；
[0360]
p和q各自独立地为0至6；
[0361]
每个na独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同的经修饰的核苷酸；
[0362]
每个nb独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0363]
每个n
p
与nq独立地表示突出核苷酸；
[0364]
其中，nb和y不具有相同的修饰；并且
[0365]
xxx、yyy和zzz各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的模体。优选地，yyy全部为2
′‑
f修饰的核苷酸。
[0366]
在一些实施方案中，na或nb包含交替模式的修饰。
[0367]
在一些实施方案中，yyy模体出现在有义链的裂解位点处或其附近。例如，当dsrnai剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时，yyy模体出现在有义链的裂解位点处(例如，可出现于位置6、 7、8；7、8、9；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)或其附近，从5
′
端的第1个核苷酸开始计数；或任选地，从5
′
端的双链体区域内第一个成对核苷酸开始计数。
[0368]
在一个实施方案中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i 和j均是1。因此，有义链可以以下列式来表示：
[0369]5′np-n
a-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q 3
′ꢀꢀꢀ
(ib)；
[0370]5′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
a-n
q 3
′ꢀꢀꢀ
(ic)；或
[0371]5′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q 3
′ꢀꢀꢀ
(id)。
[0372]
当有义链是以式(ib)表示时，nb表示包含0至10、0至7、0 至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na可独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0373]
当有义链是以式(ic)表示时，nb表示包含0至10、0至7、0 至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na可独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0374]
当有义链是以式(id)表示时，每个nb独立地表示包含0至10、 0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，nb是0、1、2、3、4、5或6。每个na可独立地
表示包含2至 20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0375]
x、y和z中的每一个可以是彼此相同的或不同的。
[0376]
在其他实施方案中，i是0且j是0，且有义链可以以下式来表示：
[0377]5′np-n
a-yyy-n
a-n
q 3
′ꢀꢀꢀ
(ia)。
[0378]
当有义链是以式(ia)表示时，每个na独立地表示包含2至20、 2至15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0379]
在一个实施方案中，rnai的反义链序列可以以式(ii)来表示：
[0380]5′
nq′-na′‑
(z
′z′z′
)k-nb′‑y′y′y′‑
nb′‑
(x
′
x
′
x
′
)l-n
′
a-n
p
′3′
(ii)，
[0381]
其中：
[0382]
k和l各自独立地为0或1；
[0383]
p
′
和q
′
各自独立地为0至6；
[0384]
每个na′
独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同的经修饰的核苷酸；
[0385]
每个nb′
独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0386]
每个n
p
与nq独立地表示突出核苷酸；
[0387]
其中，nb′
和y
′
不具有相同的修饰；并且
[0388]
x
′
x
′
x
′
、y
′y′y′
和z
′z′z′
各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体。
[0389]
在一些实施方案中，na′
或nb′
包含交替模式的修饰。
[0390]y′y′y′
模体出现于反义链的裂解位点处或其附近。例如，当 dsrnai剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时，y
′y′y′
模体出现于该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、 14；或13、14、15，从5
′
端的第1个核苷酸开始计数；或任选地，从 5
′
端的双链体区域内第一个配对核苷酸开始计数。优选地，y
′y′y′
模体出现于位置11、12、13。
[0391]
在某些实施方案中，y
′y′y′
模体全部为2
′‑
ome修饰的核苷酸。
[0392]
在某些实施方案中，k是1且l是0，或k是0且l是1，或k 和l均是1。
[0393]
因此，反义链可以以下列式来表示：
[0394]5′
nq′‑
na′‑z′z′z′‑
nb′‑y′y′y′‑
na′‑np
′3′ꢀꢀꢀ
(iib)；
[0395]5′
nq′‑
na′‑y′y′y′‑
nb′‑
x
′
x
′
x
′‑np
′3′ꢀꢀꢀ
(iic)；或
[0396]5′
nq′-na′‑z′z′z′‑
nb′‑y′y′y′‑
nb′‑
x
′
x
′
x
′‑
na′‑np
′3′ꢀꢀꢀ
(iid)。
[0397]
当反义链是以式(iib)表示时，nb′
表示包含0至10个、0至7 个、0至10个、0至7个、0至5个、0至4个、0至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na′
独立地表示包含2至20、2至15 或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0398]
当反义链是以式(iic)表示时，nb′
表示包含0至10、0至7、0 至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na′
独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0399]
当反义链是以式(iid)表示时，每个nb′
独立地表示包含0至 10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na′
独立地表示包含2至20、2至15或2至 10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，nb是0、1、2、3、4、 5或6。
[0400]
在其他实施方案中，k是0且l是0，且反义链可以以下式来表示：
[0401]5′np
′-na′-y
′y′y′‑
na′-nq′3′ꢀꢀꢀꢀ
(ia)。
[0402]
当反义链是以式(iia)表示时，每个na′
独立地表示包含2至 20、2至15或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。x
′
、y
′
和z
′
的中的每一个可以是彼此相同的或不同的。
[0403]
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地通过lna、crn、 una、cet、hna、cena、2
′‑
甲氧基乙基、2
′‑
o-甲基、2
′‑
o-烯丙基、 2
′‑
c-烯丙基、2
′‑
羟基或2
′‑
氟基来修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地通过2
′‑
o-甲基或2
′‑
氟基来修饰。具体地，x、y、z、x
′
、 y
′
和z
′
可各自表示2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑
氟基修饰。
[0404]
在一些实施方案中，当双链体区域为21nt时，dsrnai剂的有义链可含有出现在该链的位置9、10和11的yyy模体，从5
′
端的第一个核苷酸开始计数，或任选地，从5
′
端的双链体区域内的第一个已配对核苷酸开始计数；并且，y表示2
′‑
f修饰。有义链可另外含有xxx 模体或zzz模体作为位于双链体区域的相对端的翼修饰；并且，xxx 与zzz各自独立地表示2
′‑
ome修饰或2
′‑
f修饰。
[0405]
在一些实施方案中，反义链可含有出现在该链的位置11、12 及13的y
′y′y′
模体，从5
′
端的第一个核苷酸开始计数，或任选地，从 5
′
端的双链体区域内的第一个已配对核苷酸开始计数；并且，y
′
表示 2
′‑
o-甲基修饰。反义链可另外含有x
′
x
′
x
′
模体或z
′z′z′
模体作为位于双链体区域的相对端的翼修饰；并且，x
′
x
′
x
′
与z
′z′z′
各自独立地表示 2
′‑
ome修饰或2
′‑
f修饰。
[0406]
由上述式(ia)、(ib)、(ic)及(id)中的任一个所表示的有义链，分别与由式(iia)、(iib)、(iic)及(iid)中的任一个所表示的反义链形成双链体。
[0407]
因此，用于本发明的方法中的dsrnai剂可包含有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，irna双链体由式(iii)来表示：
[0408]
有义：5
′np-n
a-(xxx)
i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q 3
′
[0409]
反义：3
′np
′‑
na′‑
(x
′
x
′
x
′
)
k-nb′‑y′y′y′‑
nb′‑
(z
′z′z′
)
l-n
′
a-nq′5′
[0410]
(iii)
[0411]
其中：
[0412]
i、j、k和l各自独立地为0或1；
[0413]
p、p
′
、q和q
′
各自独立地为0至6；
[0414]
每个na和na′
独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同的经修饰的核苷酸；
[0415]
每个nb与nb′
独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0416]
其中，每个n
p
′
、n
p
、nq′
和nq可存在或不存在，且独立地表示突出核苷酸；并且
[0417]
xxx、yyy、zzz、x
′
x
′
x
′
、y
′y′y′
和z
′z′z′
各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体。
[0418]
在一个实施方案中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i 是0且j是1；或i和j均是0；或i和j均是1.在另一实施方案中，k 是0且l是0；或k是1且l是0；或k是0且l是1；或k和l均是0；或k和l均是1。
[0419]
形成irna双链体的有义链与反义链的示例性组合包括下述各式：
[0420]5′np
′‑
na′‑y′y′y′‑
na′‑
nq′3′
[0421]3′np-n
a-y
′y′y′‑na-n
q5′
[0422]
(iiia)
[0423]5′np-n
a-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3′
[0424]3′np
′‑
na′‑y′y′y′‑
nb′‑z′z′z′‑
na′‑
nq′5′
[0425]
(iiib)
[0426]5′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
a-n
q3′
[0427]3′np-n
a-x
′
x
′
x
′‑nb-y
′y′y′‑na-n
q5′
[0428]
(iiic)
[0429]5′np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3′
[0430]3′np
′‑
na′‑
x
′
x
′
x
′‑
nb′‑y′y′y′‑
nb′‑z′z′z′‑
na′‑
nq′5′
[0431]
(iiid)
[0432]
当dsrnai剂是以式(iiia)表示时，每个na独立地表示包含2 至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0433]
当dsrnai剂是以式(iiib)表示时，每个nb独立地表示包含1 至10、1至7、1至5或1至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0434]
当dsrnai剂是以式(iiic)表示时，每个nb、nb′
独立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na独立地表示包含2至20、2至15 或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0435]
当dsrnai剂是以式(iiid)表示时，每个nb、nb′
独立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na和na′
独立地表示包含2至20、2 至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。na、na′
、nb和nb′
各自独立地包含交替模式的修饰。
[0436]
式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)中的x、y和z中的每以个可以是彼此相同的或不同的。
[0437]
当dsrnai剂由式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)表示时，y 核苷酸中的至少一个可与y
′
核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，y 核苷酸中的至少两个与相应的y
′
核苷酸形成碱基对；或全部三个y核苷酸与相应的y
′
核苷酸全部形成碱基对。
[0438]
当dsrnai剂由式(iiib)或(iiid)表示时，z核苷酸中的至少一个可与z
′
核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，z核苷酸中的至少两个与相应的z
′
核苷酸形成碱基对；或全部三个z核苷酸与相应的z
′
核苷酸全部形成碱基对。
[0439]
当dsrnai剂由式(iiic)或(iiid)表示时，x核苷酸中的至少一个可与x
′
核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，x核苷酸中的至少两个与相应的x
′
核苷酸形成碱基对；或全部三个x核苷酸与相应的x
′
核苷酸全部形成碱基对。
[0440]
在某些实施方案中，y核苷酸的修饰不同于y
′
核苷酸的修饰， z核苷酸的修饰不同于z
′
核苷酸的修饰，或x核苷酸的修饰不同于x
′
核苷酸的修饰。
[0441]
在某些实施方案中，当dsrnai剂是由式(iiid)表示时，na修饰是2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑
氟基修饰。在其他实施方案中，当rnai剂是由式(iiid)表示时，na修饰是2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑
氟基修饰，且n
p
′
》0，并且至少一个n
p
′
通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在其他实施方案中，当rnai剂是由式(iiid)表示时，na修饰是2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑ꢀ
氟基修饰，n
p
′
》0，
且至少一个n
p
′
通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个galnac衍生物缀合(如下所述)。在其他实施方案中，当rnai剂是由式(iiid)表示时，na修饰是2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑
氟基修饰，n
p
′
》0，且至少一个np
′
通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键合，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个 galnac衍生物缀合。
[0442]
在一些实施方案中，当rnai剂是由式(iiia)表示时，na修饰是2
′‑
o-甲基修饰或2
′‑
氟基修饰，n
p
′
》0，且至少一个np
′
通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键合，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个galnac衍生物缀合。
[0443]
在一些实施方案中，dsrnai剂是含有至少两个由式(iii)、 (iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)表示的双链体的多聚体，其中的双链体通过接头连接。接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可靶向相同基因或两个不同基因；或每个双链体可靶向同一基因的两个不同靶标位点。
[0444]
在一些实施方案中，dsrnai剂是含有3、4、5、6或更多个由式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)表示的双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可靶向相同基因或两个不同基因；或每个双链体可靶向同一基因的两个不同靶标位点。
[0445]
在一个实施方案中，由式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)中的至少一个表示的两个dsrnai剂在5
′
端和一个或两个3
′
端彼此连接，且任选地缀合至配体。每个剂可靶向相同基因或两个不同基因；或每个剂可靶向同一基因的两个不同靶标位点。
[0446]
在某些实施方案中，本发明的rnai剂可含有少量的含有2
′‑ꢀ
氟基修饰的核苷酸，如10个或更少个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。例如， rnai剂可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。在具体实施方案中，本发明的rnai剂含有10个具有2
′‑ꢀ
氟基修饰的核苷酸，例如，在有义链中有4个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸且在反义链中有6个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂含有6个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸，例如，在有义链中有4个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸且在反义链中有2个具有 2
′‑
氟基修饰的核苷酸。
[0447]
在其他实施方案中，本发明的rnai剂可含有极少数的含有 2
′‑
氟基修饰的核苷酸，如2个或更少个含有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。例如，rnai剂可含有2、1或0个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。在具体实施方案中，rnai剂可含有2个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸，例如，在有义链中有0个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸且在反义链中有2个具有2
′‑
氟基修饰的核苷酸。
[0448]
多个出版物描述了可用于本发明的方法中的多聚体irna。此类出版物包括wo2007/091269、美国专利第7,858,769号、 wo2010/141511、wo2007/117686、wo2009/014887和 wo2011/031520，每个出版物的全部内容通过引用并入本文。
