本发明涉及过继性疗法领域。本发明提供具有增强的体内扩增、存活和功能性的socs1缺陷的免疫细胞。
背景技术：
：：1、过继性t细胞疗法(atct)，包括用重组t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)或肿瘤浸润淋巴细胞(til)工程化的t细胞，正成为有力的癌症疗法。2、体外生产过程能够对具有复杂的感知-应答行为的cd4和cd8 t细胞活性药物的异源混合物进行遗传重编程(lim et june 2017)。尽管单独的cd8或cd4 t细胞可发挥显著的治疗作用(freitas et rocha 2000)，但共同注射两种亚型通常是优化和持续抗肿瘤活性的关键要求(linnemann,schumacher,et bendle 2011；sadelain 2015；borst etal.2018)。cd4 t细胞显示多效性和可塑性，可通过两种辅助细胞增强抗肿瘤免疫应答(corthay et al.2005；bos et sherman 2010；z.zhu et al.2015)和细胞毒性功能(xieet al.2010；quezada et al.2010；kitano et al.2013；et al.2020a)。3、然而，活化的cd4和cd8 t细胞在其体内增殖和持续的能力方面不同。虽然cd8 t细胞经历广泛和自主的克隆扩增，但cd4 t细胞需要重复的抗原触发并且在早期分裂中表现出增殖停滞，导致约10-20倍更少的扩增(homann,teyton,et oldstone 2001；foulds etal.2002；seder et ahmed 2003；ravkov et williams 2009)。4、cd4和cd8 t细胞扩增的数量和持续时间的差异不是由于外部信号或对资源的竞争(参见上述参考文献)。相反，通过比较初始和抗原经验的(ag-exp)cd4 t细胞在抗原刺激后进入免疫应答，若干研究报道了ag-exp cd4 t细胞特异性减少它们自身的增殖并表现出降低的il2产生(foulds et al.2002；merica et al.2000；macleod,kappler,et marrack2010；helft et al.2008)。本发明人先前已经开发了再现了正在进行的免疫应答过程中ag-exp cd4 t-细胞的功能失调性扩增的体内模型。在这种生理学相关模型中，可推广到若干cd4 tcr-转基因(tg)t细胞，ag-exp cd4 t-细胞扩增被固有地消除，而原始cd4 t细胞增殖被维持，这证明缺乏ag-exp cd4增殖与引发不足无关(helft et al.2008)。他们先前报道的强抑制是ag特异性的，在第2天(ag消失前很久)开始，并且既不是由于外在因素，如调节性t细胞(treg)、缺乏抗原呈递细胞(apc)培养，也不是由于对ag的竞争(helft etal.2008)。相反，他们表明ag-exp cd4 t细胞被固有的、活性的和显性的现象所阻止，这不能通过提供新的ag-加载的dc来克服。5、在过继性t细胞疗法(atct)的情况下，其中t细胞在工程化过程之前在体外被活化，ag-exp cd4 t-细胞可在回忆条件下在体内变成限制性亚群，损害有效的保护性免疫应答(homann,teyton,et oldstone 2001)。涉及这种有限扩增的潜在分子机制是未知的，但可干扰atct功效，因为小剂量的t细胞输注到患者中。6、因此，仍然需要在过继转移后表现出增强的扩增能力和存活的工程化免疫细胞，特别是工程化t细胞。还仍然需要具有改进的功能效力，特别是具有改进的细胞毒性潜力的工程化t细胞，其将支持有效和大规模的癌症治疗。7、此外，自体t细胞的制备是冗长、昂贵的并且通常效率低。为了确保作为药物的atc疗法的稳定建立，来自健康供体的良好表征的、库存的和预制的治疗细胞将解决这些限制。因此，开发不被受体免疫系统排斥的有效同种异体t细胞的努力满足了重要的临床需要。8、因此，本发明人正在研究t细胞对宿主免疫消除的固有抗性，目的是从健康供体产生通用细胞疗法。尽管自体治疗性cart-细胞的使用迄今为止已经产生了突出的临床数据(neelapu et al.2017；maude et al.2018)，其具有某些众所周知的缺点。9、首先，复杂的个性化制备降低了它们的可扩展性(graham et al.2018)。此外，当前的制备过程需要大约3周(et al.2018)，这限制了它们的可用性，尤其是对于患有高度增殖性疾病的患者(depil et al.2020)。最后，自体t细胞效力可能受到来自肿瘤微环境的先前治疗路线或免疫抑制的负面影响(thommen et schumacher 2018)。10、相反，尽管使用来自健康供体的同种异体t细胞产物(hla错配的)允许立即获得标准化的t细胞批次，改进了它们的功效(多种细胞修饰、靶的组合)，降低了它们的成本和工业化过程(lin et al.2019)，但这与两个主要困难相关联。首先，同种异体t细胞的转移可引起危及生命的疾病，即由供体t淋巴细胞诱导的移植物抗宿主疾病(gvhd)。预防它的一个策略是tcrα恒定(trac)基因的遗传失活。其次，tcr阴性同种异体t细胞仍能被非自身hla识别并被宿主的免疫系统迅速清除，这将限制它们的抗肿瘤活性。对此，已经提出在通用型car-t细胞输注之前用化疗或辐射进行淋巴耗尽，以延迟排斥，直到受体免疫系统恢复(gattinoni et al.2005)，但它们与明显的毒性和成问题的病毒再活化有关(chakrabarti,hale,et waldmann 2004)。11、由于hla-i分子是免疫排斥的关键介质，另一种提议的策略是对于在细胞表面上形成功能性hla i类分子是必不可少的β2-微球蛋白的遗传破坏(poirot et al.2015；d.wang et al.2015；torikai et al.2013)。然而，这些细胞可能成为对hla表达降低(缺失自身机制)敏感的nk细胞的靶标(bern et al.2019)。12、预防nk介导的排斥的解决方案可依赖于hla-e分子(gornalusse et al.2017)，抑制性复合物cd94/ngk2a的配体(braud et al.1998)或hla-g(通常由细胞滋养层表达，与抑制性受体kir2dl4/it2结合)的过表达(rajagopalan et long 1999；pazmany et al.1996；gonen-gross et al.2010)。13、最后，使用结合car技术的低免疫原性细胞诱导的多能干(ips)也可以提供具有抗原特异性和不依赖于hla限制的淋巴细胞的有希望和无限的来源(themeli et al.2013)。然而，困难仍然存在，特别是对于目前不是良好生产实践(gmp)相容的分化方法，因为它们包括血清和鼠源饲养细胞的存在。此外，由于其涉及多步分化过程，发育转换可以以不同的效率发生。14、因此，生产用于临床应用，特别是用于同种异体转移的成熟单阳性t细胞仍然是一种挑战(nianias et themeli 2019)。15、发明概述16、本发明人已经开发了使用crispr技术在全基因组(gw)水平遗传操纵原代t细胞的策略。这种创新途径允许快速、系统且无偏鉴定t细胞内在限制因素，体内功能上无冗余(13，14)。首先，本发明人探究了限制再激发的cd4 t细胞在体内扩增的内在因子。它们的筛选将细胞因子信号转导抑制剂1(socs1)鉴定为cd4+t-细胞增殖和存活的非冗余和内在抑制剂。他们证明socs1是关键节点，整合细胞因子信号(ifn-γ和il-2)以积极限制cd4+t细胞功能。本发明人研究了socs1在小鼠和人cd4+和cd8+抗肿瘤过继性细胞疗法中的功能。socs1失活恢复了cd4+t辅助细胞-1(th1)的扩增以及细胞毒性功能，而在cd8+t细胞中，它极大地增强了细胞毒性潜力。17、然后，使用类似的体内全基因组筛选策略并通过将来自c57bl6小鼠(h2-kb)的全基因组突变的marilyn t库转移到完全免疫活性的balb/c(h2-kd)mhc错配小鼠中，本发明人重新鉴定了β2m，其表达降低与自然界(lanza,russell,et nagy 2019)，特别是癌症(koopman et al.2000；he et al.2017)中的免疫逃避一致。此外，完全出乎意料的是，本发明人已经鉴定了现在被证实为改进体内同种异体t细胞存活的主要靶标的fas(cd95,tnfrsf6)。这些结果代表了开发基于同种异体移植的通用型(同种异体)细胞疗法(例如免疫细胞疗法)的主要进步。18、本发明人还提供了支持socs1和fas失活的组合提供“抗自相残杀/同种异体死亡”通用型t细胞产品的结果。19、因此，本发明涉及修饰的或工程化的免疫细胞，特别是修饰的t细胞，其中socs-1被失活。在一些实施方案中，所述免疫细胞也是fas和/或suv39h1缺陷的。20、典型地，本技术1的工程化免疫细胞是t细胞或nk细胞。更特别地，t细胞是cd4+或cd8+ t细胞。优选的细胞可选自天然t细胞(tn细胞)、干记忆t细胞(tscm细胞)、记忆t细胞(tcm细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)或效应记忆t细胞(tem细胞)及其组合。21、典型地，工程化的免疫细胞也分离自受试者。优选地，所述受试者罹患癌症，或处于罹患癌症的风险中。22、基因工程化的抗原受体特异性结合的靶抗原优选在癌细胞上表达和/或是通用肿瘤抗原。23、基因工程化的抗原受体可以是嵌合抗原受体(car)，其包含特异性结合靶抗原的细胞外抗原识别结构域。基因工程化的抗原受体也可以是t细胞受体(tcr)。24、优选地，所述工程化免疫细胞中的socs-1的活性和/或表达以及还有一些实施方案中的fas和/或suv39h1的活性和/或表达被选择性抑制或阻断。在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞表达分别编码无功能的socs-1、fas或suv39h1蛋白的socs-1、fas或suv39h1核酸。25、本技术还涉及产生基因工程化的免疫细胞，特别是通用型免疫细胞(可用于同种异体移植，特别是同种异体过继细胞疗法)的方法，包括在于抑制免疫细胞中的socs-1和/或fas的表达和/或活性，并且在一些实施方案中进一步抑制β2m和/或suvh39h1的表达和/或活性的步骤；和任选地在于向免疫细胞中引入特异性结合靶抗原的基因工程化的抗原受体的步骤。26、在一些实施方案中，socs-1、fas、suv39h1或β2m活性和/或表达的抑制包括使细胞与至少一种抑制socs-1、fas、suv39h1或β2m蛋白的表达和/或活性和/或破坏fas、β2m、socs-1和/或suv39h1基因的试剂接触或使其接触。所述试剂可选自小分子抑制剂；抗体衍生物；适体；阻断转录或翻译的核酸分子或分别靶向socs1、fas、suv39h1或b2n基因的基因编辑剂。27、本发明还涉及如本文所述的工程化免疫细胞，或包含所述工程化免疫细胞的组合物，其用于过继性细胞疗法，特别是癌症的过继性疗法。28、发明详述29、定义30、在本文中术语“抗体”以最广义使用，且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(fab)片段、f(ab’)2片段、fab’片段、fv片段、重组igg(rlgg)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(vh)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scfv))和单结构域抗体(例如sdab、sdfv、纳米抗体)片段。该术语涵盖基因工程化和/或其他修饰的免疫球蛋白形式，诸如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂缀合物抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双抗体、三抗体和四抗体、串联二scfv、串联三scfv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整的或全长的抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括igg及其亚类、igm、ige、iga和igd。31、“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2；双抗体；线性抗体；可变重链(vh)区、单链抗体分子(诸如scfv)和单结构域vh单抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在具体实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，诸如scfv。32、“单结构域抗体”是包含抗体的全部或一部分重链可变域或全部或一部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。33、如本文所用，基因表达的“抑制”是指与不存在抑制时基因产物的表达水平相比，消除或减少细胞中由主题基因编码的一种或多种基因产物的表达。示例性的基因产物包括由基因编码的mrna和蛋白质产物。抑制在某些情况下是瞬时的或可逆的，而在其它情况下是永久的。尽管事实上可能产生截短的或非功能性产物，但在一些情况下抑制是功能性或全长蛋白质或mrna产物。