[0449]
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法包括本文所述的 rnai剂的乙烯基膦酸酯(vp)修饰。在示例性实施方案中，本公开的乙烯基膦酸酯具有如下结构：
[0450][0451]
本公开的乙烯基膦酸酯可被附接至本公开的dsrna的反义链或有义链中的一条。在某些优选实施方案中，本公开的乙烯基膦酸酯被附接至dsrna的反义链，任选地附接在dsrna的反义链的5
′
端。
[0452]
乙烯基膦酸酯修饰也预期用于本公开的组合物和方法中。示例性乙烯基膦酸酯结构为：
[0453][0454]
如下文中更详细描述的，含有缀合到自身的一个或多个糖类部分的irna可优化该irna的一种或多种特性。在多种情形中，糖类部分将被附接至irna的经修饰的亚单元。例如，irna的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可被替换为另一个部分，如其上附接有糖类配体的非糖类(优选是环状的)载体。在本文中，其中亚单元的核糖已经被如此替换的核糖核苷酸亚单元被称为核糖替换修饰亚单元(rrms)。环状载体可以是碳环环系统，即，所有环原子皆是碳原子；或是杂环环系统，即，一个或多个环原子可以是杂原子，如氮、氧、硫。环状载体可是单环环系统，或可含有两个或多个环，如稠环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可含有一个或多个双键。
[0455]
配体可通过载体附接至多核苷酸。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选两个“主链附接点”，以及(ii)至少一个“连系附接点(tethering attachment point)”。如本文所用，“主链附接点”是指官能团如羟基，或通常是可用于且适用于将载体并入核糖核酸的主链 (如磷酸主链或经修饰的磷酸主链，如含硫的主链)中的键。在一些实施方案中，“连系附接点”(tap)是指连结选定部分的环状载体的构成环原子，例如，碳原子或杂原子(与提供主链附接点的原子截然不同)。该部分可以是例如糖类，如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。任选地，选定部分通过中间连系(intervening tether)而连接至环状载体。因此，环状载体通常将包含官能团例如氨基，或通常提供键，该键适用于将另一化学实体(如配体)并入或连系至构成环。
[0456]
irna可通过载体与配体缀合，其中该载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，该环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基(piperazinyl)、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基(oxazolidinyl)、异噁唑烷基(isoxazolidinyl)、吗啉基、噻唑烷基(thiazolidinyl)、异噻唑烷基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、哒嗪壬基 (pyridazinonyl)、四氢呋喃基及十氢萘；优选地，非环状基团是丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
[0457]
i.热不稳定的修饰
[0458]
在某些实施方案中，可以通过将热不稳定的修饰掺入反义链的种子区域(即，反义链的5
′
端的位置2至9)来优化dsrna分子以用于 rna干扰，从而降低或抑制脱靶基因沉默。
已经发现，具有在从反义链5
′
端计数的前9个核苷酸内包含至少一个双链体的热不稳定的修饰的反义链的dsrna，具有降低的脱靶基因沉默活性。因此，在一些实施方案中，反义链在从其5
′
区域的前9个核苷酸位置内包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定的修饰。在一些实施方案中，双链体的一个或多个热不稳定的修饰是位于从反义链5
′
端计数的位置2至9，或优选为位置4至8。在另一些实施方案中，双链体的热不稳定的修饰是位于从反义链5
′
端计数的位置6、7 或8。在另一些实施方案中，双链体的热不稳定的修饰是位于从反义链 5
′
端计数的位置7。术语“热不稳定的修饰”包括将导致dsrna具有较低的总体解链温度(tm)的修饰(优选地，tm比不具有此类修饰的dsrna 的tm低一度、两度、三度或四度)。在一些实施方案中，双链体的热不稳定的修饰是位于从反义链5
′
端计数的位置2、3、4、5或9。
[0459]
irna剂包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸。rnai剂可由式(l)来表示：
[0460][0461]
在式(l)中，b1、b2、b3、b1
′
、b2
′
、b3
′
和b4
′
各自独立地为含有选自由下列所组成的组的修饰的核苷酸：2
′‑
o-烷基、2
′‑
取代烷氧基、2
′‑
取代烷基、2
′‑
卤基、ena、和bna/lna。在一个实施方案中， b1、b2、b3、b1
′
、b2
′
、b3
′
和b4
′
各自含有2
′‑
ome修饰。在一个实施方案中，b1、b2、b3、b1
′
、b2
′
、b3
′
和b4
′
各自含有2
′‑
ome修饰或2
′‑
f 修饰。在一个实施方案中，b1、b2、b3、b1
′
、b2
′
、b3
′
和b4
′
中的至少一个含有2
′‑
o-n-甲基乙酰氨基(2
′‑
o-nma)修饰。
[0462]
c1是位于与反义链的种子区域(即，反义链的5
′
端的位置2至 8)相对位点的热不稳定的核苷酸。例如，c1位于与反义链的5
′
端的位置2至8的核苷酸配对的有义链的位置。在一个实例中，c1位于有义链的从5
′
端计数的位置15。c1核苷酸带有热不稳定的修饰，其可包括无碱基修饰；与双链体中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰如2
′‑
脱氧修饰或无环核苷酸如未锁核酸(una)或甘油核酸(gna)。在一个实施方案中，c1具有选自由下列所组成的组的热不稳定的修饰：i)与反义链中的相对核苷酸的错配；ii)选自由以下所组成的组的无碱基修饰：
[0463]
以及iii)选自由以下所组成的组的糖修饰：
[0464][0464]
其中，b是经修饰的或未修饰的核碱基，r1和r2独立地为h、卤素、or3或烷基；以及，r3为h、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施方案中，c1中的热不稳定的修饰是选自由g:g、g:a、g:u、g:t、a:a、a:c、c:c、c:u、c:t、u:u、t:t、和u:t所组成的组的错配；且任选地，错配对中的至少一个核碱基是 2
′‑
脱氧核酸碱基。在一个实例中，c1中的热不稳定的修饰是gna或
[0465]
t1、t1
′
、t2
′
和t3
′
各自独立地表示包含修饰的核苷酸，该修饰向核苷酸提供了小于或等于2
′‑
ome修饰的空间体积的空间体积。空间体积是指修饰的空间效应的总和。确定核苷酸的修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可位于核苷酸的核糖的2
′
位置，或是对与该核糖的2
′
位置相似或等同的非核糖核苷酸、无环核苷酸、或核苷酸主链的修饰，且该修饰向核苷酸提供了小于或等于2
′‑
ome修饰的空间体积的空间体积。例如，t1、t1
′
、t2
′
和t3
′
各自独立地选自dna、rna、 lna、2
′‑
f、和2
′‑
f-5
′‑
甲基。在一个实施方案中，t1是dna。在一个实施方案中，t1
′
是dna、rna或lna。在一个实施方案中，t2
′
是 dna或rna。在一个实施方案中，t3
′
是dna或rna。
[0466]
n1、n3和q1独立地为4至15个核苷酸的长度。
[0467]
n5、q3和q7独立地为1至6个核苷酸的长度。
[0468]
n4、q2和q6独立地为1至3个核苷酸的长度；或者，n4是0。
[0469]
q5独立地为0至10个核苷酸的长度。
[0470]
n2和q4独立地为0至3个核苷酸的长度。
[0471]
或者，n4为0至3个核苷酸的长度。
[0472]
在一个实施方案中，n4可以是0。在一个实施方案中，n4是0，且q2和q6是1。在另一实例中，n4是0，且q2和q6是1，并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合修饰，以及位于反义链的位置1和2(从反义链5
′
端计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合修饰和位于反义链的位置18至23的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合修饰。
[0473]
在一个实施方案中，n4、q2和q6各自为1。
[0474]
在一个实施方案中，n2、n4、q2、q4和q6各自为1。
[0475]
在一个实施方案中，当有义链是19至22个核苷酸的长度时， c1位于有义链5
′
端的
位置14至17，且n4是1。在一个实施方案中， c1位于有义链5
′
端的位置15。
[0476]
在一个实施方案中，t3
′
从反义链5
′
端起的位置2开始。在一个实例中，t3
′
位于从反义链5
′
端起的位置2，且q6等于1。
[0477]
在一个实施方案中，t1
′
从反义链5
′
端起的位置14开始。在一个实例中，t1
′
位于从反义链5
′
端起的位置14，且q2等于1。
[0478]
在示例性实施方案中，t3
′
从反义链5
′
端起的位置2开始，且 t1
′
从反义链5
′
端起的位置14开始。在一个实例中，t3
′
从反义链5
′
端起的位置2开始，且q6等于1；并且t1
′
从反义链5
′
端起的位置14开始，且q2等于1。
[0479]
在一个实施方案中，t1
′
与t3
′
被11个核苷酸的长度而分隔开来(即，t1
′
和t3
′
的核苷酸不计算在内)。
[0480]
在一个实施方案中，t1
′
位于从反义链5
′
端起的位置14。在一个实例中，t1
′
位于从反义链的5
′
端起的位置14且q2等于1，并且，位于2
′
位置的修饰或位于非核糖、非环或主链的位置的修饰提供了比 2
′‑
ome核糖更小的空间体积。
[0481]
在一个实施方案中，t3
′
位于从反义链5
′
端起的位置2。在一个实例中，t3
′
位于从反义链5
′
端起的位置2且q6等于1，并且，位于 2
′
位置的修饰或位于非核糖、非环或主链的位置的修饰提供了小于或等于2
′‑
ome核糖的空间体积。
[0482]
在一个实施方案中，t1位于有义链的裂解位点。在一个实例中，当有义链是19至22个核苷酸的长度时，t1位于从有义链5
′
端起的位置11，且n2是1。在示例性实施方案中，当有义链是19至22个核苷酸的长度时，t1位于从有义链5
′
端起的位置11处的裂解位点，且 n2是1。
[0483]
在一个实施方案中，t2
′
从反义链5
′
端起的位置6开始。在一个实例中，t2
′
位于从反义链5
′
端起的位置6至10，且q4是1。
[0484]
在示例性实施方案中，当有义链是19至22个核苷酸的长度时，t1位于有义链的裂解位点，例如，位于从有义链5
′
端起的位置11，且n2是1；t1
′
位于从反义链5
′
端起的位置14，且q2等于1，且t1
′
的修饰位于核糖的2
′
位置或位于非核糖、非环或主链的位置且提供了小于 2
′‑
ome核糖的空间体积；t2
′
位于从反义链5
′
端起的位置6至10，且q4是1；并且，t3
′
位于从反义链5
′
端起的位置2，且q6等于1，并且，t3
′
的修饰位于核糖的2
′
位置或位于非核糖、非环或主链的位置且提供了小于或等于2
′‑
ome核糖的空间体积。
[0485]
在一个实施方案中，t2
′
从反义链5
′
端起的位置8开始。在一个实例中，t2
′
从反义链5
′
端起的位置8开始，且q4是2。
[0486]
在一个实施方案中，t2
′
从反义链5
′
端起的位置9开始。在一个实例中，t2
′
位于从反义链5
′
端起的位置9，且q4是1。
[0487]
在一个实施方案中，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f， q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q3是4、t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome 或2
′‑
f，q5是6，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0488]
在一个实施方案中，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome 或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是6，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18 至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0489]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1。
[0490]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0491]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是6，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是7，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1。
[0492]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是6，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是7，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0493]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是6，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1。
[0494]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是6，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0495]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome
或2
′‑
f， q3是5，t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；任选地，在反义链的3
′
端具有至少2 个额外的tt。
[0496]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是5，t2
′
是2
′‑
f，q4是1，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；任选地，在反义链的3
′
端具有至少2 个额外的tt；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯的核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0497]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1。
[0498]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0499]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。
[0500]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0501]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。
[0502]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及位于反义链的位置18 至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
[0503]
rnai剂可包含位于有义链或反义链的5
′
端的含磷基团。该5
′
端的含磷基团可以是5
′
端磷酸酯(5
′‑
p)、5
′
端硫代磷酸酯(5
′‑
ps)、5
′
端二硫代磷酸酯(5
′‑
ps2)、5
′
端乙烯基膦酸酯(5
′‑
vp)、5
′
端甲基膦酸酯 (mephos)、或5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基当该5
′
端含磷基团是5
′
端乙烯基膦酸酯(5
′‑
vp)时，5
′‑
vp可以是5
′‑
e-vp异构体(即，反式-乙烯基磷酸酯，)、5
′‑
z-vp异构体(即，顺式-乙烯基磷酸酯，)、或其混合物。
[0504]
在一个实施方案中，rnai剂包含位于有义链的5
′
端的含磷基团。在一个实施方案中，rnai剂包含位于反义链的5
′
端的含磷基团。
[0505]
在一个实施方案中，rnai剂包含5
′‑
p。在一个实施方案中，rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
p。
[0506]
在一个实施方案中，rnai剂包含5
′‑
ps。在一个实施方案中， rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
ps。
[0507]
在一个实施方案中，rnai剂包含5
′‑
vp。在一个实施方案中， rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
vp。在一个实施方案中，rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
e-vp。在一个实施方案中，rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
z-vp。
[0508]
在一个实施方案中，rnai剂包含5
′‑
ps2。在一个实施方案中， rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
ps2。
[0509]
在一个实施方案中，rnai剂包含5
′‑
ps2。在一个实施方案中， rnai剂包含位于反义链中的5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基。
[0510]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是5。rnai剂还包含5
′‑
ps。
[0511]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
p。
[0512]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome
是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
vp。5
′‑
vp可以是5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合。
[0528]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps2。
[0529]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基。
[0530]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
p。
[0531]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
ps。
[0532]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
vp。5
′‑
vp可以是 5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合。
[0533]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
ps2。
[0534]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2′‑
f，且q7是1。rnai剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基。
[0535]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
p。
[0536]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps。
[0537]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
vp。5
′‑
vp可以是5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合。
[0538]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps2。
[0539]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基。
[0540]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1。
是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai 剂还包含5
′‑
ps2。
[0549]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai 剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基。
[0550]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
p和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
p位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0551]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps 位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0552]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
vp(例如，5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合) 和靶向配体。
[0553]
在一个实施方案中，5
′‑
vp位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0554]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome
或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps2和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps2位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0555]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0556]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
p和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
p位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0557]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0558]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
vp(例如，5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合)和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
vp位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0559]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是
1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps2和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps2位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0560]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
ome，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从5
′
端起计数) 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2 的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0561]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
p和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
p位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0562]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
ps和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0563]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，t2
′
是2
′‑
f，q4是2，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是5，t3
′
是2
′‑
f， q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai剂还包含5
′‑
vp(例如，5
′‑
e-vp、5
′‑
z-vp、或其组合)和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
vp位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0564]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome
是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai 剂还包含5
′‑
ps2和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
ps2位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0570]
在一个实施方案中，b1是2
′‑
ome或2
′‑
f，n1是8，t1是2
′‑
f， n2是3，b2是2
′‑
ome，n3是7，n4是0，b3是2
′‑
ome，n5是3，b1
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q1是9，t1
′
是2
′‑
f，q2是1，b2
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f， q3是4，q4是0，b3
′
是2
′‑
ome或2
′‑
f，q5是7，t3
′
是2
′‑
f，q6是1，b4
′
是2
′‑
f，且q7是1；并具有位于有义链的位置1至5(从有义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及位于反义链的位置1 和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰及位于反义链的位置18至 23(从反义链5
′
端起计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。rnai 剂还包含5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，5
′‑
脱氧-5
′‑
c-丙二酰基位于反义链的5
′
端，且靶向配体位于有义链的3
′
端。
[0571]
在具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0572]
(a)有义链，其具有：
[0573]
(i)21个核苷酸的长度；
[0574]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；以及
[0575]
(iii)位于位置1、3、5、7、9至11、13、17、19和21的2
′‑
f 修饰，以及位于位置2、4、6、8、12、14至16、18和20的2
′‑
ome 修饰(从5
′
端起计数)；
[0576]
以及
[0577]
(b)反义链，其具有：
[0578]
(i)23个核苷酸的长度；
[0579]
(ii)位于位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21和23的 2
′‑
ome修饰，以及位于位置2、4、6、8、10、14、16、18、20和22 的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0580]
(iii)位于核苷酸位置21与22之间以及位置核苷酸22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5
′
端起计数)；
[0581]
其中所述dsrna剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0582]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0583]
(a)有义链，其具有：
[0584]
(i)21个核苷酸的长度；
[0585]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0586]
(iii)位于位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19和21的 2
′‑
f修饰，以及位于位置2、4、6、8、12、14、16、18和20的2
′‑
ome 修饰(从5
′
端起计数)；
[0587]
以及
[0588]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5
′
端起计数)；
[0589]
以及
[0590]
(b)反义链，其具有：
[0591]
(i)23个核苷酸的长度；
[0592]
(ii)位于位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19和21至23 的2
′‑
ome修饰，以及位于位置2、4、6、8、10、14、16、18及20的 2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0593]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5
′
端起计数)；
[0594]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0595]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0596]
(a)有义链，其具有：
[0597]
(i)21个核苷酸的长度；
[0598]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0599]
(iii)位于位置1至6、8、10和12至21的2
′‑
ome修饰，位于位置7和9的2
′‑
f修饰，以及位于位置11的脱氧核苷酸(例如，dt)(从 5
′
端起计数)；以及
[0600]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0601]
以及
[0602]
(b)反义链，其具有：
[0603]
(i)23个核苷酸的长度；
[0604]
(ii)位于位置1、3、7、9、11、13、15、17和19至23的2
′‑
ome 修饰，以及位于位置2、4至6、8、10、12、14、16和18的2
′‑
f修饰(从 5
′
端起计数)；
[0605]
以及
[0606]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0607]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0608]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0609]
(a)有义链，其具有：
[0610]
(i)21个核苷酸的长度；
[0611]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0612]
(iii)位于位置1至6、8、10、12、14和16至21的2
′‑
ome修饰，以及位于位置7、9、11、13和15的2
′‑
f修饰；以及
[0613]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0614]
以及
[0615]
(b)反义链，其具有：
[0616]
(i)23个核苷酸的长度；
[0617]
(ii)位于位置1、5、7、9、11、13、15、17、19和21至23的 2
′‑
ome修饰，以及位于位置2至4、6、8、10、12、14、16、18和20 的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0618]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0619]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0620]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0621]
(a)有义链，其具有：
[0622]
(i)21个核苷酸的长度；
[0623]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0624]
(iii)位于位置1至9和12至21的2
′‑
ome修饰，以及位于位置 10和11的2
′‑
f修饰；以及
[0625]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0626]
以及
[0627]
(b)反义链，其具有：
[0628]
(i)23个核苷酸的长度；
[0629]
(ii)位于位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19和21至23 的2
′‑
ome修饰，以及位于位置2、4、6、8、10、14、16、18和20的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0630]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0631]
其中所述rnai剂在该反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0632]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0633]
(a)有义链，其具有：
[0634]
(i)21个核苷酸的长度；
[0635]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0636]
(iii)位于位置1、3、5、7、9至11和13的2
′‑
f修饰，以及位于位置2、4、6、8、12和14至21的2
′‑
ome修饰；以及
[0637]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0638]
以及
[0639]
(b)反义链，其具有：
[0640]
(i)23个核苷酸的长度；
[0641]
(ii)位于位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19和21至 23的2
′‑
ome修饰，以及位于位置2、4、8、10、14、16和20的2
′‑
f 修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0642]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0643]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0644]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0645]
(a)有义链，其具有：
[0646]
(i)21个核苷酸的长度；
[0647]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0648]
(iii)位于位置1、2、4、6、8、12、14、15、17和19至21的 2
′‑
ome修饰，以及位于位置3、5、7、9至11、13、16和18的2
′‑
f修饰；以及
[0649]
(iv)位于位置1与2之间以及位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0650]
以及
[0651]
(b)反义链，其具有：
[0652]
(i)25个核苷酸的长度；
[0653]
(ii)位于位置1、4、6、7、9、11至13、15、17和19至23的 2
′‑
ome修饰，以及位于位置2、3、5、8、10、14、16和18的2
′‑
f修饰；以及位于位置24和25的脱氧核苷酸(例如，dt)(从5
′
端起计数)；以及
[0654]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0655]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有四个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0656]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0657]
(a)有义链，其具有：
[0658]
(i)21个核苷酸的长度；
[0659]
(ii)附接至3
′
末端的asgpr配体，其中该asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0660]
(iii)位于位置1至6、8和12至21的2
′‑
ome修饰，以及位于位置7和9至11的2
′‑
f修饰；以及
[0661]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0662]
以及
[0663]
(b)反义链，其具有：
[0664]
(i)23个核苷酸的长度；
[0665]
(ii)位于位置1、3至5、7、8、10至13、15和17至23的2
′‑
ome 修饰，以及位于位置2、6、9、14和16的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0666]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0667]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0668]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0669]
(a)有义链，其具有：
[0670]
(i)21个核苷酸的长度；
[0671]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0672]
(iii)位于位置1至6、8和12至21的2
′‑
ome修饰，以及位于位置7和9至11的2
′‑
f修饰；以及
[0673]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0674]
以及
[0675]
(b)反义链，其具有：
[0676]
(i)23个核苷酸的长度；
[0677]