在本文的一些实施方案中，与表达相反，基因活性或功能被抑制。基因抑制通常通过人工方法诱导，即通过添加或引入化合物、分子、复合物或组合物，和/或通过破坏基因的核酸或与基因相关，例如在dna水平。用于基因抑制的示例性方法包括基因沉默、敲低、敲除和/或基因破坏技术，例如基因编辑。实例包括反义技术，例如rnai、sirna、shrna和/或核酶，其通常导致表达的瞬时降低，以及基因编辑技术，其导致靶基因失活或破坏，例如通过诱导断裂和/或同源重组。34、如本文所用，基因的“破坏”是指在dna水平上基因序列的改变。实例包括插入、突变和缺失。破坏典型地导致基因编码的正常或“野生型”产物的抑制和/或完全不表达。这种基因破坏的示例是插入、移码和错义突变，基因或基因部分的缺失、敲入和敲除，包括整个基因的缺失。这种破坏可发生在编码区中，例如在一个或多个外显子中，导致不能产生全长产物、功能性产物或任何产物，诸如通过插入终止密码子。这种破坏也可通过启动子或增强子或其他影响转录激活的区域中的破坏而发生，从而阻止基因的转录。基因破坏包括基因靶向，包括通过同源重组的靶向基因失活。35、本发明的细胞36、根据本发明的细胞典型是真核细胞，例如哺乳动物细胞(在本发明中也称为动物细胞)，例如人细胞。37、更特别地，本发明的细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官(特别是胸腺)，且是免疫系统的细胞(即免疫细胞)，诸如先天或适应性免疫的细胞；例如，髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，典型地是t细胞和/或nk细胞。38、优选地，根据本发明，细胞特别是淋巴细胞，包括t细胞、b细胞和nk细胞。39、根据本发明的细胞也可以是免疫细胞祖细胞，诸如淋巴祖细胞，更优选地是t细胞祖细胞。40、典型地，t细胞祖细胞表达一组共有标志物，包括cd44、cd117、cd135和sca-1，也可参见petrie ht,kincade pw.many roads,one destination for t cellprogenitors.the journal of experimental medicine.2005；202(1):11-13。41、典型地，细胞是原代细胞，诸如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的细胞。42、针对待治疗的受试者，本发明的细胞可以是同种异体的和/或自体的。43、在一些实施方案中，细胞包括t细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，诸如完整t细胞群、cd4+细胞、cd8+细胞及其亚群，诸如由功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或存留能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度定义的那些。44、t细胞和/或cd4+和/或cd8+ t细胞的亚型和亚群是初始t(tn)细胞、效应t细胞(teff)、记忆t细胞及其亚型，诸如干细胞记忆t(tscm)、中央记忆t(tcm)、效应记忆t(tem)或终末分化的效应记忆t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、未成熟t细胞、成熟t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、粘膜相关性不变t(mait)细胞、天然存在的和适应性调节性t(treg)细胞、辅助性t细胞(诸如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞)、卵泡辅助性t细胞、α/βt细胞和δ/γt细胞。优选地，根据本发明的细胞是由于抑制了suv39h1而具有干/记忆特性和更高的重构能力的teff细胞，以及tn细胞、tscm、tcm、tem细胞及它们的组合。45、在一些实施方案中，使一个或多个t细胞群富集或耗竭对一种或多种特定标志物(例如表面标志物)呈阳性或表达高水平的细胞，或对一种或多种标志物呈阴性或表达相对较低水平的细胞。在一些情况下，这些标志物是在某些t细胞群(诸如非记忆细胞)上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他t细胞群(诸如记忆细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一个实施方案中，使细胞(诸如，cd8+细胞或t细胞，例如，cd3+细胞)富集(即阳性选择)对cd117、cd135、cd45ro、ccr7、cd28、cd27、cd44、cd127和/或cd62l阳性或表达高表面水平的细胞和/或耗竭(例如，阴性选择)对cd45ra阳性或表达高表面水平的cd45ra的细胞。在一些实施方案中，使细胞富集或耗竭对cd122、cd95、cd25、cd27和/或il7-ra(cd127)阳性或表达高表面水平的细胞。在一些实例中，使cd8+ t细胞富集对cd45ro阳性(或对cd45ra阴性)和对cd62l阳性的细胞。46、例如，根据本技术，细胞可以包括cd4+ t细胞群和/或cd8+ t细胞亚群，例如富集中央记忆(tcm)细胞的亚群。或者，该细胞可以是其他类型的淋巴细胞，包括自然杀伤(nk)细胞、mait细胞、先天淋巴样细胞(ilc)和b细胞。47、根据本发明用于工程化的细胞和含有细胞的组合物分离自样品，特别是生物样品，例如获自受试者或衍生自受试者。典型地，受试者需要细胞疗法(过继性细胞疗法)和/或将要接受细胞疗法。受试者优选是哺乳动物，特别是人。在本技术的一个实施方案中，所述受试者患有癌症。48、样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(诸如分离、离心、基因工程(例如病毒载体转导))、洗涤和/或孵化的样品。因此，生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经加工的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液；组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。优选地，从其衍生或分离细胞的样品是血液或血液来源的样品，或衍生自单采血液分离术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(典型地为过继性细胞疗法)下，样品包括自体和同种异体来源的样品。49、在一些实施方案中，细胞衍生自细胞系，例如t细胞系。这些细胞也可以获自异种来源，诸如小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。优选地，该细胞是人细胞。50、socs-1缺陷的细胞51、本公开涵盖细胞，更具体地socs1缺陷的免疫细胞。在一些实施方案中，socs1缺陷的细胞可以进一步对于fas、β2m、suv39h1或它们的组合是缺陷的。52、如本文所用，术语“socs-1”或“细胞因子信号转导抑制剂1”具有其在本领域中的一般含义并且是socs家族蛋白的一部分，所述socs家族蛋白形成调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分。在人基因组中编码有8种socs蛋白，socs1-7和cis。所有8个由sh2结构域和短的c-末端结构域(socs盒1)的存在定义。发现所有socs蛋白的socs盒与适体复合物，elonginb，c相关。这种缔合允许募集e3泛素连接酶支架(cullin5)以催化由其sh2结构域募集的信号转导中间体的泛素化(kamizono s et al.,“the socs box of socs-1accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of tel-jak2”.j biol chem.2001apr20；276(16):12530-8)。53、除了它们的泛素连接酶活性之外，socs1和socs3在还具有直接抑制jak(janus激酶)的激酶活性的能力方面是独特的。该活性依赖于短基序，其直接位于sh2结构域的上游，称为kir(激酶抑制区)。socs1的kir是jak的高度进化抑制剂，并且该基序内的任何残基(包括模拟底物酪氨酸的组氨酸残基)的突变导致亲和力的显著降低。socs1特别是尤其jak1和jak2以及tyk2催化活性的直接、有效和选择性抑制剂，因此典型地涉及通过jak/stat3途径发信号的多种细胞因子的负调节，所述细胞因子包括白介素-4(il-4)、il-6、il-2、干扰素(ifn)-α、干扰素(ifn)-γ、催乳素、生长激素和红细胞生成素(关于socs1活性的详细信息，尤其参见：sharma j,larkin j 3rd.“therapeutic implication of socs1 modulationin the treatment of autoimmunity and cancer”.front pharmacol.2019；10:324；liaunpd,laktyushin a,lucet is,et al.“the molecular basis of jak/stat inhibitionby socs1”.nat commun.2018；9(1):1558)；sporri b,kovanen pe,sasaki a,yoshimuraa,leonard wj.“jab/socs1/ssi-1is an interleukin-2-induced inhibitor of il-2signaling”.blood.2001；97(1):221-226；alexander ws,starr r,fenner je,et al.“socs1 is a critical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents thepotentially fatal neonatal actions of this cytokine”.cell.1999；98(5):597-608as well as kamizono s,hanada t,yasukawa h,et al.“the socs box of socs-1accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of tel-jak2.”j biol chem.2001；276(16):12530-12538；and frantsve j,schwaller j,sternberg dw,kutok j,gillilanddg.“socs-1inhibits tel-jak2-mediated transformation of hematopoietic cellsthrough inhibition of jak2 kinase activity and induction of proteasome-mediated degradation.”mol cell biol.2001；21(10):3547-3557)。该蛋白也称为jak结合蛋白(jab)、stat诱导的stat抑制剂1(ssi-1)或tec相互作用蛋白3(tip-3)。人socs-1蛋白在uniprot中称为o15524，并且由位于染色体16(11，254，408-11，256，204反向链)上的基因socs-1编码，并且在ensembl数据库中称为ensg00000185338。术语socs-1还涵盖所有socs-1直向同源物。在一些实施方案中，根据本发明的蛋白socs-1具有seq id no:1：54、mvahnqvaadnavstaaeprrrpepssssssspaaparprpcpavpapapgdthfrtfrshadyrritrasalldacgfywgplsvhgaherlraepvgtflvrdsrqrncffalsvkmasgptsirvhfqagrfhldgsresfdclfellehyvaaprrmlgaplrqrrvrplqelcrqrivatvgrenlariplnpvlrdylssfpfqi55、如本文所用，根据本发明的表述“socs-1缺陷”是指抑制或阻断socs-1活性，例如阻断socs1与jak的结合和/或阻断e3泛素连接酶支架(cullin5)通过elonginbc的募集。在一些实施方案中，socs1的抑制可通过防止socs1与jak(包括jak1/2和/或tyk2)结合和/或通过防止socs1盒与e3复合物募集的重要中间体elongin c结合来获得。56、还如本文所用，术语“suv39h1”或“h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1”具有其在本领域中的一般含义，并且是指组蛋白甲基转移酶“色斑3-9抑制因子同系物1(果蝇)”，其使用单甲基化的h3-lys-9作为底物特异性地使组蛋白h3的lys-9残基三甲基化(还参见aagaard l,laible g,selenko p,schmid m,dorn r,schotta g,kuhfittig s,wolf a,lebersorger a,singh pb,reuter g,jenuwein t(jun 1999)."functional mammalianhomologues of the drosophila pev-modifier su(var)3-9encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component m3 1".embo j 1 8(7):1923-38)。