(ii)位于位置1、3至5、7、10至13、15和17至23的2
′‑
ome 修饰，以及位于位置2、6、8、9、14和16的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0678]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0679]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有钝端。
[0680]
在另一具体实施方案中，本发明的rnai剂包含：
[0681]
(a)有义链，其具有：
[0682]
(i)19个核苷酸的长度；
[0683]
(ii)附接至3
′
端的asgpr配体，其中所述asgpr配体包含通过三价分支接头所附接的三个galnac衍生物；
[0684]
(iii)位于位置1至4、6和10至19的2
′‑
ome修饰，以及位于位置5和7至9的2
′‑
f修饰；以及
[0685]
(iv)位于核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0686]
以及
[0687]
(b)反义链，其具有：
[0688]
(i)21个核苷酸的长度；
[0689]
(ii)位于位置1、3至5、7、10至13、15和17至21的2
′‑
ome 修饰，以及位于位置2、6、8、9、14和16的2
′‑
f修饰(从5
′
端起计数)；以及
[0690]
(iii)位于核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置19与20之间、以及核苷酸位置20与21(从5
′
端起计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合；
[0691]
其中所述rnai剂在反义链的3
′
端具有两个核苷酸突出，并且在反义链的5
′
端具有
钝端。
[0692]
在某些实施方案中，用于本发明的方法中的irna是选自表2 至表5、表14或表15中的任一个所列的剂。这些剂还可包含配体。
[0693]
iii.与配体缀合的irna
[0694]
本发明的irna的rna的另一种修饰涉及增强irna的活性、细胞分布或细胞摄取(例如进入细胞中)的一个或多个配体、部分或缀合物化学连接至irna上。此类部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(letsinger et al.,proc.natl.acid.sci.usa,1989,86：6553
‑ꢀ
6556)。在其他实施方案中，配体是胆酸(manoharan et al., biorg.med.chem.let.,1994,4：1053-1060)、硫醚例如beryl-s-三苯甲基硫醇(manoharan et al.,ann.n.y.acad.sci.,1992,660：306-309；manoharanet al.,biorg.med.chem.let.,1993,3：2765-2770)、巯基胆固醇(oberhauseret al.,nucl.acids res.,1992,20：533-538)、脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras et al.,embo j,1991,10：1111-1118； kabanov et al.,febs lett.,1990,259：327-330；svinarchuk et al., biochimie,1993,75：49-54)、磷脂例如双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2
‑ꢀ
二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙铵(manoharan et al., tetrahedron lett.,1995,36：3651-3654；shea et al.,nucl.acids res.,1990, 18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(manoharan et al.,nucleosides& nucleotides,1995,14：969-973)、或金刚烷乙酸(manoharan et al., tetrahedron lett.,1995,36：3651-3654)、棕榈基部分(mishra et al., biochim.biophys.acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基氨基
ꢀ‑
羰基氧基胆固醇部分(crooke et al.,j.pharmacol.exp.ther.,1996, 277：923-937)。
[0695]
在某些实施方案中，配体会改变其所并入的irna剂的分布、靶向或寿命。在优选实施方案中，配体提供了对于所选靶标更高的亲和性，所述靶标为例如分子，细胞或细胞类型，区室如细胞区室或器官区室，身体的组织、器官或区域，例如与没有此类配体的种类相比。优选的配体不参与双链体核酸中的双链体配对。
[0696]
配体可包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如，人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、或球蛋白)；糖类(例如，葡聚糖、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊糖、环糊精、n-乙酰基葡萄糖胺、n-乙酰基半乳糖胺或玻尿酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，例如合成的聚合物，如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(pll)、聚l-天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(l
‑ꢀ
丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、n-(2-羟丙基) 甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物、或聚磷嗪 (polyphosphazine)。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
[0697]
配体还可包括与具体细胞类型(例如肾脏细胞)结合的靶向基团，如细胞靶向剂或组织靶向剂，如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，如抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白a、粘蛋白糖类、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋
白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素b12、维生素a、生物素、或rgd肽或拟rgd肽。在某些实施方案中，配体是多价半乳糖，例如，n-乙酰基-半乳糖胺。
[0698]
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、texaphyrin、sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，edta)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、 1,3-双-o(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、o3-(油酰基) 石胆酸、o3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)、以及肽缀合物(例如，触角足肽、tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、peg(例如，peg-40k)、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(如生物素)、转运促进剂/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的eu3+复合物)、二硝基苯基、hrp、或ap。
[0699]
配体可以是蛋白质如糖蛋白、或肽，例如对共配体具有特异亲和性的分子、或抗体，例如结合特定细胞类型如肝细胞的抗体。配体还可包括激素和激素受体。它们还可包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅助因子、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖、或多价海藻糖。配体可以是，例如，脂多糖、p38 map激酶的激活剂、或nf-κb的激活剂。
[0700]
配体可以是诸如药物的物质，其可例如通过破坏细胞的细胞骨架(如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝)来增加细胞对irna剂的摄取。该药物可以是，例如，紫杉醇(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、茉莉素 (japlakinolide)、红海海绵素a(latrunculin a)、鬼笔环肽(phalloidin)、海绵抗菌素(swinholide a)、茚酮衍生物(indanocine)、或迈尔素 (myoservin)。
[0701]
在一些实施方案中，如本文所述附接至irna的配体被用作药物代谢动力学调节剂(pk调节剂)。pk调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、peg、维生素等。示例性 pk调节剂包括但不限于，胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素e、生物素。包含一些硫代硫酸酯键的寡核苷酸还已知与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸也可作为本发明的配体(例如，作为pk调节配体)。此外，在本文所述的实施方案中，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适体也适用于作为pk调节配体而使用。
[0702]
本发明的配体-缀合的irna可通过使用具有侧链反应性官能团的寡核苷酸来合成，如衍生自连接分子与寡核苷酸的附接(如下所述)。这一反应性寡核苷酸可直接与下列配体反应：可商购的配体、具有多种保护基团中的任一种的合成配体、或具有附接于其上的连接部分的配体。
[0703]
在本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可通过公知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备可由多个供应商贩售，包括，例如applied(foster city,calif.)。可额外地或替代地采用本领域中已知的用于这种合成的任何其他方法。使
用类似技术来进行其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物的制备也是已知的。
[0704]
在本发明的配体-缀合的irna和带有配体分子的序列特异性连接的核苷中，寡核苷酸和寡核苷可在合适dna合成仪上使用下列物质组装：标准核苷酸或核苷前体、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合前体、已经带有配体分子或非核苷配体结构单元的配体-核苷酸或核苷缀合前体。
[0705]
当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合前体时，通常已完成序列特异性连接的核苷的合成，随后将配体分子与该连接部分反应以形成与配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷是通过自动合成仪来合成，除了使用可商购且常规用于寡核苷酸合成中的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺以外，还使用了衍生自配体
ꢀ‑
核苷缀合物的亚磷酰胺。
[0706]
a.脂质缀合物
[0707]
在某些实施方案中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子优选地与血清蛋白如人血清白蛋白 (hsa)结合。hsa与配体的结合允许缀合物分布于靶组织，如身体的非肾脏靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可结合 hsa的其他分子也可用作配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加对靶细胞或细胞膜的靶向或递送，或(c)可用于调节与血清蛋白例如hsa的结合。
[0708]
基于脂质的配体可用于抑制例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与hsa更牢固结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾脏，并因此更不可能从身体中被清除。与hsa结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用来使缀合物靶向肾脏。
[0709]
在某些实施方案中，基于脂质的配体结合hsa。优选地，其以足够的亲和力结合hsa，使得缀合物将优选地分布至非肾脏组织。然而，优选地，亲和力的强度不足以造成hsa-配体的结合是不可逆的。
[0710]
在其他实施方案中，基于脂质的配体与hsa的弱结合或根本不结合，使得缀合物将优选地分布至肾脏。靶向肾细胞的其他部分也可用于代替基于脂质的配体来使用或与基于脂质的配体同时使用。
[0711]
在另一方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞摄取的部分，例如维生素。这些尤其适用于治疗以多余的细胞增殖(例如恶性或非恶性类型的，如癌细胞)为特征的病症。示例性维生素包括维生素a、维生素e和维生素k。其他示例性维生素包括b族维生素，如叶酸、维生素b12、核黄素、生物素、吡哆醛、或其他被靶细胞如肝细胞摄取的维生素或营养物质。hsa及低密度脂蛋白(ldl)也包括在内。
[0712]
b.细胞渗透剂
[0713]
在另一方面，配体是细胞渗透剂，优选是螺旋细胞渗透剂。优选地，该剂是两亲性的。示例性的剂是肽，例如tat或触角足 (antennapedia)。如果该剂是肽，其可以是经修饰的，包括肽模拟物、反转异构体、非肽或伪肽键、以及d-氨基酸的使用。螺旋剂优选是α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
[0714]
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文中也被称为寡肽模拟物)是能折叠为类似于天然肽的所定义的三维结构的分子。肽及肽模拟物与irna剂的附接可例如通过增强细胞识别和吸收来影响irna的药物代谢动力学分布。肽或肽模拟物部分可以是约5至50个氨
基酸的长度，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。
[0715]
肽或肽模拟物可以是，例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽、或疏水性肽(例如，主要由tyr、trp或phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、限制性肽或交联肽。在另一替代方案中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(mts)。示例性的含有疏水性mts的肽是具有下述氨基酸序列的rfgf：aavallpavllallap(seq id no：18)。含有疏水性 mts的rfgf类似物(例如，氨基酸序列aallpvllaap(seq id no： 19))也可以是靶向部分。肽部分可是“递送性”肽，其可携带包括肽、寡核苷酸、及蛋白质在内的极性大分子跨越细胞膜。例如，已经发现，来自hiv tat蛋白质的序列(grkkrrqrrrppq(seq id no：20))和来自果蝇触角足蛋白的序列(rqikiwfqnrrmkwkk(seq id no：21)) 能发挥递送肽的功能。肽或肽模拟物可由随机dna序列编码，例如从噬菌体显示文库或一珠一化合物(oboc)组合文库中鉴定出来的肽(lamet al.,nature,354：82-84,1991)。通过合并的单体单元而与dsrna剂连系在一起以用于细胞靶向目的的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)-肽或rgd模拟物。肽部分的长度范围可以是约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可具有结构性修饰，例如以增加稳定性或引导构象特性。可使用下文所述的任意结构性修饰。
[0716]
用于本发明的组合物和方法的rgd肽可以是线性的或环状的，且可以经修饰例如糖基化或甲基化以促进对具体组织的靶向。含有 rgd的肽和肽模拟物可包括d-氨基酸，以及合成的rgd模拟物。除了rgd之外，还可使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选缀合物靶向pecam-1或vegf。
[0717]“细胞渗透肽”能渗透细胞例如微生物细胞例如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞例如人类细胞。微生物细胞渗透肽可以是，例如，α-螺旋线性肽(例如，ll-37或ceropin p1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽(bactenecin))、或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，pr-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可包括核定位信号(nls)。例如，细胞渗透肽可以是双向两亲性肽如mpg，其衍生自hiv-1gp41的融合肽结构域和sv40大t抗原的nls(simeoni etal.,nucl.acids res.31：2717-2724,2003)。
[0718]
c.糖类缀合物
[0719]
在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，irna还包含糖类。缀合有糖类的irna有利于核酸的体内递送，且组合物适用于体内治疗用途，如本文所示。如本文所用，“糖类”是指化合物，其本身由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、分支的或环状的)，以及与键连至每个碳原子的氧、氮或硫原子所组成的化合物；或是具有糖类部分作为其一部分的化合物，该糖类部分由一个或多个具有至少六个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、分支的或环状的) 与键连至每个碳原子的氧、氮或硫原子所组成。代表性糖类包括糖(单糖、二糖、三糖及含有约4、5、6、7、8、或9个单糖单元的寡糖)，以及多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括c5和以上(如， c5、c6、c7或c8)糖；二糖和三糖，其包括具有两个或三个单糖单元(如， c5、c6、c7或c8)的糖。
[0720]
在某些实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物是单糖。
[0721]
在某些实施方案中，单糖是n-乙酰半乳糖胺(galnac)。包含一种或多种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物的galnac缀合物被描述于例如us 8,106,022中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，galnac缀合物被用作将irna靶向具体细胞的配体。在一些实施方案中，galnac缀合物将irna靶向肝脏细胞，例如，通过用作肝脏细胞(例如，肝细胞)
的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
[0722]
在一些实施方案中，糖类缀合物包含一种或多种galnac衍生物。galnac衍生物可通过接头例如二价或三价分支接头来附接。在一些实施方案中，galnac缀合物缀合至有义链的3
′
端。在一些实施方案中，galnac缀合物通过接头例如本文所述的接头缀合至irna剂(例如，缀合至有义链的3
′
端)。在一些实施方案中，galnac缀合物缀合至有义链的5