所述组蛋白甲基转移酶也称为mg44、kmt1a、suv39h、suv39h1、组蛋白-赖氨酸n-甲基转移酶suv39h1、h3-k9-hmtase1,otthump00000024298,su(var)3-9同系物1、赖氨酸n-甲基转移酶1a、组蛋白h3-k9甲基转移酶1、位置效应色斑3-9同系物、组蛋白-赖氨酸n-甲基转移酶或h3赖氨酸-9特异性1。人suv39h1甲基转移酶在uniprot中称为o43463，并且由位于染色体x上的基因suv39h1(ncbi中的基因id：6839)编码。根据本发明的术语suv39h1还涵盖suv39h1的所有直向同源物，如su(var)3-9。在一些实施方案中，根据本发明的蛋白suv39h1具有seq id no:2或3。57、seq id no:2:58、maenlkgcsvccksswnqlqdlcrlaklscpalgiskrnlydfeveylcdykkireqeyylvkwrgypdsestweprqnlkcvrilkqfhkdlerellrrhhrsktprhldpslanylvqkakqrralrrweqelnakrshlgritvenevdldgpprafvyineyrvgegitlnqvavgcecqdclwaptggccpgaslhkfayndqgqvrlraglpiyecnsrcrcgydcpnrvvqkgirydlcifrtddgrgwgvrtlekirknsfvmeyvgeiitseeaerrgqiydrqgatylfdldyvedvytvdaayygnishfvnhscdpnlqvynvfidnlderlpriaffatrtirageeltfdynmqvdpvdmestrmdsnfglaglpgspkkrvrieckcgtescrkylf59、seq id no:3:60、mvgmsrlrndrladpltgcsvccksswnqlqdlcrlaklscpalgiskrnlydfeveylcdykkireqeyylvkwrgypdsestweprqnlkcvrilkqfhkdlerellrrhhrsktprhldpslanylvqkakqrralrrweqelnakrshlgritvenevdldgpprafvyineyrvgegitlnqvavgcecqdclwaptggccpgaslhkfayndqgqvrlraglpiyecnsrcrcgydcpnrvvqkgirydlcifrtddgrgwgvrtlekirknsfvmeyvgeiitseeaerrgqiydrqgatylfdldyvedvytvdaayygnishfvnhscdpnlqvynvfidnlderlpriaffatrtirageeltfdynmqvdpvdmestrmdsnfglaglpgspkkrvrieckcgtescrkylf61、如本文所用，术语“fas”或“fas细胞表面死亡受体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指tnfsf6/faslg的受体。也称为fas受体(fasr)、凋亡抗原1(apo-1或apt)、分化簇95(cd95)或肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tnfrsf6)，fas是人中由fas基因编码的蛋白质。fas是位于细胞表面的死亡受体，如果它结合它的配体(fas配体(fasl))，则导致程序性细胞死亡(凋亡)，从而形成死亡诱导信号转导复合物(disc)并通过适体分子fadd诱导随后的半胱天冬酶8活化。它是两种凋亡途径之一，另一种是线粒体途径。人fas在uniprot中称为p25445(tnr6_human)并且由位于染色体10(88，990，531-89，017，059正向链)上的基因fas编码，在ensembl数据库中称为ensg00000026103。术语fas还涵盖所有fas1直向同源物。62、在一些实施方案中，本文预期的蛋白质fas具有seq id no:4。63、sed id no:4:64、mlgiwtllplvltsvarlssksvnaqvtdinskglelrktvttvetqnleglhhdgqfchkpcppgerkardctvngdepdcvpcqegkeytdkahfsskcrrcrlcdeghgleveinctrtqntkcrckpnffcnstvcehcdpctkcehgiikectltsntkckeegsrsnlgwlcllllpiplivwvkrkevqktcrkhrkenqgshesptlnpetvainlsdvdlskyittiagvmtlsqvkgfvrkngvneakideikndnvqdtaeqkvqllrnwhqlhgkkeaydtlikdlkkanlctlaekiqtiilkditsdsensnfrneiqslv65、β-2-微球蛋白(β2m)是i类主要组织相容性复合物(mhc)的组分。参与肽抗原向免疫系统的呈递。人β2m由具有染色体位置15q21.1(染色体15：44，711，487-44，718，851正向链)的b2m基因编码，在ensembl数据库中称为b2m ensg00000166710(或hgnc id:hgnc:914)。66、β2m前体典型地为seq id no：5，其以成熟形式进一步加工。67、msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm68、如本文所用，根据本技术的表述“socs1缺陷”、“suv39h1缺陷”、“fas缺陷”或β2m缺陷是指如上详述的细胞中socs1和/或suv39h1和/或fas活性和/或β2m活性的抑制或阻断。69、如本技术所预期的“socs1活性的抑制”或“suv39h1活性的抑制”或“fas活性的抑制”或“β2m活性的抑制”是指与在相应的野生型细胞中未被抑制的socs1、suv39h1或fas蛋白的活性或水平相比，socs1活性、suv39h1、fas或β2m活性降低至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％或更多。优选地，对socs1活性、suv39h1活性或fas活性的抑制导致细胞中分别不存在socs1、suv39h1或fas的显著可检测活性。70、应注意，socs1和/或suv39h1和/或fas和/或β2m的细胞缺陷可通过分别抑制或破坏socs1和/或suv39h1和/或fas和/或b2m基因获得，但也可在转录后水平(socs1 mrna和/或suv39h1和/或fas mrna和/或β2m mrna)以及在socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m的翻译后或蛋白质水平获得。71、因此，socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m活性的抑制也可通过抑制socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m基因表达或通过socs1和/或fas和/或suv39h1和/或b2m基因破坏来实现。根据本发明，所述抑制使socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m在细胞，特别是本发明的免疫细胞中的表达相对于在不存在所述抑制的情况下通过所述方法产生的相同细胞(即相应细胞)或在相应野生型细胞中降低至少50％，60％，70％，80％，90％或95％(如本文包括的结果所示)。基因破坏还可以导致socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m蛋白的表达降低，或导致无功能的socs1蛋白和/或无功能的fas蛋白和/或无功能的suv39h1蛋白和/或无功能的β2m蛋白的表达降低。72、“无功能的socs1蛋白”、“无功能的”fas蛋白”、“无功能的suv39h1蛋白”或“无功能的β2m蛋白”在本文中是指如上所述的具有降低的活性或缺乏可检测的活性的蛋白。73、在一些实施方案中，根据本发明的细胞中socs1活性的抑制剂可以选自天然的或不具有防止socs1与jak和/或elongin c结合或抑制socs1基因表达的能力的任何化合物或试剂。根据本发明的细胞中的socs1活性的抑制剂可以选自天然的或不具有抑制socs1活性(特别是如上所述的)或抑制socs1基因表达的能力的任何化合物或试剂。在一些实施方案中，可使用如lilian w waiboci,howard m johnson,james p martin and chulbul mahmed,j immunol april 1,2007,178(1supplement)s170中所述；或如waiboci lw,ahmedcm,mujtaba mg,et al.j immunol.2007；178(8):5058-5068中所述的socs1或自磷酸化位点pjak2(1001-1013)的肽模拟物。74、在一些实施方案中，根据本发明的细胞中fas活性的抑制剂可以选自天然的或不具有防止fas受体活化或抑制fas基因表达的能力的任何化合物或试剂。75、在一些实施方案中，根据本发明的细胞中的suv39h1活性的抑制剂可以选自天然的或不具有通过h3k9-组蛋白甲基转移酶抑制组蛋白h3的lys-9甲基化或抑制h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1基因表达的能力的任何化合物或试剂。根据本发明的细胞中的suv39h1活性的抑制剂可以选自天然的或不具有通过h3k9-组蛋白甲基转移酶抑制组蛋白h3的lys-9甲基化或抑制h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1基因表达的能力的任何化合物或试剂。76、根据本技术的免疫细胞中socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m(在基因和/或蛋白质水平上)的抑制可以是永久的和不可逆的或瞬时的或可逆的。然而，优选地，socs1抑制和/或fas抑制和/或suv39h1抑制是永久的和不可逆的。如下所述，细胞中socs1和/或fas和/或suv39h1的抑制可以在将细胞注射到靶向患者之前或之后实现。77、根据本发明的基因工程化细胞78、在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程引入的编码一种或多种抗原受体的一种或多种核酸。79、典型地，核酸是异源的(即，例如，其通常不存在于被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物体中)。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。80、本发明的抗原受体包括基因工程化的t细胞受体(tcr)及其组分，以及功能性非tcr抗原受体，如嵌合抗原受体(car)。81、嵌合抗原受体(car)82、在一些实施方案中，工程化抗原受体包含嵌合抗原受体(car)，包括激活或刺激性car、共刺激性car(参见wo2014/055668)和/或抑制性car(icar,参见fedorov等,sci.transl.medicine,5(215)(2013年12月))。83、嵌合抗原受体(car)(也称为嵌合免疫受体、嵌合t细胞受体、人工t细胞受体)是工程化受体，其可将任意特异性移植到免疫效应细胞(t细胞)上。典型地，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上，通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。84、在一些实施方案中，car通常通过接头和/或跨膜结构域包含与一种或多种细胞内信号转导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这种分子典型地模拟或近似于通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。85、在一些实施方案中，构建car以对特定抗原(或标志物或配体)具有特异性，诸如在待通过过继细胞疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原，诸如癌症标志物。因此，car典型地在其细胞外部分中包含一个或多个抗原结合分子，诸如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分、或一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子。86、用来结合抗原的部分通常分为三类：衍生自抗体的单链抗体片段(scfv)、选自文库的fab或与其同源受体结合的天然配体(对于第一代car)。