′
端。在一些实施方案中，galnac缀合物通过接头例如本文所述的接头缀合至irna剂(例如，缀合至有义链的5
′
端)。
[0723]
在本发明的某些实施方案中，galnac或galnac衍生物通过单价接头附接至本发明的irna剂。在一些实施方案中，galnac或 galnac衍生物通过二价接头附接至本发明的irna剂。在本发明的又一些实施方案中，galnac或galnac衍生物通过三价接头附接至本发明的irna剂。在本发明的其他实施方案中，galnac或galnac衍生物通过四价接头附接至本发明的irna剂。
[0724]
在某些实施方案中，本发明的双链rnai剂包含一个附接至 irna剂的galnac或galnac衍生物。在某些实施方案中，本发明的双链rnai剂包含多(例如，2、3、4、5或6)个galnac或galnac衍生物，每个galnac或galnac衍生物通过多个单价接头独立地附接至双链rnai剂的多个核苷酸上。
[0725]
在一些实施方案中，例如，当本发明的irna剂的双链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3
′
端与另一条链的5
′
端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环圈时，该发夹环圈内的每个未配对核苷酸可独立包含通过单价接头附接的galnac或 galnac衍生物。发夹环圈也可由双链体的一条链的延伸突出形成。
[0726]
在一些实施方案中，例如，当本发明的irna剂的双链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3
′
端与另一条链的5
′
端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环圈时，该发夹环圈内的每个未配对核苷酸可独立地包含通过单价接头附接的galnac或 galnac衍生物。发夹环圈也可由双链体的一条链的延伸突出形成。
[0727]
在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物选自由下列所组成的组：
[0728]
[0729]
[0730]
[0731]
[0732][0733]
其中，y是o或s并且n是3至6(式xxiv)；其中，y是o或s并且n是3至6(式xxv)；
[0734]
[0735]
其中，x是o或s(式xxvii)；
[0736]
[0737]
[0738][0739]
在另一实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物是单糖。在一个实施方案中，单糖是n-乙酰半乳糖胺，例如
[0740]
在一些实施方案中，如以下方案所示，rnai剂通过接头附接至糖类缀合物，其中，x是o或s
[0741][0742]
在一些实施方案中，如下所示，rnai剂被缀合至如表1中定义的l96：
[0743][0744]
用于本文所述的实施方案中的另一代表性糖类缀合物包括但不限于，
[0745][0745]
其中，x或y中的一者是寡核苷酸，且另一者是氢。
[0746]
在一些实施方案中，合适的配体是wo2019/055633中公开的配体，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，配体包含以下结构：
[0747][0748]
在本发明的某些实施方案中，galnac或galnac衍生物经由单价接头附接至本发明的irna剂。在一些实施方案中，galnac或 galnac衍生物经由二价接头附接至本发明的irna剂。在本发明的又一些实施方案中，galnac或galnac衍生物经由三价接头附接至本发明的irna剂。
[0749]
在一个实施方案中，本发明的双链rnai剂包含一个或多个附接至irna剂的galnac或galnac衍生物。galnac可通过接头附接至有义链或反义链的任意核苷酸上。galnac可附接至有义链的5
′
端、有义链的3
′
端、反义链的5
′
端、或反义链的3
′
端。在一个实施方案中， galnac通过三价接头附接至有义链的3
′
端。
[0750]
在其他实施方案中，本发明的双链rnai剂包含多个(例如， 2、3、4、5或6个)galnac或galnac衍生物，其每个都通过多个接头例如单价接头独立地附接至双链rnai剂的多个核
苷酸上。
[0751]
在一些实施方案中，例如，当本发明的irna剂的双链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3
′
端与另一条链的5
′
端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环圈，该发夹环圈内的每个未配对核苷酸可独立地包含通过单价接头附接的galnac或 galnac衍生物。
[0752]
在一些实施方案中，糖类缀合物还包含如上文所述的一个或多个另外的配体，例如但不限于，pk调节剂或细胞渗透肽。
[0753]
适用于本发明的其他糖类缀合物和接头包括在pct公布wo2014/179620和wo 2014/179627中所描述的那些，其各自的全部内容通过引用并入本文。
[0754]
d.接头
[0755]
在一些实施方案中，本文所述的缀合物或配体可通过多种接头附接至irna寡核苷酸，所述接头可以是可裂解的或不可裂解的。
[0756]
术语“接头”或“连接基团(linking group)”意指将化合物的两个部分连结，例如，将化合物的两个部分共价连接的有机部分。接头通常包含直接键或原子如氧或硫，单元如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、 so2nh或原子链，例如但不限于，取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可被如下基团所中断或终止：o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、或取代的或未取代的杂环基；其中 r8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施方案中，接头是约1至24个原子、2至24个原子、3至24个原子、4至24个原子、5 至24个原子、6至24个原子、6至18个原子、7至18个原子、8至 18个原子、7至17个原子、8至17个原子、6至16个原子、7至17 个原子、或8至16个原子。
[0757]
可裂解的连接基团在细胞外足够稳定，但当其进入靶细胞时被裂解以释放被接头保持在一起的两个部分。在优选实施方案中，在靶细胞中或在第一参考条件(其可以是例如经选择以模拟或呈现细胞内的条件)下，相比于在受试者血液中或在第二参考条件(其可以是例如经选择以模拟或呈现血液或血清中所见的条件)下，可裂解的连接基团被裂解的速度快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、 80倍、90倍或更高、或至少100倍。
[0758]
可裂解的连接基团易受裂解剂的影响，例如ph、氧化还原电位或可降解分子的存在。通常，与在血清或血液中相比，裂解剂在细胞内更普遍或以更高的水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：氧化还原剂，其被选择用于特定底物或其不具有底物特异性，包括例如细胞中存在的氧化酶、还原酶或还原剂如硫醇，其可通过还原作用降解可经氧化还原裂解的连接基团；酯酶；可产生酸性环境的核内体或剂，例如导致ph为5或更低的那些；可通过作为通用的酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可裂解的连接基团
的酶。
[0759]
可裂解的连接基团如二硫键可能对ph敏感。人血清的ph为 7.4，而细胞内的平均ph略低，其范围约为7.1至7.3。核内体具有酸性更强的ph，其范围约为5.5至6.0；而溶酶体甚至具有酸性更强的ph，约为5.0。一些接头将具有可裂解的连接基团，该连接基团在优选的ph 发生裂解，从而将阳离子脂质从细胞内的配体释放出来或将该阳离子脂质释放进所期望的细胞区室内。
[0760]
接头可包括可通过特定酶裂解的可裂解的连接基团。并入接头的可裂解的连接基团的类型可取决于将作为靶标的细胞。例如，肝脏靶向配体可通过包括酯基的接头与阳离子脂质连接。肝脏细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，该接头在肝细胞中被更有效地裂解。其他富含酯酶的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
[0761]
当靶向富含肽酶的细胞类型如肝脏细胞和滑膜细胞时，可使用含有肽键的接头。
[0762]
通常，可通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评估候选的可裂解连接基团的适用性。还期望测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时的抵抗裂解的能力。因此，可测定第一条件与第二条件间的裂解相对敏感性，其中，选择第一条件以指示靶细胞中的裂解，而选择第二条件以指示其它组织或生物液体如血液或血清中的裂解。评估可在无细胞系统中、细胞中、细胞培养物中、器官或组织培养物中、或在完整动物体内进行。在无细胞或培养条件进行初始评估，并通过在完整动物体内的进一步评估进行证实，可能是有用的。在优选实施方案中，有用的候选化合物在细胞内(或在被选用以模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解速度比在血液或血清中(或在被选用以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、 30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
[0763]
i.氧化还原可裂解的连接基团
[0764]
在某些实施方案中，可裂解的连接基团是在还原或氧化时被裂解的可经氧化还原裂解的连接基团。可经还原裂解的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-s-s-)。可参见本文中所述的方法来确定候选可裂解连接基团是否是合适的“可还原裂解的连接基团”或例如是否适用于与特定irna部分和特定靶向剂一起使用。例如，可通过使用本领域中的已知试剂将二硫苏糖醇(dtt)或其他还原剂与候选物一起孵育来评估候选物，其模拟在细胞如靶细胞中将会观察到的裂解速率。候选物也可在被选用以模拟血液或血清条件的条件下进行评估。在一个实施方案中，候选化合物在血液中至多被裂解约10％。在其他实施方案中，有用的候选化合物在细胞内(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下) 的降解速度比在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、 70倍、80倍、90倍或约100倍。可使用标准酶动力学分析在被选择以模拟细胞内介质的条件下测定候选化合物的裂解速率，并将其与在被选择以模拟细胞外介质的条件下所测定的候选化合物的裂解速率进行比较。
[0765]
ii.基于磷酸的可裂解连接基团
[0766]
在其他实施方案中，可裂解的接头包含基于磷酸的可裂解连接基团。基于磷酸的可裂解连接基团是被降解或水解磷酸基团的剂所裂解。在细胞内裂解磷酸基团的剂的实例是酶如细胞内的磷酸酶。基于磷酸的连接基团的实例是-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、
ꢀ‑
o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、
ꢀ‑
o-p(s)
(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、
ꢀ‑
s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。优选的实施方案是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、
ꢀ‑
s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、
ꢀ‑
s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、
ꢀ‑
s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-和-o-p(s)(h)-s-。优选的实施方案是
ꢀ‑
o-p(o)(oh)-o-。可使用与上述方法类似的方法来评估这些候选物。
[0767]
iii.酸可裂解的连接基团
[0768]
在其他实施方案中，可裂解的接头包含酸可裂解的连接基团。酸可裂解的链接基团是在酸性条件下被裂解的连接基团。在优选实施方案中，酸可裂解的连接基团在ph为约6.5或更低(例如，约6.0、 5.5、5.0或更低)的酸性环境中被裂解，或被剂例如可用作广义酸的酶所裂解。在细胞中，具体的低ph细胞器如核内体和溶酶体，可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙类、酯类、及氨基酸的酯类。酸可裂解的链接基团可具有通式
ꢀ‑
c＝nn-、c(o)o、或-oc(o)。优选的实施方案是附接至酯(烷氧基)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团、或叔烷基基团如二甲基戊基或叔丁基。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。
[0769]
iv.基于酯的连接基团
[0770]
在其他实施方案中，可裂解的接头包含基于酯的可裂解的连接基团。基于酯的可裂解的连接基团通过细胞中的酶例如酯酶或酰胺酶而被裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基基团、亚烯基基团和亚炔基基团的酯类。酯可裂解的连接基团具有通式
ꢀ‑
c(o)o-或-oc(o)-。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。
[0771]
v.基于肽的裂解基团
[0772]
在其他实施方案中，可裂解的接头包含基于肽的可裂解连接基团。基于肽的可裂解连接基团通过细胞中的酶例如肽酶和蛋白酶而被裂解。基于肽的可裂解基团为在氨基酸之间形成的肽键以获得寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基团 (-c(o)nh-)。酰胺基团可在任意亚烷、亚烯或亚炔之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以获得肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常被限于产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即，酰胺键)，而不包括完整酰胺官能团。基于肽的可裂解连接基团具有通式
–ꢀ
nhchrac(o)nhchrbc(o)-，其中ra与rb是两个相邻氨基酸的r 基团。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。
[0773]
在一些实施方案中，本发明的irna通过接头缀合至糖类。本发明的组合物和方法中具有接头的irna糖类缀合物的非限制性实例包括，但不限于，
[0774]
[0775]
[0776][0776]
当x或y中的一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
[0777]
在本发明的组合物和方法的某些实施方案中，配体是通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个“galnac”(n-乙酰半乳糖胺) 衍生物。
[0778]
在一个实施方案中，本发明的dsrna缀合至选自式(xlv)至 (xlvi)中的任一者所示结构组成的组的二价或三价分支接头：
[0779][0780]
其中：
[0781]
q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b和q5c每次出现时独立地表示0至20，并且其中的重复单元可以是相同的或不同的；
[0782]
p
2a
、p
2b
、p
3a
、p
3b
、p
4a
、p
4b
、p
5a
、p
5b
、p
5c
、t
2a
、t
2b
、t
3a
、t
3b
、 t
4a
、t
4b
、t
4a
、t
5b
、t
5c
每次出现时各自独立地表示：不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；
[0783]q2a
、q
2b
、q
3a
、q
3b
、q
4a
、q
4b
、q
5a
、q
5b
、q
5c
每次出现时独立地表示：不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可被如下一个或多个基团所中断或终止：o、s、s(o)、so2、n(rn)、 c(r
′
)＝c(r”)、c≡c或c(o)；
[0784]r2a
、r
2b
、r
3a
、r
3b
、r
4a
、r
4b
、r
5a
、r
5b
、r
5c
每次出现时独立地表示：不存在、nh、o、s、ch2、c(o)o、c(o)nh、nhch(ra)c(o)、
ꢀ‑
c(o)-ch(ra)-nh-、co、ch＝n-o、o、或杂环基；
[0785]
l
2a
、l
2b
、l
3a
、l
3b
、l
4a
、l
4b
、l
5a
、l
5b
和l
5c
表示配体，即，每次出现时各自独立地表示单糖(如galnac)、二糖、三糖、四糖、寡糖、或多糖；且ra是h或氨基酸侧链。三价缀合的galnac衍生物与rnai 剂合用对于抑制靶标基因的表达是特别有用的，例如式(xlix)的那些：
[0786][0787]
其中l
5a
、l
5b
和l
5c
表示单糖，如galnac衍生物。
[0788]
合适的缀合galnac衍生物的二价和三价分支接头基团的实例包括但不限于，上文列举的如式ii、式vii、式xi、式x、和式xiii 所示的结构。
[0789]
教导rna缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于，美国专利第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465 号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717 号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第 5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第 4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第 4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第 5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第 5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第 5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第 5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第 5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第 5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第 5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第 5,599,928号、第5,688,941号、第6,294,664号、第6,320,017号、第 6,576,752号、第6,783,931号、第6,900,297号、第7,037,646号、第 8,106,022，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0790]
给定化合物的所有位置不需要统一地进行修饰，且事实上，可将超过一种的前述
修饰并入单个化合物中或甚至并入irna的单个核苷处。本发明还包括作为嵌合化合物的irna化合物。
[0791]