sadelain m,brentjens r,riviere i中特别报道了这些类别中的每一个的成功实例。嵌合抗原受体(car)设计的基本原理参见cancer discovery.2013；3(4):388-398(特别参见表1)且包括在本技术中。衍生自鼠免疫球蛋白的scfv是常用的，因为它们容易衍生自充分表征的单克隆抗体。87、典型地，car包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如衍生自单克隆抗体(mab)的可变重链(vh)和可变轻链(vl)的单链抗体片段(scfv)。88、在一些实施方案中，car包含特异性结合抗原的抗体重链结构域，诸如待靶向的细胞或疾病(诸如肿瘤细胞或癌细胞)的癌症标志物或细胞表面抗原，诸如本文所述或本领域已知的任何靶抗原。89、在一些实施方案中，car含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(诸如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scfv)。90、在一些实施方案中，car含有tcr样抗体，诸如抗体或抗原结合片段(例如scfv)，其特异性识别以mhc-肽复合物呈递于细胞表面的细胞内抗原，诸如肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，识别mhc-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(诸如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非tcr抗原受体，诸如嵌合抗原受体(car)。通常，含有表现出针对肽-mhc复合物的tcr样特异性的抗体或抗原结合片段的car也可以称为tcr样car。91、在一些方面，抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和细胞内信号转导结构域连接。在一些实施方案中，car包括与car的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与car中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。92、在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自天然或合成来源。如果来源是天然的，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区域包括衍生自(即至少包含其跨膜区域)t细胞受体、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd 16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd 154的α、β或δ链的那些。跨膜结构域也可以是合成的。93、在一些实施方案中，存在短的寡或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，并在car的跨膜结构域和细胞质信号结构域之间形成连接。94、car通常包括至少一种或多种细胞内信号转导组分。典型地，第一代car具有cd3δ链的胞内结构域，它是来自内源tcr的主要信号传递者。典型地，第二代car还包含从各种共刺激蛋白受体(例如cd28、41bb、icos)到car胞质尾的细胞内信号转导结构域，以向t细胞提供其他信号。临床前研究表明第二代提高了t细胞的抗肿瘤活性。最近，第三代car结合多个信号结构域，例如cd3z-cd28-41bb或cd3z-cd28-ox40，以增强效力。95、例如，car可包括tcr复合物的细胞内成分，例如介导t细胞活化和细胞毒性的tcrcd3+链，例如cd3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合分子与一个或多个细胞信号转导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号转导模块包括cd3跨膜结构域、cd3细胞内信号转导结构域和/或其他cd跨膜结构域。car还可进一步包括一种或多种其他分子(诸如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16)的一部分。96、在一些实施方案中，一旦连接car，car的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域活化正常效应物功能或相应的非工程化免疫细胞(典型地为t细胞)的应答的至少一种。例如，car可诱导t细胞的功能，诸如溶细胞活性或t辅助活性、细胞因子或其他因子的分泌。97、在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包括t细胞受体(tcr)的细胞质序列，且在一些方面还包括在天然情况下与此类受体配合作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体、和/或此类分子的任何衍生物或变体和/或具有相同功能能力的任何合成序列的那些。98、在某些方面，t细胞活化被描述为由两类细胞质信号转导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性初级活化的细胞(初级细胞质信号转导序列)；以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号转导序列)的细胞。在一些方面，car包括这种信号转导组分的一个或两个。99、在一些方面，car包括初级细胞质信号转导序列，其以刺激方式或抑制方式调节tcr复合物的初级活化。以刺激方式起作用的主要细胞质信号转导序列可含有信号转导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam。含有初级细胞质信号转导序列的itam的实例包括衍生自tcrδ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的序列。在一些实施方案中，car中的细胞质信号转导分子含有细胞质信号转导结构域、其部分或衍生自cd3δ的序列。100、car还可包括共刺激受体的信号转导结构域和/或跨膜部分，诸如cd28、4-1bb、ox40、dap10和icos。在某些方面，相同的car包括活化组分和共刺激组分两者；或者，活化结构域由一个car提供，而共刺激由识别另一种抗原的另一种car提供。101、在一些实施方案中，car是cd19 bbz car，如文献中典型已知的。典型地，此类car包含以下构建体：scfv抗cd19(fmc63)-cd8铰链和跨膜-cd3z胞内。任选地，所述构建体包含cd8信号肽，如下：cd8信号肽-scfv抗cd19(fmc63)-cd8铰链和跨膜-cd3z胞内。102、car或其他抗原受体也可以是抑制性car(例如icar)，且包括削弱或抑制应答(诸如免疫应答)的细胞内组分。此类细胞内信号转导组分的实例是在免疫检查点分子上发现的那些，包括pd-1、ctla4、lag3、btla、ox2r、tim-3、tigit、lair-1、pge2受体、ep2/4腺苷受体(包括a2ar)。在一些方面，工程化细胞包括抑制性car，其包括这种抑制性分子的信号转导结构域或衍生自这种抑制性分子的信号转导结构域，从而其起到削弱细胞应答的作用。当由活化受体(例如car)识别的抗原也表达或也可以表达在正常细胞表面上时，这种car例如用于减少脱靶效应的可能性。103、tcr104、在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括重组t细胞受体(tcr)和/或从天然存在的t细胞克隆的tcr。105、“t细胞受体”或“tcr”是指含有可变α和β链(分别称为tcra和tcrp)或可变γ和δ链(分别称为tcry和tcr5)且能够特异性结合与mhc受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，tcr为αβ形式。典型地，以αβ和γδ形式存在的tcr通常在结构上相似，但是表达它们的t细胞可能具有不同的解剖位置或功能。tcr可以在细胞表面上或以可溶形式被发现。通常，tcr在通常负责识别结合主要组织相容性复合物(mhc)分子的抗原的t细胞(或t淋巴细胞)表面上被发现。在一些实施方案中，tcr还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(例如参见janeway等,immunobiology:the immune system in health and disease,3rd ed.,current biology publications,p.4:33,1997)。例如，在一些方面，tcr的每条链可具有一个n末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区域和在c末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，tcr与参与介导信号转导的cd3复合物的不变蛋白相关。除非另有说明，否则术语“tcr”应理解为涵盖其功能性tcr片段。该术语还涵盖完整或全长的tcr，包括αβ形式或γδ形式的tcr。106、因此，出于本文的目的，提及的tcr包括任何tcr或功能性片段，诸如与结合在mhc分子中的特定抗原肽(即mhc-肽复合物)结合的tcr的抗原结合部分。可以互换使用的tcr的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指含有tcr的一部分结构域，但结合完整tcr所结合的抗原(例如mhc-肽复合物)的分子。在一些情况下，抗原结合部分含有tcr的可变结构域，诸如tcr的可变α链和可变β链，其足以形成结合特异性mhc-肽复合物的结合位点，诸如通常每条链包含三个互补决定区的结合位点。107、在一些实施方案中，tcr链的可变结构域缔合以形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(cdr)，其赋予抗原识别并通过形成tcr分子的结合位点来确定肽特异性。典型地，如免疫球蛋白一样，cdr被框架区(fr)隔开(例如参见jores等,pwc.nat'lacad.sci.u.s.a.87:9138,1990；chothia等,embo j.7:3745,1988；也见lefranc等,dev.comp.immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，尽管已显示α链的cdr1与抗原肽的n末端部分相互作用，而β链的cdr1与肽的c末端部分相互作用，但是cdr3是负责识别经加工抗原的主要cdr。cdr2被认为可以识别mhc分子。在一些实施方案中，β链的可变区可含有其他高变(hv4)区。108、在一些实施方案中，tcr链含有恒定结构域。例如，如免疫球蛋白一样，tcr链的细胞外部分(例如，α-链、β-链)可在n末端含有两个免疫球蛋白结构域、一个可变结构域(例如，va或vp；典型地基于kabat编号的氨基酸1-116，kabat等,“sequences of proteins ofimmunological interest,us dept.health and human services,public healthservice national institutes of health,1991,5th ed.)以及与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如α-链恒定结构域或ca，典型地基于kabat的氨基酸117-259、β-链恒定结构域或cp，典型地基于kabat的氨基酸117-295)。例如，在某些情况下，由两条链形成的tcr的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个含有cdr的膜远端可变结构域。tcr结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，tcr可在α和β链的每一个中具有额外的半胱氨酸残基，使得tcr在恒定结构域中含有两个二硫键。109、在一些实施方案中，tcr链可含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电。在某些情况下，tcr链含有细胞质尾巴。在某些情况下，该结构允许tcr与其他分子(如cd3)缔合。例如，含有带有跨膜区的恒定结构域的tcr可以将蛋白质锚定在细胞膜中，并与cd3信号转导装置或复合物的不变亚基缔合。110、通常，cd3是在哺乳动物和δ链中可具有三个不同的链(γ、δ和ε)的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，复合物可含有cd3γ链、cd3δ链、两个cd3ε链和cd3δ链的同二聚体。cd3γ、cd3δ和cd3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的跨膜区域带负电，这是允许这些链与带正电的t细胞受体链缔合的特征。