在本发明的上下文中，“嵌合”irna化合物或“嵌合体”是 irna化合物，优选是dsrnai剂，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元构成，即，在dsrna化合物的情形中，该单体单元是核苷酸。这些irna通常含有至少一个区域，其中 rna被修饰以赋予irna：对核酸酶降解的抗性增加、细胞摄取增加、或与靶标核酸的结合亲和力增加。irna的另一区域可用作能裂解 rna：dna杂交体或rna：rna杂交体的酶的底物。例如，rnase h 是细胞核酸内切酶，其裂解rna：dna双链体的rna链。因此，rnaseh的激活导致rna靶标的裂解，从而极大地提升了irna抑制基因表达的效率。因此，当使用嵌合dsrna时，使用较短的irna可获得与使用与相同靶标区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsrna相当的结果。rna 靶标的裂解可通过凝胶电泳进行常规检测，且如果需要，可将凝胶电泳与本领域中已知的相关核酸杂交技术联合使用进行常规检测。
[0792]
在某些情况下，irna的rna可通过非配体基团进行修饰。已经将大量非配体分子缀合至irna以提高irna的活性、细胞分布或细胞摄取，且执行此类缀合的过程是可在科技文献中获得的。此类非配体部分已经包括脂质部分，如胆固醇(kubo,t.et al.,biochem.biophys. res.comm.,2007,365(1)：54-61；letsinger et al.,proc.natl.acad.sci. usa,1989,86：6553)、胆酸(manoharan et al.,bioorg.med.chem.lett., 1994,4：1053)、硫醚例如己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan et al.,ann. n.y.acad.sci.,1992,660：306；manoharan et al.,bioorg.med.chem. let.,1993,3：2765)、巯基胆固醇(oberhauser et al.,nucl.acids res.,1992, 20：533)、脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras et al.,embo j.,1991,10：111；kabanov et al.,febs lett.,1990,259：327； svinarchuk et al.,biochimie,1993,75：49)、磷脂例如双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸三乙铵(manoharanet al.,tetrahedron lett.,1995,36：3651；shea et al.,nucl.acids res.,1990, 18：3777)、聚胺或聚乙二醇链(manoharan et al.,nucleosides& nucleotides,1995,14：969)、或金刚烷乙酸(manoharan et al.,tetrahedronlett.,1995,36：3651)、棕榈酰基部分(mishra et al.,biochim.biophys. acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(crooke et al.,j.pharmacol.exp.ther.,1996,277：923)。教导此类rna 缀合物的制备的代表性美国专利已在上文中列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置带有氨基接头的rna的合成。随后使用合适的偶联剂或激活剂将氨基基团与待缀合的分子反应。缀合反应可使用仍与固相支撑物结合的rna来进行，或在rna裂解后的溶液相中进行。通过hplc纯化rna缀合物通常会得到纯的缀合物。
[0793]
iv.本发明的irna的递送
[0794]
将本发明的irna递送至细胞例如受试者例如人类受试者(例如，有需要的受试者，例如易患或被诊断为患有载脂蛋白c3相关病症例如高甘油三酯血症的受试者)体内的细胞可通过多种不同方式来实现。例如，可通过将细胞与本发明的irna在体外或体内接触来实施递送。体内递送也可通过将包含irna如dsrna的组合物施用至受试者来直接实施。或者，体内递送可通过施用编码并引导irna的表达的一种或多种载体来间接实施。这些替代方案
会在下文中进一步讨论。
[0795]
通常，任何递送核酸分子(体外或体内)的方法均可适用于与本发明的irna一起使用(参见，例如，akhtar s.and julian rl.(1992) trends cell.biol.2(5)：139-144及wo94/02595，其全部内容通过引用整体并入本文)。对于体内递送，为了递送irna分子而要考虑的因素包括，例如，所递送分子的生物学稳定性、非特异性效应的预防、以及所递送的分子在靶标组织内的积累。也已经显示了通过直接注射来局部递送至cns的成功rna干扰(dorn,g.,et al.(2004)nucleic acids 32： e49；tan,ph.,et al(2005)gene ther.12：59-66；makimura,h.,et al (2002)bmc neurosci.3：18；shishkina,gt.,et al(2004)neuroscience 129：521-528；thakker,er.,et al(2004)proc.natl.acad.sci.u.s.a.101： 17270-17275；akaneya,y.,et al(2005)j.neurophysiol.93：594-602)。rna 或药物载体的修饰也可允许将irna靶向到靶组织并避免不希望的脱靶效应。irna分子可通过化学缀合至亲脂性基团如胆固醇来进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对apob的irna经全身性注射至小鼠体内，而导致肝脏和空肠中的 apob mrna的敲低(soutschek,j.et al.,(2004)nature 432：173-178)。
[0796]
在一个替代实施方案中，irna可使用药物递送系统如纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体、或阳离子递送系统来进行递送。带正电荷的阳离子递送系统促进irna分子(带负电荷)的结合，并增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许细胞对irna的有效摄取。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可与irna结合或被诱导以形成封装irna的囊泡或微胞(micelle)(参见，例如，kim sh.et al.,(2008) journal of controlled release 129(2)：107-116)。当进行全身性施用时，囊泡或微胞的形成进一步防止了irna的降解。制备和施用阳离子
ꢀ‑
irna复合体的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见，例如，sorensen,dr.,et al.(2003)j.mol.biol 327：761-766；verma,un.et al.,(2003)clin.cancer res.9：1291-1300；arnold,as et al.(2007)j. hypertens.25：197-205，其全部内容通过引用并入本文)。可用于irna 的系统性递送的药物递送系统的一些非限制性实例包括 dotap(sorensen,dr.,et al(2003)，同上；verma,un.et al.,(2003)，同上)、“固体核酸脂质颗粒”(zimmermann,ts.et al.,(2006)nature 441： 111-114)、心磷脂(chien,py.et al.,(2005)cancer gene ther.12： 321-328；pal,a.et al.,(2005)int j.oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亚胺 (bonnet me.et al.,(2008)pharm.res.aug 16电子优先发布；aigner,a. (2006)j.biomed.biotechnol.71659)、arg-gly-asp(rgd)肽(liu,s. (2006)mol.pharm.3：472-487)和聚酰氨基胺(tomalia,da.et al.,(2007) biochem.soc.trans.35：61-67；yoo,h.et al.,(1999)pharm.res.16： 1799-1804)。在一些实施方案中，irna与环糊精形成用于全身性施用的复合体。施用irna与环糊精的方法和irna与环糊精的药物组合物可见于美国专利第7,427,605号，其全部内容通过引用并入本文。
[0797]
a.编码本发明的irna的载体
[0798]
靶向载脂蛋白c3基因的irna可从插入dna载体或rna载体的转录单元表达(参见，例如，couture,a,et al.,tig.(1996),12：5-10； skillern,a.,et al.,国际pct公布号wo 00/22113；conrad,国际pct 公布号wo 00/22114；以及conrad,美国专利第6,054,299号)。表达可以是瞬时的(数小时至数周的级别)或持续的(数周至数月或更久)，这取决于所使用
的具体构建体和靶标组织或细胞类型。此类转基因可作为线性构建体、环状质粒、或病毒载体而引入，其可以是整合载体或非整合载体。也可构建转基因以允许其作为染色体外质粒而遗传(gassmann,etal.,(1995)proc.natl.acad.sci.usa 92：1292)。
[0799]
可用于本文所述方法和组合物的病毒载体系统包括但不限于，(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体； (e)sv 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如天花，例如牛痘病毒载体或禽类痘病毒如金丝雀痘或鸡痘病毒载体；以及(j)辅助依赖型腺病毒或裸腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同的载体将并入或不并入细胞的基因组中。如果必要，构建体可包括用于转染的病毒序列。或者，可将构建体并入到能进行附加型复制(episomal replication)的载体如epv 载体和ebv载体中。用于irna的重组表达的构建体通常将会需要调控元件，如启动子、增强子等，以确保irna在靶细胞内的表达。对于载体和构建体需考虑的其他方面是本领域中已知的。
[0800]
v.本发明的药物组合物
[0801]
本发明还包括包含本发明的irna的药物组合物和制剂。在一个实施方案中，本文提供含有如本文所述的irna以及药学上可接受的载体的药物组合物。含有irna的药物组合物可用于预防或治疗载脂蛋白c3相关病症，例如，高甘油三酯血症。此类药物组合物是根据递送方式来配制的。一个实例是配制为用于系统性施用的组合物，所述施用通过肠胃外递送，例如，通过皮下(sc)递送、肌内(im)递送或静脉内(iv) 递送。本发明的药物组合物可以以足以抑制载脂蛋白c3基因表达的剂量施用。
[0802]
在一些实施方案中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一实施方案中，本发明的药物组合物是无热原的。
[0803]
本发明的药物组合物可以以足以抑制载脂蛋白c3基因表达的剂量施用。通常，本发明的irna的合适剂量将在每天约0.001至约 200.0毫克每公斤受体体重的范围，通常在每天约1至50mg每公斤体重的范围。通常，本发明的irna的合适剂量将在约0.1mg/kg至约5.0 mg/kg的范围，优选在约0.3mg/kg和3.0mg/kg的范围。重复剂量的给药方案可包括定期施用治疗量的irna，例如每个月一次，每3至6个月一次，或每年一次。在某些实施方案中，约每个月一次至约每六个月一次施用irna。
[0804]
在初始的治疗方案后，可降低治疗的施用频率。治疗的持续时间可根据疾病的严重程度来确定。
[0805]
在其他实施方案中，单剂量的药物组合物可以是长效的，使得多个剂量以不超过1、2、3或4个月的间隔来施用。在本发明的一些实施方案中，单剂量的本发明的药物组合物约每个月施用一次的。在本发明的其他实施方案中，单剂量的本发明的药物组合物约每个季度 (即，约每三个月)施用一次的。在本发明的其他实施方案中，单剂量的本发明的药物组合物约每年施用两次的(即，约每六个月施用一次)。
[0806]
技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于受试者体内存在的突变、既往治疗、受试者的总体健康状况或年龄、以及现有的其他疾病。此外，使用适当的预防有效量或治疗有效量的组合物对受试者的治疗可包括单次治疗或一系列治疗。
systems,allen,lv.,popovich ng.,andansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(8th ed.),new york, ny；rieger,in pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger andbanker(eds.),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，volume 1,p. 285；idson,in pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger andbanker(eds.),marcel dekker,inc.,new york,n.y.,1988，volume 1,p. 199)。表面活性剂通常是两亲性的，且包含亲水性部分和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率已经被定义为亲水/亲脂平衡 (hlb)，且是在分类和制剂的制备中选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂基于亲水性基团的性质可分为不同的类别：非离子性、阴离子性、阳离子性和两亲性(参见，例如，ansel
′
s pharmaceutical dosageforms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.,and ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(8th ed.),new york,ny；rieger, in pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger and banker(eds.), 1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，volume 1,p.285)。
[0815]
乳液制剂中还包括多种非乳化材料，其有助于乳液的性能。这些包括脂肪、油类、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保湿剂、亲水性胶体、防腐剂及抗氧化剂(block,in pharmaceutical dosage forms, lieberman,rieger and banker(eds.),1988,marcel dekker,inc.,newyork,n.y.，volume 1,p.335；idson,in pharmaceutical dosage forms, lieberman,rieger and banker(eds.),1988,marcel dekker,inc.,newyork,n.y.，volume 1,p.199)。
[0816]
经由皮肤途径、口服途径和肠胃外途径的乳液制剂的应用及其制备方法已经在文献中进行了综述(参见，例如，ansel
′
s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv., popovich ng.,and ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(8th ed.),new york,ny；idson,in pharmaceutical dosage forms,lieberman, rieger and banker(eds.),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y., volume 1,p.199)。
[0817]
ii.微乳液
[0818]
在本发明的一个实施方案中，irna和核酸的组合物被配制为微乳液。微乳液可定义为水、油和两亲物的系统，其是单一光学各向同性和热力学稳定的溶液(参见，例如，ansel
′
s pharmaceutical dosageforms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.,and ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(8th ed.),new york,ny； rosoff,in pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger and banker (eds.),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.,volume 1,p.245)。通常，微乳液是通过如下制备而得的系统：首先，将油分散于表面活性剂水溶液中，随后加入足量的第四组分，通常是中等链长的醇，以形成透明的系统。因此，微乳液也已经被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性的澄清分散液，该两种液体通过表面活性分子的界面膜得以稳定(leung and shah，在：controlled release of drugs：polymers andaggregate systems,rosoff,m.,ed.,1989,vch publishers,new york， pages 185-215)。
[0819]
iii.微粒
[0820]
本发明的irna可掺入颗粒例如微粒中。微粒可通过喷雾干燥来产生，但也可通过其他方法来产生，包括冷冻干燥、蒸发、流体床干燥、真空干燥、或这些技术的组合。
[0821]
iv.渗透增强剂
[0822]
在一个实施方案中，本发明采用了多种渗透增强剂以实现核酸(尤其是irna)向动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子化和非离子化的形式存在于溶液中。然而，通常仅脂溶性或亲脂性药物能轻易地跨越细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理待跨越的细胞膜，则即便是非亲脂性药物仍能够跨越该细胞膜。除了有助于非亲脂性药物跨越细胞膜扩散外，渗透增强剂还能提高亲脂性药物的渗透性。
[0823]
渗透增强剂可被分类为属于下述五大类之一：即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、和非螯合非表面活性剂(参见，例如， malmsten,m.surfactants and polymers in drug delivery,informa healthcare,new york,ny,2002；lee et al.,critical reviews in therapeutic drugcarrier systems,1991,p.92)。上文述及每类渗透增强剂及其在药物组合物的制备和药剂的递送中的用途是本领域所周知的。
[0824]
v.赋形剂
[0825]
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送至动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他药理学上惰性的载剂。赋形剂可以是液体或固体，且可根据所考虑的计划施用方式来选择，当与核酸和给定药物组合物的其他组分结合时，以提供所期望的体积、黏度等。此类剂是本领域所周知的。
[0826]
vi.其他组分
[0827]
本发明的组合物可另外含有常见于药物组合物中的其它辅助组分，其用量为它们在本领域中确定的水平。因此，例如，组合物可含有另外的、可兼容的、药学活性材料，例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有可用于在物理上配制本发明的组合物的各种剂型的其他材料如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入这类材料时，不应过度干扰本发明的组合物的组分的生物活性。可以对制剂进行灭菌，且如果需要还可以与不与该制剂的核酸发生有害反应的佐剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。
[0828]
水性悬浮液可含有增加悬浮液黏度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液还可含有稳定剂。
[0829]
在一些实施方案中，本发明提出的药物组合物包含(a)一种或多种irna和(b)一种或多种剂，其通过非irna机制发挥作用且可用于治疗载脂蛋白c3相关病症，例如高甘油三酯血症。