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的胞内尾各自含有单个保守的基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam，而每个cd3δ链均具有三个。通常，itam参与tcr复合物的信号转导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区域，并在将信号从tcr传播到细胞中发挥作用。cd3-和δ-链与tcr一起形成所谓的t细胞受体复合物。111、在一些实施方案中，tcr可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链tcr构建体。在一些实施方案中，tcr是含有两个分开的链(诸如通过一个或多个二硫键连接)的异二聚体(α和β链或γ和δ链)。112、以hla非依赖性方式结合目标抗原的重组hla非依赖性(或非hla限制性)t细胞受体(称为“hi-tcr”)描述于国际申请号wo2019/157454中。该hi-tcr包含抗原结合链，其包含：(a)以hla非依赖性方式结合抗原的抗原结合结构域，例如免疫球蛋白可变区的抗原结合片段；和(b)能够与cd3δ多肽结合(并因此激活)的恒定结构域。因为典型的tcr以hla依赖性方式结合抗原，所以以hla非依赖性方式结合的抗原结合域必须是异源的。优选地，抗原结合结构域或其片段包含：(i)抗体的重链可变区(vh)和/或(ii)抗体的轻链可变区(vl)。例如，tcr的恒定结构域是天然或修饰的trac多肽，或天然或修饰的trbc多肽。例如，tcr的恒定结构域为天然tcr恒定结构域(α或β)或其片段。与嵌合抗原受体(其典型地自身包含胞内信号转导结构域)不同，hi-tcr不直接产生活化信号；相反，抗原结合链与cd3δ多肽结合并因此激活cd3δ多肽。当抗原在细胞表面具有低于约10,000个分子/细胞的低密度时，包含重组tcr的免疫细胞提供优异的活性。113、cd3δ多肽是例如天然cd3δ多肽或修饰的cd3δ多肽。cd3δ多肽任选与共刺激分子或其片段的胞内结构域融合。或者，抗原结合结构域任选包含共刺激区，例如胞内结构域，其能够在抗原结合链与抗原结合时刺激免疫应答细胞。共刺激分子的实例包括cd28、4-1bb、ox40、icos、dap-10，其片段或其组合。在一些实施方案中，重组hi-tcr由整合在免疫应答细胞的内源基因座，例如cd3δ基因座、cd3ε基因座、cd247基因座、b2m基因座、trac基因座、trbc基因座、trdc基因座和/或trgc基因座处的转基因表达。在大多数实施方案中，重组hi-tcr的表达由内源trac或trbc基因座驱动。在一些实施方案中，编码重组hi-tcr的一部分的转基因以破坏或消除包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源表达的方式整合到内源trac和/或trbc基因座中。这种破坏防止或消除免疫应答细胞中重组tcr与天然tcrα链和/或天然tcrβ链之间的错配。内源基因座还可以包含修饰的转录终止子区，例如tk转录终止子、gcsf转录终止子、tcra转录终止子、hbb转录终止子、牛生长激素转录终止子、sv40转录终止子和p2a元件。114、重组hi-tcr可进一步与本发明免疫细胞中的其它特征结合。例如，免疫细胞是其中抗原特异性受体是包含异源抗原结合结构域和天然tcr恒定结构域或其片段的修饰的tcr的细胞，并且抗原特异性受体能够激活cd3δ多肽。例如，免疫细胞可以进一步包含至少一种嵌合共刺激受体(ccr)和/或至少一种嵌合抗原受体。115、此外，在免疫细胞中，编码hi-tcr抗原结合结构域的核酸可插入免疫细胞的内源trac基因座和/或trbc基因座中。hi-tcr核酸序列的插入或另一较小突变可破坏或消除包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源性表达。插入或突变可降低内源性tcr表达至少约50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％。因为单个基因编码α链(trac)而不是两个基因编码β链，所以trac基因座是降低tcrαβ受体表达的典型靶标。因此，编码抗原特异性受体(例如car或tcr)的核酸可以在显著降低功能性tcrα链表达的位置，优选在第一外显子的5'区整合到trac基因座中。参见，例如，jantz et al.,wo 2017/062451；sadelain et al.,wo2017/180989；torikai et al,.blood,119(2):5697-705(2012)；eyquem et al.,nature.2017mar 2；543(7643):113-117。内源性tcrα的表达可减少至少约50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％。在这种实施方案中，编码抗原特异性受体的核酸的表达任选地在内源性tcr-α或内源性tcr-β启动子的控制下。116、任选地，免疫细胞还可以包含具有单个活性itam结构域的修饰的cd3，并且任选地，cd3还可以包含一个或多个或两个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，cd3包含两个共刺激结构域，任选cd28和4-1bb。具有单个活性itam结构域的修饰的cd3可以包含例如修饰的cd3δ细胞内信号转导结构域，其中itam2和itam3已经失活，或itam1和itam2已经失活。在一些实施方案中，修饰的cd3δ多肽仅保留itam1，而剩余的cd3δ结构域被缺失(残基90-164)。作为另一个实例，itam1被itam3的氨基酸序列取代，而剩余的cd3δ结构域被缺失(残基90-164)。117、因此，本发明的修饰的免疫细胞可以进一步包含前述方面中的两个或多个，或三个或多个，或四个或多个的组合。118、例如，修饰的免疫细胞是这样的免疫细胞，其中(a)抗原特异性受体是包含异源抗原结合结构域和天然tcr恒定结构域或其片段的修饰的tcr，并且抗原特异性受体能够活化cd3δ多肽，和/或抗原特异性受体是car，和任选地(b)免疫细胞包含具有单个活性itam结构域的修饰的cd3，例如其中itam2和itam3已经失活，和任选地(c)tcr在内源性trac和/或trbc启动子的控制下，和任选地(d)天然tcr-α链和/或天然tcr-β链的表达被破坏或消除。在进一步的实施方案中，细胞可以包含至少一种嵌合共刺激受体(ccr)。119、示例性抗原受体，包括car和重组tcr，以及将所述受体工程化并引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061；美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118以及欧洲专利申请号ep2537416中描述的那些，和/或sadelain等,cancer discov.2013april；3(4):388-398；davila等(2013)plos one 8(4):e61338；turtle等,curr.opin.immunol.,2012october；24(5):633-39；wu等,cancer,2012march 18(2):160-75描述的那些。在一些方面，基因工程化抗原受体包括如美国专利号：7,446,190中描述的car，以及国际专利申请公开号：wo/2014055668a1中描述的那些。120、抗原121、在基因工程化抗原受体靶向的抗原中，存在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。这些疾病和病症包括增生性、赘生性和恶性疾病和病症，更特别是癌症，因此在一些实施方案中，一种或多种抗原选自肿瘤抗原(例如由肿瘤细胞表达，特别是由癌细胞特异性表达)。122、癌症可以是实体癌或“液体肿瘤”，诸如影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症，也称为造血系统和淋巴组织的肿瘤，其特别包括白血病和淋巴瘤。例如，液体肿瘤包括急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)(包括各种淋巴瘤，诸如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、胆囊癌和胆管癌、视网膜癌(诸如成视网膜细胞瘤))。123、实体癌尤其包括影响选自下组的器官之一的癌症：结肠、直肠、皮肤、子宫内膜、肺(包括非小细胞肺癌)、子宫、骨骼(诸如骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、釉质瘤和脊索瘤)、肝、肾、食道、胃、膀胱、胰腺、子宫颈、脑(诸如脑膜瘤、胶质母细胞瘤、低级星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、垂体瘤、神经鞘瘤和转移性脑癌)、卵巢、乳房、头颈部、睾丸、前列腺和甲状腺。124、优选地，根据本发明的癌症是如上所述的影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症。典型地，癌症是多发性骨髓瘤或与多发性骨髓瘤相关。125、根据本发明的疾病还涵盖感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒；自身免疫性或炎性疾病或病症，诸如关节炎，例如类风湿性关节炎(ra)、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化、哮喘，和/或与移植相关的疾病或病症。126、在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如肿瘤或致病性细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些这样的实施方案中，本文提供的多靶点和/或基因破坏方法用于改进特异性和/或功效。127、在一些实施方案中，抗原在癌细胞中表达和/或是通用肿瘤抗原。术语“通用肿瘤抗原”是指免疫原性分子，诸如蛋白质，其通常在肿瘤细胞中比在非肿瘤细胞中以更高的水平表达，且还在不同来源的肿瘤中表达。在一些实施方案中，通用肿瘤抗原在人癌症中的表达超过30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的。在一些实施方案中，通用肿瘤抗原在至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或更多种不同类型的肿瘤中表达。在某些情况下，通用肿瘤抗原可以在非肿瘤细胞(诸如正常细胞中)表达，但是其表达水平低于在肿瘤细胞中的表达水平。在某些情况下，通用肿瘤抗原在非肿瘤细胞中根本不表达，诸如在正常细胞中不表达。例如，示例性通用肿瘤抗原包括人端粒酶逆转录酶(htert)、生存素、小鼠双微体2同源物(mdm2)、细胞色素p450 1b1(cyp1b)、her2/neu、wilms肿瘤基因1(wt1)、livin、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、粘蛋白16(muc16)、muc1、前列腺特异性膜抗原(psma)、p53或细胞周期蛋白(d1)。包括通用肿瘤抗原的肿瘤抗原的肽表位是本领域已知的，且在某些方面，可用于产生mhc限制性抗原受体，诸如tcr或tcr样car(例如，参见公开的pct申请号wo2011009173或wo2012135854和公开的美国申请号us20140065708)。128、在一些方面，抗原在多发性骨髓瘤上表达，诸如cd38、cd138和/或cs-1。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括cd56、tim-3、cd33、cd123和/或cd44。针对这种抗原的抗体或抗原结合片段是已知的，例如包括美国专利号8,153,765；8,603477；8,008,450；美国公开申请号us20120189622和公开的国际pct申请号wo2006099875、wo2009080829或wo201209261中描述的那些。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段(例如scfv)可用于产生car。129、在一些实施方案中，抗原可以是在癌细胞或肿瘤细胞上表达或上调的抗原，但也可以在免疫细胞(诸如静止或活化的t细胞)中表达。例如，在某些情况下，据报道htert、生存素和其他通用肿瘤抗原的表达存在于淋巴细胞中，包括活化的t淋巴细胞(例如，参见weng等(1996)j exp.med.,183:2471-2479；hathcock等(1998)j immunol,160:5702-5706；liu等(1999)proc.natl acad sci.,96:5147-5152；turksma等(2013)journal oftranslational medicine,11:152)。同样，在某些情况下，cd38和其他肿瘤抗原也可以在免疫细胞(诸如t细胞)中表达，诸如在活化的t细胞中上调。例如，在一些方面，cd38是已知的t细胞活化标志物。