[0830]
此类化合物的毒性和预防功效可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定ld50(对群体的50％致死的剂量)和 ed50(对群体的50％预防有效的剂量)。毒性与治疗效果间的剂量比是治疗指数，且其可表示为ld50/ed50之比。显现出高治疗指数的化合物是优选的。
[0831]
从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制在人体内使用的剂量范围。本文中本发明提出的组合物的剂量通常处于包括 ed50，优选ed80或ed90在内的具低毒性或无毒性的循环浓度范围。剂量可依据所采用的剂型和所使用的施用途径而在此范围内变化。对于在本发明提出的方法中使用的任意化合物，首先可从细胞培养分析中估计预防有效量。可在动物模型中配制剂量以取得化合物的循环血浆浓度范围或，当适当时，取得靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现降低的多肽浓度)，该范围包括如在细胞
培养物中所测定的 ic50(即，实现对症状的半最大抑制时的测试化合物的浓度)或更高水平的抑制。此类信息可用来更准确地确定可用于人体的剂量。例如，可通过高效液相层析测量血浆中的水平。
[0832]
除了如上文所讨论的irna的施用之外，本发明提出的irna 也可与其它已知的用于预防或治疗载脂蛋白c3相关病症例如高甘油三酯血症中的剂组合施用。在任何情况下，主治医生皆可基于本领域中已知或本文所述的标准功效测量方法所观察到的结果来调节irna施用的量和时机。
[0833]
vi.抑制载脂蛋白c3表达的方法
[0834]
本发明还提供了抑制apoc3基因在细胞内的表达的方法。该方法包括使细胞与有效抑制细胞内apoc3的表达的量的rnai剂例如双链rna剂接触，从而抑制细胞内apoc3的表达。
[0835]
细胞与irna例如双链rna剂的接触可在体外或体内完成。使细胞与irna在体内接触包括使受试者例如人类受试者体内的细胞或细胞群与irna接触。体外接触细胞的方法与体内接触细胞的方法的组合也是可以的。如上所述，与细胞的接触可以是直接的或间接的。此外，与细胞的接触可通过靶向配体来实现，所述靶向配体包括本文所述或本领域中已知的任何配体。在优选实施方案中，靶向配体是糖类部分，例如galnac3配体，或将rnai剂引导至感兴趣的位点的任何其他配体。
[0836]
如本文所用，术语“抑制”与“减轻”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语可互换使用，且包括任何水平的抑制。
[0837]
如本文所用，短语“抑制载脂蛋白c3的表达”意指抑制任何载脂蛋白c3基因(例如，小鼠载脂蛋白c3基因、大鼠载脂蛋白c3基因、猴载脂蛋白c3基因、或人载脂蛋白c3基因)以及载脂蛋白c3基因的变体或突变体的表达。因此，在经基因操纵的细胞、细胞群或生物体的语境中，载脂蛋白c3基因可是野生型载脂蛋白c3基因、突变的载脂蛋白c3基因或转基因的载脂蛋白c3基因。
[0838]“抑制载脂蛋白c3基因的表达”包括对载脂蛋白c3基因的任何水平的抑制，例如，至少部分阻抑载脂蛋白c3基因的表达。载脂蛋白c3基因的表达可根据与载脂蛋白c3基因表达相关的任何变量的水平(例如载脂蛋白c3 mrna水平或载脂蛋白c3蛋白质水平)或水平的改变来评估。这一水平可在单个细胞或细胞群中来评估，包括例如，源自受试者的样本的细胞或细胞群。可以理解，载脂蛋白c3主要在肝脏中表达，但也在脑、胆囊、心脏及肾脏中表达，并且存在于循环中。
[0839]
可通过与对照水平相比与载脂蛋白c3表达相关的一个或多个变量的绝对水平或相对水平的下降来评估抑制作用。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，如给药前的基线水平，或从未处理或经对照(例如，仅含缓冲剂的对照或非活性剂的对照)处理的类似受试者、细胞或样本中测得的水平。
[0840]
在本发明的方法的一些实施方案中，载脂蛋白c3基因的表达被抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或 95％，或被抑制到低于测定法的检测水平。在优选实施方案中，载脂蛋白c3基因的表达被抑制至少70％。还应理解，可能需要抑制载脂蛋白 c3在某些组织例如肝脏中表达而不显著抑制其在其他组织例如脑中的表达。在优选实施方案中，使用实施例2中提供的测定方法使用10nmsirna浓度在合适物种匹配细
胞系中测定了表达水平。
[0841]
在某些实施方案中，体内表达的抑制是通过敲低表达人类基因的啮齿动物(例如，表达人类靶标基因(即，载脂蛋白c3)的aav转染的小鼠)体内的人类基因来测定的，例如，当在rna表达的最低点以3 mg/kg的单剂量施用时。模型动物系统中外源性基因表达的敲低也可例如在rna表达的最低点施用3mg/kg的单剂量之后测定。当人类基因的核酸序列与模型动物基因足够接近而使得人类irna提供对模型动物基因的有效敲低时，这样的系统是有用的。使用实施例2中提供的 pcr方法来测定肝脏中的rna表达。
[0842]
载脂蛋白c3基因表达的抑制可通过第一细胞或细胞群(此类细胞可存在于例如来源于受试者的样本中)所表达的mrna量的降低来体现，在该第一细胞或细胞群中，载脂蛋白c3基因被转录并且已经过处理(例如，通过使一个或多个细胞与本发明的irna接触，或通过将本发明的irna施用至细胞所在或曾所在的受试者中)，使得与基本上与第一细胞或细胞群相同但未经如此处理的第二细胞或细胞群(未经 irna处理或未经靶向感兴趣基因的irna处理的对照细胞)相比，载脂蛋白c3基因的表达被抑制。在优选实施方案中，通过实施例2中提供的方法，使用10nm sirna浓度，在物种匹配细胞中评估抑制，并使用下述公式将经处理的细胞内的mrna水平表示为相对于对照细胞中 mrna水平的百分比：
[0843][0844]
在其他实施方案中，载脂蛋白c3基因表达的抑制可根据与载脂蛋白c3基因表达相关的参数(例如来自受试者的血液或血清中载脂蛋白c3蛋白质水平)的降低来进行评估。载脂蛋白c3基因沉默可通过本领域中已知的任何测定方法在任何表达载脂蛋白c3(无论是内源的载脂蛋白c3或来自表达构建体的异源载脂蛋白c3)的细胞中确定。
[0845]
载脂蛋白c3蛋白表达的抑制可通过细胞或细胞群或受试者样本中所表达的载脂蛋白c3蛋白的水平(例如，源自受试者的血液样本中的蛋白质水平)的降低而体现。如上所述，为了评估mrna的阻抑，经处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可类似地表现为相对于对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比，或受试者样本例如源自该受试者的血液或血清中蛋白质水平的变化。
[0846]
可用来评估载脂蛋白c3基因表达的抑制的对照细胞、细胞群或受试者样本包括尚未与本发明的rnai剂接触的细胞、细胞群或受试者样本。例如，对照细胞、细胞群或受试者样本可源自使用rnai剂治疗受试者之前的个体受试者(例如，人类或动物受试者)或源自适当匹配的群体对照。
[0847]
细胞或细胞群所表达的载脂蛋白c3 mrna水平可使用本领域中已知用于评估mrna表达的任意方法来测定。在一个实施方案中，样本中的载脂蛋白c3表达水平可通过检测经转录的多核苷酸或其部分例如载脂蛋白c3基因的mrna来测定。可使用rna提取技术，包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取(rnazol b；biogenesis)、 rneasy
tm rna制备试剂盒或paxgene
tm
(preanalytix
tm
， switzerland)，从细胞中提取rna。采用核糖核酸杂交的通用分析形式包括核连缀分析、rt-pcr、rnase保护分析、northern印迹法、原位杂交和微阵列分析。
[0848]
在一些实施方案中，使用核酸探针确定载脂蛋白c3的表达水平。如本文所用，术语“探针”是指能够选择性地结合至具体载脂蛋白 c3的任何分子。探针可由本领域技术人员合成，或来源于适当的生物制品。探针可被特别设计为被标记的。可用作探针的分子的实例包括但不限于rna、dna、蛋白质、抗体和有机分子。
[0849]
经分离的mrna可用于杂交或扩增分析，包括但不限于， southern分析或northern分析、聚合酶链反应(pcr)分析和探针阵列。一种用于测定mrna水平的方法包括使经分离的mrna与可与载脂蛋白c3 mrna杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中，例如，通过使经分离的mrna在琼脂糖凝胶上电泳并将mrna从该凝胶转移至膜诸如硝酸纤维素膜，从而将mrna固定于固体表面并使其与探针接触。在一个替代的实施方案中，例如，在基因芯片阵列中，将探针固定在固体表面并使mrna与该探针接触。技术人员可容易地调整已知的mrna检测方法以用于测定载脂蛋白c3 mrna的水平。
[0850]
用于测定样本中载脂蛋白c3表达水平的替代方法涉及例如样本中的mrna的核酸扩增或逆转录酶(以制备cdna)的过程，该过程是例如通过rt-pcr(mullis于1987年在美国专利4,683,202中记载的实验性实施方案)、连接酶链式反应(barany(1991)proc.natl.acad.sci. usa 88：189-193)、自主序列复制(guatelli et al.(1990)proc.natl.acad. sci.usa 87：1874-1878)、转录扩增系统(kwoh et al.(1989)proc.natl. acad.sci.usa 86：1173-1177)、q-β复制酶(lizardi et al.(1988) bio/technology 6：1197)、滚环式复制(lizardi et al.,us专利no. 5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，之后使用本领域技术人员熟知的技术检测所扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方法对于核酸分子的检测特别有用。在本发明的具体方面中，apoc3 表达的水平是通过定量荧光rt-pcr(即，taqman
tm
系统)测定的。在优选实施方案中，使用实施例2中提供的方法，使用例如10nm sirna 浓度，在物种匹配细胞中测定表达水平。
[0851]
可使用膜印迹法(诸如杂交分析中所用的，例如southern印迹、northern印迹、斑点印迹等)或微孔、样本管、凝胶、珠或纤维(或包含经结合的核酸的任何固相支撑物)监测载脂蛋白c3 mrna的表达水平。参见，美国专利第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305 号、第5,677,195号和第5,445,934号，这些专利通过引用并入本文。载脂蛋白c3表达水平的测定还可包含使用溶液中的核酸探针。
[0852]
在优选实施方案中，使用分支dna(bdna)分析或实时pcr(qpcr)来评估mrna表达的水平。这些方法的用途在本文的实施例中进行了描述和举例说明。在优选实施方案中，使用实施例2 中提供的方法，使用10nm sirna浓度，在物种匹配细胞中测定表达水平。
[0853]
apoc3蛋白表达的水平可使用本领域中已知用于测定蛋白质水平的任何方法来测定。此类方法包括，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相层析(hplc)、薄层层析(tlc)、超扩散层析、液体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱分析、比色分析、分光光度分析、流式细胞术、免疫扩散(单次或二次)、免疫电泳、蛋白印迹、放射免疫分析(ria)、酶联免疫吸附分析(elisa)、免疫荧光分析、电化学发光分析等。
[0854]
在一些实施方案中，本发明的方法的效力是通过c3 mrna或蛋白质水平(例如，在肝脏活检样本中)的降低来评估的。
[0855]
在本发明的方法的一些实施方案中，将irna施用至受试者，使得irna被递送至该受试者体内的具体部位。载脂蛋白c3表达的抑制可通过测量来源于该受试者具体部位(例如，肝脏或血液)的体液或组织的样本中的载脂蛋白c3 mrna或载脂蛋白c3蛋白质的水平或
水平变化进行评估。
[0856]
如本文所用，术语检测或确定分析物的水平应理解为意指执行该步骤以确定材料例如蛋白质、rna的存在与否。如本文所用，检测或确定的方法包括检测或确定低于所使用方法的检测水平的分析物水平。
[0857]
vii.本发明的预防和治疗方法
[0858]
本发明还提供了使用本发明的irna或含有本发明的irna的组合物来抑制载脂蛋白c3的表达的方法，从而预防和治疗载脂蛋白c3 相关病症例如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管疾病，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。在本发明的方法中，细胞可在体内或体外与sirna接触，即，细胞可在受试者体内。
[0859]
适用于使用本发明的方法处理的细胞可以是任何表达载脂蛋白c3基因的细胞，例如，肝脏细胞、脑细胞、胆囊细胞、心脏细胞或肾细胞，但优选是肝脏细胞。适用于在本发明的方法中使用的细胞可以是哺乳动物细胞，例如，灵长动物细胞(诸如人类细胞，包括嵌合非人动物内的人类细胞，或非人类灵长动物细胞例如猴细胞或黑猩猩细胞) 或非灵长动物细胞。在某些实施方案中，该细胞是人类细胞，例如人类肝脏细胞。在本发明的方法中，细胞中的载脂蛋白c3表达被抑制了至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或被抑制到低于分析的检测水平。
[0860]
本发明的体内方法可包括对受试者施用含有irna的组合物，其中该irna包括与待施用该rnai剂的哺乳动物的载脂蛋白c3 基因的rna转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。该组合物可通过本领域中已知的任何方式施用，包括但不限于，口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气管(气溶胶)、鼻内、直肠内和局部(包括颊腔和舌下)施用。在某些实施方案中，该组合物是通过静脉内输液或注射施用的。在某些实施方案中，该组合物是通过皮下注射施用的。在某些实施方案中，该组合物是通过肌内注射施用的。
[0861]
一方面，本发明还提供了抑制载脂蛋白c3基因在哺乳动物体内的表达的方法。该方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞内载脂蛋白c3基因的dsrna的组合物，并将该哺乳动物维持足够长时间以获得载脂蛋白c3基因的mrna转录本的降解，从而抑制载脂蛋白 c3基因在细胞中的表达。基因表达的降低可通过本领域中已知的任意方法和本文中例如实施例2中所述的方法例如qrt-pcr来评估。蛋白质产生的减少可通过本领域中已知的任意方法例如elisa来评估。在某些实施方案中，将肝脏穿刺活检样本用作组织材料来监测载脂蛋白 c3基因或蛋白质表达的降低。在其他实施方案中，将血液样本用作监测载脂蛋白c3蛋白质表达的降低的受试者样本。
[0862]
本发明还提供了在有需要的受试者中的的治疗方法，例如被诊断为患有载脂蛋白c3相关病症的受试者，所述载脂蛋白c3相关病症是例如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管病症，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。
[0863]
本发明还提供了在有需要的受试者中的预防方法。本发明的治疗方法包括将本发明的irna，以预防有效量的靶向载脂蛋白c3基因的irna或包含靶向载脂蛋白c3基因的irna的组合物，施用给受试者(例如，将受益于载脂蛋白c3表达降低的受试者)。
[0864]
在一个实施方案中，载脂蛋白c3相关疾病是选自由下列所组成的组：高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管病症，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。
[0865]
在一个实施方案中，apoc3相关疾病是高甘油三酯血症或高甘油三酯水平。受试者例如人类受试者血清中的可指示高甘油三酯血症的甘油三酯水平在oh,r.c.et al.,(2007)american family physician, 75(9)：1366-1371中进行了描述。具体地，高甘油三酯血症可与“临界
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高血清甘油三酯水平(即，150mg/dl至199mg/dl或者1.70mg/dl至 2.25mmol/l)；“高血清甘油三酯水平”(即，200mg/dl至499mg/dl或者2.26mg/dl至5.64mmol/l)；或“极高甘油三酯水平”(即，500mg/dl 或更高，或者5.65mmol/l或更高)有关。
[0866]
在一个实施方案中，apoc3相关疾病是原发性高甘油三酯血症。“原发性高甘油三酯血症”是由环境或遗传性因素所致(例如，是无明显潜在医学因素的结果)。特征为原发性高甘油三酯血症的示例性疾病包括但不限于，家族性乳糜微粒血症(i型高脂蛋白血症)、原发性混合型高脂血症(5型)、家族性高甘油三酯血症(4型高脂蛋白血症)、家族性结合型高脂蛋白血症(2b型)及家族性异常β脂蛋白血症(3型高脂蛋白血症)。
[0867]
在另一实施方案中，apoc3相关疾病是继发性高甘油三酯血症。“继发性高甘油三酯血症”是由其他潜在病症及病况造成的或与之相关。此类病症和/或病况包括，例如，肥胖症、代谢综合征、糖尿病、脂肪肝、饮酒、肾病、妊娠、非酒精性脂肪性肝病、甲状腺功能减退、副蛋白血症(例如巨球蛋白血症中的高γ-球蛋白血症、骨髓瘤、淋巴瘤和淋巴细胞性白血病)、自体免疫病症(例如系统性红斑狼疮)、药物摄入 (例如抗逆转录病毒药物，包括利托那韦(ritonavir)及洛匹那韦 (lopinavir)；以及抗精神病药物，包括氯氮平及奥氮平)，参见，g.yuanet al.,(2007)canadian medical association journal,176(8)：1113-1120。
[0868]
任何可以导致高甘油三酯血症(例如，继发性高甘油三酯血症) 或者可以是高甘油三酯血症(例如，原发性或继发性高甘油三酯血症)的后果的病症均包括在术语“apoc3相关病症”中。apoc3相关病症的非限制性示例包括代谢障碍，例如，非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管疾病，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。
[0869]
本发明的irna可作为“游离irna”施用。游离irna是在不存在药物组合物时施用。裸irna可在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包括醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐、或其任何组合。在一个实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。可调节含有irna的缓冲溶液的ph和渗透压，使得其适用于施用于受试者。
[0870]
或者，本发明的irna可作为药物组合物施用，例如作为 dsrna脂质体制剂施用。
[0871]
将受益于apoc3基因表达抑制的受试者是易患有或被诊断为患有载脂蛋白c3相关病症的受试者，该病症是诸如高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)；高血压；心血管疾病，例如，动脉粥样硬化；以及胰腺炎，例如，急性胰腺炎。
[0872]
在一个实施方案中，该方法包括施用本文提出的组合物，使得靶标载脂蛋白c3基因的表达降低，例如约每1、2、3、4、5、6、1 至6、1至3或3至6个月施用一次剂量。在某些实施