130、在本文提供的一些实施方案中，可将免疫细胞(诸如t细胞)工程化以抑制或破坏免疫细胞中编码抗原的基因，从而使所表达的基因工程化抗原受体在免疫细胞自身上表达的情况下不会特异性结合抗原。因此，在一些方面，这可以避免脱靶效应，诸如工程化的免疫细胞与其自身的结合，这可能降低例如与过继细胞疗法有关的工程化的免疫细胞的功效。131、在一些实施方案中，诸如在抑制性car的情况下，靶标是脱靶标志物，诸如不在患病细胞或待靶向的细胞上表达但在正常或未患病细胞上表达的抗原，在相同工程化细胞中，所述正常或未患病细胞还表达被活化或刺激受体靶向的疾病特异性靶标。这种抗原的示例是mhc分子，诸如i类mhc分子，例如，其与治疗其中这些分子被下调但在非靶向细胞中保持表达的疾病或病症有关。132、在一些实施方案中，工程化的免疫细胞可含有靶向一种或多种其他抗原的抗原。在一些实施方案中，一种或多种其他抗原是肿瘤抗原或癌症标志物。在一些实施方案中，通过提供的免疫细胞上的抗原受体靶向的其他抗原可包括孤儿酪氨酸激酶受体ror1、tegfr、her2、l1-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、epha2、erbb2、3或4、fbp、胎儿乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewis y、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gploo、胚胎癌抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd 123、cs-1、c-met、gd-2和mage a3、ce7、wilms tumor 1(wt-1)、细胞周期蛋白(诸如细胞周期蛋白a1(ccna1))，和/或生物素化分子，和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。133、例如，所述一种或多种抗原可选自以下肿瘤抗原：pher95、cd19、muc16、muc1、caix、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cd70、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、gd2、gd3、her-2、htert、il-13r-a2、κ-轻链、kdr、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、magea3、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、生存素、htert、epha2、nkg2d配体、ny-eso-1、癌胚胎抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、lilrb4、prame和erbb。134、在一些实施方案中，car结合病原体特异性抗原。在一些实施方案中，car对病毒抗原(诸如hiv、hcv、hbv等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具有特异性。135、在一些实施方案中，car包括一个或多个4-1bb共刺激结构域并结合cd19抗原(在文献中也称为19bbz car)。136、在一些实施方案中，将本发明细胞基因工程化以在细胞上表达两个或更多个基因工程化受体，每个受体识别不同的抗原，且典型地，每个受体包括不同的细胞内信号转导组分。例如，在国际专利申请公开号wo 2014055668 a1中描述了这种多靶点策略(描述了活化和共刺激car的组合，例如，靶向单独存在于靶标(例如正常细胞)之外，但仅一起存在于待治疗的疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和fedorov等，sci.transl.medicine,5(215)(2013年12月)(描述了表达活化和抑制性car的细胞，诸如其中活化car结合在正常或未患病细胞和待治疗的疾病或病症细胞上均表达的一种抗原，而抑制性car结合仅在正常细胞或不需要治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些)。137、在某些情况下，刺激因子(例如淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒。因此，在某些情况下(诸如在过继性免疫治疗中施用时)，工程化细胞包括使细胞易于在体内进行负选择的基因片段。例如，在一些方面，将细胞工程化，使得可以由于施用其的患者体内状况的改变而将其消除。负选择表型可以由插入赋予对所施用试剂(例如化合物)的敏感性的基因所致。负选择基因包括赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒i型胸苷激酶(hsv-1tk)基因(wigler等,cell ii:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(aprt)基因；细菌胞嘧啶脱氨酶(mullen等,proc.natl.acad.sci.usa.89:33(1992))。138、在本发明的其他实施方案中，细胞(例如t细胞)未被工程化以表达重组受体，而是包括对所需抗原具有特异性的天然存在的抗原受体，诸如在孵育步骤中体外或离体培养的肿瘤浸润淋巴细胞和/或t细胞，以促进具有特定抗原特异性的细胞的扩增。例如，在一些实施方案中，通过分离肿瘤特异性t细胞(例如自体肿瘤浸润淋巴细胞(til))来产生用于过继细胞疗法的细胞。在某些情况下，使用自体肿瘤浸润淋巴细胞直接靶向人肿瘤可以介导肿瘤消退(参见rosenberg sa,等(1988)n engl j med.319:1676-1680)。在一些实施方案中，从切除的肿瘤中提取淋巴细胞。在一些实施方案中，此类淋巴细胞在体外扩增。在一些实施方案中，将此类淋巴细胞与淋巴因子(例如，il-2)一起培养。在一些实施方案中，此类淋巴细胞介导自体肿瘤细胞的特异性裂解，但不介导同种异体肿瘤或自体正常细胞的特异性裂解。139、在另外的核酸中，例如用于引入的基因是那些诸如通过促进转移的细胞的活力和/或功能来改进治疗功效的基因；提供基因标志物以选择和/或评估细胞，诸如评估体内存活或定位的基因；例如，如lupton s.d.等,mol.and cell biol.,11:6(1991)；和riddell等,human gene therapy 3:319-338(1992)所述，通过使细胞易于在体内进行负选择来改进安全性的基因；还可参见lupton等的pct/us91/08442和pct/us94/05601的公开，其描述了衍生自将显性阳性选择性标志物与阴性选择性标志物融合的双功能选择性融合基因的用途。例如参见riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏。140、用于获得根据本发明的细胞的方法141、本发明还涉及产生修饰的或工程化的免疫细胞的方法，包括在于抑制免疫细胞中socs1和/或fas和/或suv39h1的表达和/或活性的步骤。142、优选地，根据本发明的获得细胞的方法还包括在于向所述免疫细胞中引入特异性结合靶抗原的基因工程化抗原受体或t细胞受体的步骤。143、socs1的表达和/或活性的抑制(并且在一些实施方案中，fas和/或suv39h1的表达和/或活性的额外抑制)和特异性结合免疫细胞中的靶抗原的基因工程化抗原受体的引入可以同时或以任何顺序依次进行。144、socs1、fas、suv39h1和/或β2m的抑制145、本文所述的用于抑制蛋白质的基因表达或活性的方法适用于4种目标基因/蛋白质，即socs1、fas、suv39h1和任选地β2m。当细胞缺陷超过socs1时，可以使用相同或不同的方法使细胞进一步缺陷fas和/或suv39h1。因此，本文所述的实施方案可以根据本领域技术人员的知识进行组合。146、根据本发明，工程化免疫细胞可以与至少一种抑制或阻断socs1的表达和/或活性的试剂接触，并且任选地在一些实施方案中与至少一种抑制或阻断suv39h1、fas和/或β2m的表达和/或活性的另外的试剂接触。本发明还提供了实施方案，其中fas在免疫细胞(尤其是细胞)中被灭活，任选地与suv39和/或β2m组合。147、所述试剂可选自小分子抑制剂；肽抑制剂；抗体衍生物，例如内抗体、纳米抗体或亲和体(affibodies)；适体；阻断转录或翻译的核酸分子，如与socs1、fas或suv39h1互补的反义分子；rna干扰剂(例如小干扰rna(sirna)、小发夹rna(shrna)、microrna(mirna)或piwirna(pirna)；核酶及其组合。148、所述至少一种试剂还可以是外源核酸，其包含a)与socs1、suv39h1、fas或β2m基因组核酸序列杂交的一种或多种工程化非天然存在的成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)向导rna和/或b)编码crispr蛋白(典型地为ii型cas9蛋白)的核苷酸序列，任选地其中所述细胞是用于表达cas9蛋白的转基因细胞。所述试剂还可以是锌指蛋白(zfn)或tal蛋白。149、术语“有机小分子”是指大小与药物中通常使用的那些有机分子相当的分子。该术语不包括生物大分子(例如：蛋白质、核酸等)。优选的有机小分子的大小为至多约5000da，更优选至多2000da，最优选至多约1000da。150、在一些实施方案中，h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1的抑制剂是毛壳素(cas28097-03-2)，如greiner d,bonaldi t,eskeland r,roemer e,imhof a.“identificationof a specific inhibitor of the histone methyltransferase su(var)3-9”.nat chembiol.2005aug；l(3):143-5.；weber,h.p.,et al,“the molecular structure andabsolute configuration of chaetocin”,acta cryst,b28,2945-2951(1972)；udagawa,s.,et al,“the production of chaetoglobosins,sterigmatocystin,o-methylsterigmatocystin,and chaetocin by chaetomium spp.and related fungi”,can.j.microbiol,25,170-177(1979)；and gardiner,d.m.,et al,“theepipolythiodioxopiperazine(etp)class of fungal toxins:distribution,mode ofaction,functions and biosynthesis”,microbiol,151,1021-1032(2005)所述。例如，毛壳素可商购自sigma aldrich。151、suv39h1的另一种抑制物也可以是etp69(rac-(3s,6s,7s,8as)-6-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-2,3,7-三甲基-1,4-二氧代六氢-6h-3,8a-表二硫吡咯并[1,2-a]吡嗪-7-甲腈)，表二硫代二酮哌嗪生物碱毛壳素a的外消旋类似物(参见wo2014066435以及参见baumann m,dieskau ap,loertscher bm,et al.tricyclic analogues ofepidithiodioxopiperazine alkaloids with promising in vitro and in vivoantitumor activity.chemical science(royal society of chemistry:2010).2015；6:4451-4457,和snigdha s,prieto ga,petrosyan a,et al.h3k9me3 inhibition improvesmemory,promotes spine formation,and increases bdnf levels in the agedhippocampus.the journal of neuroscience.2016；36(12):3611-3622)。152、化合物的抑制活性可使用如greiner d.et al.nat chem biol.2005aug；l(3):143-5or eskeland,r.et al.biochemistry 43,3740-3749(2004)中所述的各种方法测定。153、细胞中socs1、fas、suv39h1和/或β2m的抑制可以在靶向患者中注射之前或之后实现。在一些实施方案中，如先前所定义的抑制在向受试者施用细胞之后在体内进行。例如，如本文所定义的suv39h1抑制剂可以包括在含有细胞的组合物中。一种或多种socs1、fas、suv39h1或β2m抑制剂也可在向受试者施用细胞之前、同时或之后分别施用。154、典型地，根据本技术的socs1、fas、suv39h1和/或β2m的抑制可以通过将根据本发明的细胞与含有至少一种如前所述的药理学抑制剂的组合物一起孵育来实现。在抗肿瘤t细胞的体外扩增过程中包括抑制剂，从而在过继转移后改变它们的重建、存活和治疗功效。155、根据本发明的细胞中socs1、fas、suv39h1和/或β2m的抑制可用胞内抗体实现。胞内抗体是在同一细胞中产生后在细胞内与其抗原结合的抗体(对于综述，例如参见,marschall al,dübel s andt“specific in vivo knockdown of proteinfunction by intrabodies”,mabs.2015；7(6):1010-35.but see also van impe k,bethuyne j,cool s,impens f,ruano-gallego d,de wever o,vanloo b,van troys m,lambein k,boucherie c,et al.“a nanobody targeting the f-actin capping proteincapg restrains breast cancer metastasis”.breast cancer res 2013；15:r116；hyland s,beerli rr,barbas cf,hynes ne,wels w..“generation and functionalcharacterization of intracellular antibodies interacting with the kinasedomain of human egf receptor.oncogene 2003；22:1557-67”；lobato mn,rabbitts th.“intracellular antibodies and challenges facing their use as therapeuticagents”.trends mol med 2003；9:390-6,and donini m,morea v,desiderio a,pashkoulov d,villani me,tramontano a,benvenuto e.“engineering stablecytoplasmic intrabodies with designed specificity”.j mol biol.2003jul 4；330(2):323-32)。156、可以通过从现有的杂交瘤克隆中克隆相应的cdna来生成胞内抗体，或更方便的是，新的scfvs/fab可以选自体外展示技术(诸如噬菌体展示)，该技术从发作起提供编码抗体的必要基因，并允许对抗体精细特异性进行更详细的预先设计。另外，可以采用细菌-、酵母-、哺乳动物细胞表面展示和核糖体展示。但是，用于选择特异性抗体的最常用的体外展示系统是噬菌体展示。在称为淘选(亲和力选择)的过程中，通过将抗体噬菌体库与抗原一起孵育来选择重组抗体噬菌体。重复该过程数次，以得到包含针对几乎任何可能的靶标的特异性抗原结合剂的富集抗体库。迄今，体外组装的重组人抗体文库已经产生了数千种新型重组抗体片段。要注意的是，通过细胞质胞内抗体敲低特定蛋白质的前提是通过抗体结合将抗原中和/失活。已经出现了产生合适抗体的五种不同方法：1)体内选择真核生物(诸如酵母)和原核生物(诸如大肠杆菌)中的功能性胞内抗体(抗原依赖性和独立性)；2)产生抗体融合蛋白以改进胞质稳定性；3)使用特定的框架以改进胞质稳定性(例如，通过在稳定的抗体框架中嫁接cdr或引入合成的cdr)；4)使用单结构域抗体以改进胞质稳定性；和5)选择不含二硫键的稳定的胞内抗体。在如上所述的marschall,a.l et al.,mabs 2015中特别详细地描述了那些方法。157、胞内抗体最常用的形式是scfv，其由短而灵活的接头序列(通常为(gly4ser)3)保持在一起的h链和l链可变抗体结构域(vh和vl)组成，以避免需要分别表达和组装完整igg或fab分子的2条抗体链。或者，已经使用了fab格式，其另外包含重链的c1结构域和轻链的恒定区。最近，描述了一种新的胞内抗体的可能形式，scfab。scfab形式有望将可用的fab基因更容易地亚克隆到细胞内表达载体中，但是，与完善的scfv形式相比，是否提供任何优势还有待观察。除scfv和fab外，双特异性形式已用作胞内抗体。与单特异性抗体对应物相比，靶向er的双特异性tie-2x vegfr-2抗体被证明具有延长的半衰期。开发了双特异性跨膜胞内抗体作为特定形式以同时识别表皮生长因子的胞内和胞外表位，结合相关单特异性抗体的独特特征，即抑制自身磷酸化和配体结合。158、特别适用于细胞质表达的另一种胞内抗体形式是衍生自骆驼或由一个人vh结构域或人vl结构域组成的单结构域抗体(也称为纳米抗体)。这些单结构域抗体通常具有有利的特性，例如高稳定性；良好的溶解性；易于文库克隆和选择；在大肠杆菌和酵母中的高表达产量。159、用表达质粒转染或用重组病毒进行病毒转导后，可以在靶细胞内表达胞内抗体基因。典型地，选择旨在提供最佳的胞内抗体转染和生产水平。可以通过免疫印迹检测产生的抗体来分析成功的转染和随后的胞内抗体产生，但是，为了评估正确的胞内抗体/抗原相互作用，可以使用与相应抗原和胞内抗体表达质粒瞬时共转染的hek 293细胞提取物的共免疫沉淀。160、根据本发明的细胞中socs1和/或fas和/或suv39h1的抑制也可以用分别抑制或阻断socs1、fas或suv39h1表达或活性的适体来实现。适体是一类在分子识别方面代表抗体的替代物的分子。适体是寡核苷酸(dna或rna)或寡肽序列，其具有以高亲和力和特异性识别几乎任何种类的靶分子的能力。161、寡核苷酸适体可以通过随机序列文库的指数富集配体的系统进化(selex)来分离，如tuerkc和gold l.，1990所述。随机序列文库可通过dna的组合化学合成获得。在该文库中，每个成员是具有独特序列的线性寡聚物，最终被化学修饰。在jayasena s.d.,1999中综述了这类分子的可能的修饰、用途和优点。162、肽适体由平台蛋白展示的构象受限抗体可变区组成，例如通过两种混合方法从组合文库中选择的大肠杆菌硫氧还蛋白a(colas p,cohen b,jessen t,grishina i,mccoyj,brent r.“genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibitcyclin-dependent kinase 2”.nature.1996apr 11；380(6574):548-50)。163、根据本发明的细胞中socs1、fas、suv39h1和/β2m的抑制也可用抗体分子实现。亲和体是被工程化以结合大量具有高亲和力的靶蛋白或肽的小蛋白，模拟单克隆抗体，并且因此是抗体模拟物家族的成员(参见综述j,feldwisch j,tolmachev v,carlsson j,s,frejd fy.affibody molecules:engineered proteins fortherapeutic,diagnostic and biotechnological applications.febs lett.2010jun18；584(12):2670-80)。亲和体分子基于葡萄球菌蛋白a的免疫球蛋白结合区中的b-结构域的工程化变体(z结构域)，其理论上与任何给定的靶标特异性结合。通常通过螺旋1和2中13个氨基酸位置的组合随机化构建亲和体分子文库，所述螺旋1和2包含z-结构域的初始fc-结合表面。文库典型地在噬菌体上展示，然后针对所需靶标进行生物淘选。如果初级的亲和力增加，亲和力成熟通常导致改进的结合剂，并且可以通过螺旋改组或序列比对与定向组合诱变组合来实现。具有其改变的结合表面的新鉴定的分子通常保持初始的螺旋结构以及高稳定性，尽管已经报道了具有令人感兴趣的性质的独特的例外。由于它们的小尺寸和快速折叠特性，可以通过化学肽合成产生亲和体分子。164、在本发明的其他实施方案中，socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m活性的抑制可以通过使用rna或dna，特别是重组dna或rna，典型地使用rna干扰(rnai)如dsrna(双链rna)、mirna(microrna)、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、反义rna或dna或编码核酶的序列经由基因敲低的基因阻遏/抑制来实现。为了本发明的目的，术语“重组dna或rna”是指已经通过基因工程改变、重排或修饰的核酸序列。术语“重组体”不是指由天然发生的事件(例如自发突变)或由非自发诱变随后选择性育种产生的核酸序列的改变。165、如本文所用，术语“rna”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。该术语涵盖双链rna、单链rna、具有双链和单链区的rna、分离的rna(如部分纯化的rna)、基本上纯的rna、合成的rna、重组产生的rna、以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的rna的改变的rna或类似物rna。这种改变可以包括添加非核苷酸物质，例如添加到rna分子的末端或内部，例如在rna的一个或多个核苷酸处。本公开主题的rna分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的rna可以被称为天然存在的rna的类似物。166、sirna技术包括基于利用双链rna分子的rnai的技术，所述双链rna分子具有与从基因转录的mrna的核苷酸序列同源的序列和与核苷酸序列互补的序列。sirna通常与从基因转录的mrna的一个区域同源/互补，或者可以是包括与不同区域同源/互补的多个rna分子的sirna。167、包括反义rna分子和反义dna分子的反义寡核苷酸将直接阻断socs1、fas、h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1或β2m的翻译，从而阻止蛋白质翻译或增加mrna降解，从而分别降低socs1、fas、h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1或β2m的水平及其在细胞中的活性。例如，可以例如通过常规磷酸二酯技术合成至少约15个碱基并与编码socs1、fas、h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1或β2m的mrna转录物序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，并通过例如静脉内注射或输注施用。使用反义技术特异性抑制序列已知的基因的基因表达的方法是本领域众所周知的(例如，参见美国专利号6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。168、本文所用的“rna干扰剂”定义为通过rna干扰(rnai)来干扰或抑制靶生物标记基因表达的任何试剂。此类rna干扰剂包括但不限于核酸分子，包括与本发明的靶基因(例如suv39h1)或其片段同源的rna分子、短干扰rna(sirna)和通过rna干扰(rnai)来干扰或抑制靶核酸表达的小分子。169、小抑制性rna(sirna)也可以用作表达抑制剂以用于本技术。socs1基因表达、fas表达、h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1和/或β2m基因表达可以通过使受试者或细胞与小双链rna(dsrna)或引起小双链rna产生的载体或构建体接触来降低，从而使socs1基因表达、fas表达、h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1和/或β2m基因表达被特异性抑制(即rna干扰或rnai)。对于序列已知的基因，选择合适的dsrna或dsrna编码载体的方法是本领域众所周知的(例如，参见tuschl,t.et al.(1999)；elbashir,s.m.et al.(2001)；hannon,gj.(2002)；mcmanus,mt.et al.(2002)；brummelkamp,tr.et al.(2002)；美国专利号6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号wo01/36646、wo 99/32619和wo 01/68836)。有利地，本发明的sirna的全部或部分磷酸二酯键是经保护的。通常使用本领域已知的方法通过化学途径来实现这种保护。例如，磷酸二酯键可以通过硫醇或胺官能团或通过苯基保护。例如，有利地，本发明的sirna的5'-和/或3'-末端也使用上述保护磷酸二酯键的技术来保护。sirna序列有利地包含至少十二个连续的二核苷酸或其衍生物。170、shrna(短发卡rna)也可用作本发明中使用的表达抑制剂。shrna典型地由短(例如，19-25个核苷酸)反义链，随后5-9个核苷酸环和类似的有义链组成。或者，有义链可以在核苷酸环结构之前，并且反义链可以在其后。171、如本文所用，术语“microrna”(mirna或rna)是指长度为21-23个核苷酸，优选21-22个核苷酸的单链rna分子，其能够调节基因表达。mirna各自从较长的前体rna分子(“前体mirna”)加工。