kyorin)。示例性基因疗法包括，例如，adgwegf 121.10(genvec)、apoal(ucb pharma/groupe fournier)、 eg-004(trinam)(ark therapeutics)和atp-结合盒转运体-al(abca1)(cvtherapeutics/incyte,aventis,xenon)。示例性糖蛋白ilb/iiia抑制剂包括，例如，洛昔非班(roxifiban)(也被称为dmp754，bristol-myers squibb)、甘托非班(gantofiban)(merck kgaa/yamanouchi)和克洛马非班 (cromafiban)(millennium pharmaceuticals)。示例性角鲨烯合成酶抑制剂包括，例如，bms-1884941(bristol-myers squibb)、cp-210172 (pfizer)、cp-295697(pfizer)、cp-294838(pfizer)及tak-475(takeda)。示例性mcp-i抑制剂是例如rs-504393(roche bioscience)。抗动脉粥样硬化剂bo-653(chugai pharmaceuticals)和烟酸衍生物 nyclin(yamanouchi pharmacuticals)也适合与本发明提出的dsrna组合施用。适用于与靶向apoc3的dsrna一起施用的示例性组合疗法包括，例如，advicor(烟碱酸/洛伐他汀，来自kos pharmaceuticals)、氨氯地平(amlodipine)/阿托伐他汀(pfizer)、以及依泽替米贝/辛伐他汀(例如，10/10、10/20、10/40及10/80片，来自merck/schering-ploughpharmaceuticals)。用于治疗高甘油三酯血症并且适用于与靶向apoc3 的dsrna组合施用的药物包括，例如，洛伐他汀、烟酸缓释片剂(andrx labs)、洛伐他汀片剂(pfizer)、氨氯地平苯磺酸酯、阿托伐他汀钙片剂(astrazeneca)、罗素伐他汀钙胶囊 (novartis)、氟伐他汀钠(reliant,novartis)、氟伐他汀钠片剂(parke-davis)、阿托伐他汀钙胶囊(gate)、niaspan缓释片剂(kos)、烟酸pravachol片剂(bristol-myers squibb)、普伐他汀钠片剂(abbott)、非诺贝特10/10片剂(merck/schering-ploughpharmaceuticals)、依泽替米贝辛伐他汀welchol
tm
片剂(sankyo)、盐酸考来维仑(colesevelam hydrochloride)片剂(schering)、依泽替米贝片剂(merck/schering-plough pharmaceuticals)、以及依泽替米贝片剂(merck)。
[0883]
在一个实施方案中，irna剂与pcsk9抑制剂组合施用。在一个实施方案中，pcsk9抑制剂是抗pcsk9单克隆抗体，例如衣伏库单抗(volocumab)和阿利库单抗(alirocumab)。在另一实施方案中，pcsk9抑制剂是靶向pcsk9的dsrna剂，例如，因利斯然(inclisiran)。在一个实施方案中，将irna剂施用至患者，然后再将其他治疗剂施用至患者(反之亦然)。在另一实施方案中，irna剂与其他治疗剂是同时施用的。
[0884]
在一个实施方案中，irna剂与依泽替米贝/辛伐他汀组合(例如，(merck/schering-plough pharmaceuticals))组合施用。在一个实施方案中，将irna剂施用至患者，然后再将其他治疗剂施用至患者(反之亦然)。在另一实施方案中，irna剂与其他治疗剂是同时施用的。
[0885]
irna剂和其他治疗剂和/或治疗可以是同时施用的和/或在同一组合中施用，例如肠胃外施用，或可将其他治疗剂作为分开的组合物的一部分施用或在分开的时间施用和/或通过本领域中已知或本文所述的另一方法施用。
[0886]
viii.试剂盒
[0887]
在某些方面，本公开提供了包括合适容器的试剂盒，该容器含有sirna化合物例如双链sirna化合物或ssirna化合物(例如，前体，例如，可加工为ssirna化合物的较大sirna化合物，或编码sirna 化合物的dna，例如，双链sirna化合物、或ssirna化合物或其前体)。
[0888]
此类试剂盒包括一种或多种dsrna剂和使用说明，例如，用于施用预防或治疗有效量的dsrna剂的使用说明书。dsrna剂可以在小瓶内或预填充的注射器内。试剂盒可任选地进一步包含用于施用 dsrna剂的构件(例如，注射装置，例如预填充的注射器)或用于测量对 apoc3的抑制的构件(例如，用于测量对apoc3 mrna、apoc3蛋白质和/或apoc3活性的抑制的构件)。此类用于测量对apoc3的抑制的构件可包含用于从受试者中获得样本如血浆样本的构件。本发明的试剂盒可任选地进一步包含用于确定治疗有效量或预防有效量的构件。
[0889]
在某些实施方案中，药物制剂的各个组分可提供在一个容器例如小瓶或预填充的注射器内。或者，可能需要在两个或更多个容器中单独提供药物制剂的组分，例如，一个用于sirna化合物的制备的容器以及至少另一个用于载体化合物的容器。试剂盒可包装成多种不同配置，例如单个盒子中的一个或多个容器。不同组分可组合，例如，根据试剂盒提供的使用说明书进行组合。可根据本文所述方法将组分进行组合，例如以制备并施用一种药物组合物。试剂盒还可包括递送装置。
[0890]
本发明通过下述实施例进一步说明，这些实施例不应被视为限制性的。本说明书中引用的所有参考文献、专利及已公开的专利申请的全部内容以及非正式的序列表和附图在此通过引用并入本文。
[0891]
实施例
[0892]
实施例1：irna合成
[0893]
试剂的来源
[0894]
若本文中未具体给出试剂的来源，则可从任何分子生物学试剂供应商处获得用于分子生物学应用的质量/纯度标准的此类试剂。
[0895]
sirna设计
[0896]
使用自定义的r和python脚本设计了靶向人类载脂蛋白c3 (apoc3)基因(人：ncbi refseqid nm_000040.3；ncbi geneid：345) 的sirna。人nm_000040.3refseq mrna的长度为535个碱基。
[0897]
未修饰的apoc3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表显示于表2和表4中。经修饰的载脂蛋白c3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表显示于表3和表5中。
[0898]
应当理解，在整个申请中，不带小数的双链体名称等同于带小数的双链体名称，该小数仅为双链体的批号。例如，ad-959917等同于ad-959917.1。
[0899]
sirna合成
[0900]
使用本领域中已知的常规方法合成sirna并退火。
[0901]
简而言之，使用mermade 192合成仪(bioautomation)，在固相支撑物上使用亚膦酰胺，以1μmol规格化学合成sirna序列。固相支撑物是负载有定制galnac配体(3
′‑
galnac缀合物)、通用固相支撑物 (am chemicals)或感兴趣的第一核苷酸的受控的多孔玻璃chemicals)或感兴趣的第一核苷酸的受控的多孔玻璃辅助合成试剂和标准2-氰基乙基亚膦酰胺单体(2
′‑
脱氧-2
′‑
氟基、 2
′‑
o-甲基、rna、dna)获自thermo-fisher(milwaukee,wi)、hongene (china)或chemgenes
(wilmington,ma,usa)。其他亚膦酰胺单体是从供应商处购得的、内部制备的、或使用来自各个cmo的定制合成获得的。在乙腈或9：1的乙腈：dmf中制备100mm浓度的亚膦酰胺，并使用5-乙硫基-1h-四唑(ett，在乙腈中的0.25m溶液)偶联，反应时间为400秒。使用3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮 (ddtt，获自chemgenes(wilmington,ma,usa))的100mm的溶液在无水乙腈/吡啶(9：1v/v)中生成硫代磷酸酯键。氧化反应的时间是5分钟。全部序列的合成都具有最后的移除dmt基团(“dmt去除”)。
[0902]
固相合成完成后，将固体支撑的寡核苷酸用300μl的甲胺 (40％水溶液)于室温在96孔板中处理约2小时，以从固相支撑物上裂解并且随后去除所有其他碱不稳定的保护基团。对于含有被叔丁基二甲基硅烷基(tbdms)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2
′‑
oh)的序列，使用tea.3hf(三乙胺三氢氟酸盐)进行第二次去保护步骤。向甲胺水溶液中的每种寡核苷酸溶液中加入200μl的二甲基亚砜(dmso)和300μl tea.3hf，并将该溶液在60℃孵育约30分钟。孵育之后，使板达到室温，并通过加入1ml的9：1的乙腈：乙醇或1：1的乙醇：异丙醇而将粗制寡核苷酸沉淀。然后将板在4℃离心45分钟，并在多通道移液器的辅助下小心地倾倒出上清液。将寡核苷酸沉淀物重新悬浮于20mmnaoac中，接着，在配备有自动进样器、uv检测器、导电计和馏分收集器的agilent lc系统上，使用hitrap尺寸排阻柱(5ml，ge healthcare) 脱盐。将经脱盐的样本收集于96孔板中，然后分别通过lc-ms和uv 分光光度计分析以证实材料的身份并定量。
[0903]
在tecan液体处理机器人上进行单链的双链体化。在96孔板中，将有义单链和反义单链以等摩尔比混合以达到在1
×
pbs中为10 μm的最终浓度，将板密封，在100℃孵育10分钟，之后令其在2至3 小时的时间段内缓慢恢复至室温。证实了每种双链体的浓度和身份，然后将其用于体外筛查分析中。
[0904]
实施例2：体外筛查方法
[0905]
细胞培养和384孔转染
[0906]
将hep3b细胞(atcc,manassas,va)于37℃在5％ co2气氛下，在补充有10％ fbs(atcc)的eagle’s minimum essential培养基(gibco)中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶化使其自板上释放。通过如下转染细胞：在96孔板的每一单孔中，将每孔14.8μl的opti-mem 加上0.2μl的lipofectamine rnaimax(invitrogen，carlsbad ca.cat# 13778-150)加入5μl的每种sirna双链体中。然后将混合物于室温孵育 15分钟。随后，将含有约2
×
104个hep3b细胞的80μl的无抗生素的完全生长培养基加至sirna混合物中。在rna纯化之前，将细胞孵育 24小时。在10nm和0.1nm的最终双链体浓度下进行单剂量实验，并使用10nm至128pm范围的8
×
5-倍连续稀释进行剂量反应实验。
[0907]
使用dynabeads mrna分离试剂盒进行的总rna分离：(invitrogen
tm
，part#：610-12)
[0908]
将细胞在每孔含有3μl珠子的75μl的裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器上混合10分钟。使用磁性板支架，在biotek el406 上自动进行洗涤步骤。将珠子在缓冲液a中洗涤(在90μl)一次，在缓冲液b中洗涤一次，并在缓冲液e中洗涤两次，且每两次洗涤之间都有抽吸步骤。最后一次抽吸之后，将完整的10μl rt混合物添加到每一孔中，如下所述。
[0909]
使用abi高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems,fostercity,ca,cat#4368813)的cdna合成
[0910]
在每个反应中，将1μl 10
×
缓冲液、0.4μl 25
×
dntp、1.5μl 随机引物、0.5μl逆转录酶、0.5μl rnase抑制剂和6.6μl的h2o的主混合液添加到每孔中。将板密封，在静电振荡器上搅动10分钟，随后在37℃孵育2小时。此后，将板在80℃搅动8分钟。
[0911]
实时pcr
[0912]
在384孔板(roche目录号04887301001)的每孔中，将2微升 (μl)的cdna加入到含有0.5μl人gapdh taqman探针(4326317e)、0.5μl 人apoc3、2μl无核酸酶水和5μl lightcycler 480探针主混合物(roche 目录号04887301001)的主混合液中。实时pcr是在lightcycler480实时pcr系统(roche)中进行的。
[0913]
为了计算相对倍数变化，使用δδct方法分析数据并将该数据相对于使用以10nm ad-1955转染或模拟转染的细胞所进行的测定归一化。使用以xlfit进行的4参数拟合模型计算ic
50
，并将其相对于使用ad-1955转染或模拟转染的细胞归一化。ad-1955的有义序列和反义序列为：有义cuuacgcugaguacuucgadtsdt(seq id no：22)和反义 ucgaaguacucagcguaagdtsdt(seq id no：23)。
[0914]
在hep3b细胞中进行的表3及表5所列的dsrna剂的筛查结果分别显示于表6和表7中。
[0915]
表1.核酸序列表示法中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解，当这些单体存在于寡核苷酸中时，其是通过5
′‑3′‑
磷酸二酯键相互连接的。
[0916]
[0917]
[0918]
[0919]
[0920]
[0921]
[0922]
[0923]
[0924]
[0925]
[0926]
[0927]
[0928]
[0929]
[0930]
[0931]
[0932]
[0933]
[0934]
[0935]
[0936]
[0937]
[0938]
[0939]
[0940][0941]
表6.hep3b细胞中的apoc3单剂量筛选
[0942]
[0943]
[0944][0945][0946]
表7.hep3b细胞中的apoc3单剂量筛选
[0947]
[0948]
[0949]
[0950][0951]
实施例3：在小鼠中的dsrna双链体的体内筛查
[0952]
对从上述体外研究鉴定出的感兴趣的双链体在体内进行评估。具体地，在给药前的第14天，通过眶后施用2x10
10
个编码人类 apoc3的腺相关病毒8(aav8)载体的病毒颗粒，以转导野生型小鼠 (c57bl/6)。具体地，向小鼠施用编码人apoc3 mrna的aav8，其被称为aav8-tbg-pi-apoc3。
[0953]
在第0天，对一组的三只小鼠皮下施用3mg/kg的单次剂量的感兴趣的剂或pbs对照。表8提供了处理组，而表9提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的经修饰的核苷酸序列。在给药后的第7天或第14天，处死动物，收集肝脏样本并于液态氮中速冻。提取肝脏mrna 并通过rt-qpcr方法进行分析。
[0954]
将人apoc3 mrna水平与管家基因gapdh进行比较。随后将该值归一化为pbs载剂对照组的平均值。数据表示为相对于基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。列举于表10中并显示于图 1中的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效地减低了体内人apoc3 信使rna的水平。
[0955]
表8.处理组
[0956]
[0957]
[0958][0959]
表9.感兴趣的双链体
[0960][0961]
表10
[0962]
[0963][0964]
对从上述体外研究鉴定出的感兴趣的其他双链体也进行了体内评估。具体地，在给药前第14天，通过眶后施用2
×
10
10
个编码人类 apoc3的腺相关病毒8(aav8)载体的病毒颗粒，以转导野生型小鼠 (c57bl/6)。具体地，向小鼠施用编码人apoc3 mrna的aav8，其被称为aav8-tbg-pi-apoc3。
[0965]
在第0天，对一组三只小鼠皮下施用3mg/kg的单次剂量的感兴趣的剂或pbs对照。表11提供了处理组，而表12提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的经修饰的核苷酸序列。在给药后的第7天或第14天，处死动物，收集肝脏样本并于液态氮中速冻。提取肝脏mrna 并通过rt-qpcr方法进行分析。
[0966]
将人apoc3 mrna水平与管家基因gapdh进行比较。随后将该值归一化为pbs载剂对照组的平均值。数据表示为相对于基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。列举于表13中并显示于图 2中的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效地减低了体内人apoc3 信使rna的水平。
[0967]
表11.处理组
[0968]
[0969]
[0970][0971]
表12.其他感兴趣的双链体
[0972][0973]
表13
[0974]
[0975][0976]
实施例4：结构-活性关系分析
[0977]
基于实施例2中的体外分析及实施例4中的体内分析，进行了结构-活性关系(sar)分析。具体地，设计、合成并在体外和体内分析了其他双链体。设计了以靶向nm_000040.3的核苷酸429至455或核苷酸504至532内的其他剂。
[0978]
使用本领域中已知且描述于上文中的常规方法合成sirna并退火。
[0979]
表14显示了未修饰的apoc3有义链和反义链核苷酸序列的详细列表。表15显示了经修饰的载脂蛋白c3有义链和反义链核苷酸序列的详细列表。
[0980]
对于自由摄取，通过将在pbs中的sirna双链体以每孔2.5μl 添加到96孔板中进行实验。然后，将含有约1.5
×
104个hep3b细胞的完全生长培养基(47.5μl)添加到sirna中。在rna纯化和rt-qpcr之前，将细胞孵育48小时，如上文所述。在500nm、100nm、10nm和 1nm的最终双链体浓度下进行单次剂量实验。
[0981]
为了转染，将hep3b细胞(atcc,manassas,va)于37℃在5％ co2气氛下，在补充有10％ fbs(atcc)的eagle’s minimum essential 培养基(gibco)中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶化使其自板上释放。通过如下进行转染：在384孔板的每一单孔中，将每孔7.5μl的 opti-mem加上0.1μl的lipofectamine rnaimax(invitrogen,carlsbad ca.cat#13778-150)添加到2.5μl的每种sirna双链体中。然后将混合物于室温孵育15分钟。随后，将含有约1.5
×
104个hep3b细胞的40μl 的无抗生素的完全生长培养基加至sirna混合物中。在rna纯化之前，将细胞孵育24小时。在50nm、10nm、1nm及0.1nm的最终双链体浓度下进行单次剂量实验。
[0982]
使用dynabead进行总rna的分离。简而言之，将细胞在每孔含有3μl珠子的10μl的裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器上混合10分钟。使用磁性板支架，在biotek el406上自动进行洗涤步骤。将珠子在缓冲液a中洗涤(在3μl中)一次，在缓冲液b中洗涤一次，并且在缓冲液e中洗涤两次，每两次洗涤之间都有抽吸步骤。最后一次抽吸之后，将完整的12μl rt混合物添加到每孔中，如下所述。
[0983]
对于cdna合成，每个反应中，将1.5μl 10
×
缓冲液、0.6μl 10
×
dntp、1.5μl随机引物、0.75μl逆转录酶、0.75μl rnase抑制剂和 9.9μl的h2o的主混合液添加到每孔中。将板密封，在静电振荡器上搅动10分钟，随后在37℃孵育2小时。此后，将板在80℃搅动8分钟。
[0984]
如上文所述进行rt-qpcr，并且如上文所述计算相对倍数变化。
[0985]
表16显示了表14及表15中所列的dsrna剂的自由摄取实验的结果，而表17显示了表14及表15所列的dsrna剂在hepb细胞中的转染分析的结果。
[0986]
[0987]
[0988]
[0989]
[0990]
[0991]
[0992]
[0993]
[0994][0995]
表16.hep3b细胞中的单剂量自由摄入筛查
[0996]
[0997]
[0998][0999]
表17.hep3b细胞中的apoc3单剂量筛查
[1000]
[1001]
[1002][1003]
对从上述体外sar研究鉴定出的感兴趣的双链体进行了体内评估。具体地，在给药前的第14天，通过眶后施用2
×
10
10
个编码人类 apoc3的腺相关病毒8(aav8)载体的病毒颗粒，以转导野生型小鼠 (c57bl/6)。具体地，向小鼠施用编码人apoc3 mrna的aav8，其被称为aav8-tbg-pi-apoc3。
[1004]
在第0天，对一组三只小鼠皮下施用3mg/kg的单次剂量的感兴趣的剂或pbs对照。表18提供了处理组，而表19提供了感兴趣的双链体。在给药后的第7天或第14天，处死动物，收集肝脏样本并于液态氮中速冻。提取肝脏mrna并通过rt-qpcr方法进行分析。
[1005]
将人apoc3 mrna水平与管家基因gapdh进行比较。随后将该值归一化为pbs载剂对照组的平均值。数据表示为相对于基线值的百分比，并呈现为均值加上标准偏差。列举于表20并显示于图3中的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效地减低了体内人apoc3信使rna的水平。
[1006]
表18.处理组
[1007]
[1008]
[1009][1010]
表19.感兴趣的双链体
[1011][1012]
表20
[1013]
[1014][1015]
等同物
[1016]
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定与本文所述具体实施方案和方法等效的实施方案和方法。此类等效的实施方案和方法旨在包含在下述权利要求的范围内。