前体mirna从非蛋白编码基因转录。前体mirna具有两个互补区域，使得它们能够形成茎-环或折回样结构。加工的mirna(也称为“成熟mirna”)成为下调特定靶基因的大复合物的一部分。172、在一些实施方案中，本文所述的重组dna是编码核酶的重组dna。核酶也可以用作表达抑制剂以用于本发明。核酶是能够催化rna特异性切割的酶促rna分子。核酶的作用机制涉及核酶分子与互补靶标rna的序列特异性杂交，接着是内切核酸切割。因此，特异且有效地催化h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1 mrna序列的内切核酸切割的工程化发夹或锤头基序核酶分子在本发明的范围内是有用的。首先通过扫描靶分子的核酶切割位点来初步鉴定任何潜在的rna靶标中的特定核酶切割位点，这些位点典型地包括以下序列：gua、guu和guc。一旦鉴定，就可以评估对应于含有切割位点的靶基因区域的约15-20个核糖核苷酸之间的短rna序列的预测结构特征，诸如二级结构，这会使寡核苷酸序列不合适。173、可用作表达抑制剂的反义寡核苷酸和核酶均可通过已知方法制备。这些包括用于化学合成的技术，例如通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外或体内转录编码rna分子的dna序列来产生反义rna分子。可以将这种dna序列掺入多种载体中，这些载体掺入了合适的rna聚合酶启动子(诸如t7或sp6聚合酶启动子)。可以引入本发明寡核苷酸的各种修饰作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于在分子的5'和/或3'末端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或在寡核苷酸骨架内使用硫代磷酸酯或2'-0-甲基而不是磷酸二酯酶连锁。174、本发明的反义寡核苷酸、sirna、shrna和核酶可单独或与载体结合在体内递送。从最广泛的意义上讲，“载体”是能够促进反义寡核苷酸、sirna、shrna或核酶核酸向细胞，优选向表达socs1和优选socs1和h3k9-组蛋白甲基转移酶suv39h1的细胞转移的媒介。优选地，相对于将导致不存在载体的降解程度，载体将核酸运输至降解降低的细胞。通常，可用于本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、衍生自病毒或细菌来源的其他媒介，这些媒介已经通过反义寡核苷酸、sirna、shrna或核酶核酸序列的插入或掺入而被操纵。病毒载体是优选的载体类型，包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒，腺伴随病毒；sv40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和r a病毒(诸如逆转录病毒)。人们可以容易地采用未命名但本领域已知的其他载体。175、优选的病毒载体基于其中非必需基因已被目标基因替代的非细胞病性真核病毒。非细胞病性病毒包括逆转录病毒(例如慢病毒)，其生命周期涉及将基因组病毒rna逆转录成dna，随后将原病毒整合到宿主细胞dna中。逆转录病毒已被批准用于人类基因治疗试验。最有用的是那些复制缺陷型逆转录病毒(即，能够引导所需蛋白质的合成，但是不能制造感染性颗粒)。这种遗传改变的逆转录病毒表达载体对于体内基因的高效转导具有一般用途。kriegler,1990和murry,1991中提供了产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传物质掺入质粒、转染衬有质粒的包装细胞、由包装细胞系生产重组逆转录病毒、从组织培养基中收集病毒颗粒以及用病毒颗粒感染靶细胞)。176、对于某些应用而言，优选的病毒是腺病毒和腺相关病毒(aav)，它们是已被批准用于人类基因治疗的双链dna病毒。事实上，已知12种不同的aav血清型(aav1-12)，每种都具有不同的组织嗜性(wu,z mol ther 2006；14:316-27)。重组aav衍生自依赖性细小病毒aav2(choi,vw j virol 2005；79:6801-07)。可以将腺相关病毒1-12型工程化为复制缺陷型，并且能够感染多种细胞类型和物种(wu,z mol ther 2006；14:316-27)。它还具有如下优点：诸如热和脂质溶剂稳定性；包括造血细胞的多种谱系细胞的高转导频率；并且没有过度感染抑制作用，因此可以进行多个系列的转导。据报道，腺相关病毒可以以位点特异性方式整合到人细胞dna中，从而使插入诱变的可能性和特征在于逆转录病毒感染的插入基因表达的可变性最小。另外，在没有选择压力的情况下，在组织培养中对野生型腺相关病毒感染进行了100次以上传代，这表明腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以染色体外的方式起作用。177、其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中广泛描述，并且是本领域技术人员众所周知的。例如参见sambrook等，1989。在最近几年中，质粒载体已被用作用于将抗原编码基因体内递送至细胞的dna疫苗。它们对此特别有利，因为它们没有与许多病毒载体相同的安全问题。但是，这些具有与宿主细胞相容的启动子的质粒可以表达来自质粒内可操作编码的基因的肽。一些常用的质粒包括pbr322、puc18、puc19、prc/cmv、sv40和pbluescript。其他质粒是本领域普通技术人员众所周知的。另外，可以使用限制酶和连接反应来定制设计质粒，以去除和添加特定的dna片段。可以通过各种肠胃外、粘膜和局部途径递送质粒。例如，可以通过肌内、皮内、皮下或其他途径注射dna质粒。也可以通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用。也可以使用基因枪将其施用于表皮或粘膜表面。可以将质粒提供于水溶液中，将其干燥至金颗粒上，或者与另一种dna递送系统结合，包括但不限于脂质体、树状聚合物、蜗状递送载体和微包封。178、根据本发明的反义寡核苷酸、sirna、shrna或核酶或编码核酶的核酸序列通常在异源调节区(例如异源启动子)的控制下。所述启动子可以对muller神经胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞具有特异性，例如，在muller神经胶质细胞中的特异性表达可以通过谷氨酰胺合成酶基因的启动子获得是合适的。举例来说，启动子也可以是病毒启动子，如cmv启动子或任何合成启动子。socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m的基因抑制或破坏179、根据本发明的细胞中socs1、fas、suv39h1和/或β2m的抑制还可以分别经由socs1基因、fas基因、suv39h1基因或β2m基因的抑制或破坏来实现，诸如通过缺失，例如整个基因、外显子或区域的缺失，和/或用外源序列替换，和/或通过突变，例如基因内，典型地在基因的外显子内的移码或错义突变。在一些实施方案中，所述破坏导致过早终止密码子被掺入基因中，使得socs1、fas、suv39h1或β2m蛋白不表达或是非功能性的。通常在dna水平进行破坏。破坏通常是永久的、不可逆的，或非瞬时的。在一些实施方案中，socs1(和/或fas和/或suv39h1和/或β2m)的诱导型和/或可逆基因失活可以是有利的。180、尤其在lucibello f,menegatti s,menger l.“methods to edit t cells forcancer immunotherapy”.methods enzymol.2020；631:107-135中描述了根据本技术编辑用于癌症免疫治疗的免疫细胞的合适方法。181、在一些实施方案中，使用基因编辑剂实现基因破坏或抑制，诸如dna靶向分子，诸如dna结合蛋白或dna结合核酸，或含有其的复合物、化合物或组合物，其特异性结合基因或与基因杂交。在一些实施方案中，dna靶向分子包含dna结合结构域，例如锌指蛋白(zfp)dna结合结构域、转录激活物样蛋白(tal)或tal效应物(tale)dna结合结构域、成簇规律间隔的短回文重复(crispr)dna结合结构域，或来自大范围核酸酶的dna结合结构域。182、锌指、tale和crispr系统结合结构域可被“工程化”以结合预定的核苷酸序列。183、在一些实施方案中，dna靶向分子、复合物或组合含有dna结合分子和一个或多个其他的结构域，诸如效应物结构域以促进基因的抑制或破坏。例如，在一些实施方案中，通过包含dna结合蛋白和异源调节结构域或其功能片段的融合蛋白进行基因破坏。184、典型地，其他结构域是核酸酶结构域。因此，在一些实施方案中，使用工程化蛋白，诸如核酸酶和含核酸酶的复合物或融合蛋白，通过基因或基因组编辑促进基因破坏，所述工程化蛋白由与非特异性dna切割分子(诸如核酸酶)融合或复合的序列特异性dna结合结构域组成。185、这些靶向嵌合核酸酶或含核酸酶的复合物通过诱导靶向双链断裂或单链断裂、刺激细胞dna修复机制(包括易错非同源末端连接(nhej)和同源定向修复(hdr))进行精确的基因修饰。在一些实施方案中，核酸酶是内切核酸酶，诸如锌指核酸酶(zfn)、tale核酸酶(talen)、rna引导的内切核酸酶(rgen)，诸如crispr相关(cas)蛋白，或大范围核酸酶。这些系统在本领域中是熟知的(参见例如，美国专利号8,697,359；sander和joung(2014)nat.biotech.32:347-355；hale等(2009)cell 139:945-956；karginov和hannon(2010)mol.cell 37:7；美国专利公开2014/0087426和2012/0178169；boch等(2011)nat.biotech.29:135-136；boch等(2009)science 326:1509-1512；moscou和bogdanove(2009)science 326:1501；weber等(2011)plos one 6:el9722；li等(2011)nucl.acidsres.39:6315-6325；zhang等(2011)nat.biotech.29:149-153；miller等(2011)nat.biotech.29:143-148；lin等(2014)nucl.acids res.42:e47)。这些基因策略可根据本领域熟知的方法使用组成型表达系统或诱导型表达系统。186、zfp和zfn；tal、tale和talen187、在一些实施方案中，靶向dna的分子包括与效应蛋白(诸如核酸内切酶)融合的dna结合蛋白，诸如一种或多种锌指蛋白(zfp)或转录激活物样蛋白(tal)。实例包括zfn、tale和talen。参见lloyd等,frontiers in immunology,4(221),1-7(2013)。188、在一些实施方案中，靶向dna的分子包含一种或多种以序列特异性方式结合dna的锌指蛋白(zfp)或其结构域。zfp或其结构域是蛋白质或较大蛋白质内的结构域，其通过结合结构域内氨基酸序列的一个或多个锌指区域以序列特异性方式结合dna，所述结构域的结构通过锌离子配位而稳定。通常，可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)上进行氨基酸取代来改变zfp的序列特异性。因此，在一些实施方案中，zfp或含zfp的分子是非天然存在的，例如，经工程化以结合选择的靶位点。例如，参见beerli等(2002)nature biotechnol.20:135-141；pabo等(2001)ann.rev.biochem.70:313-340；isalan等(2001)nature biotechnol.19:656-660；segal等(2001)curr.opin.biotechnol.12:632-637；choo等(2000)curr.opin.struct.biol.10:411-416。189、在一些实施方案中，靶向dna的分子是或包含与dna切割结构域融合以形成锌指核酸酶(zfn)的锌指dna结合结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种iis型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个可以工程化或可以不工程化的锌指结合结构域。在一些实施方案中，切割结构域来自iis型限制性核酸内切酶foki。例如，参见美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及li等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:4275-4279；li等(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:2764-2768；kim等(1994a)proc.natl.acad.sci.usa 91:883-887；kim等(1994b)j.biol.chem.269:31,978-31,982。190、在一些方面，例如在靶基因(即suv39h1)的编码区中的预定位点上，zfn有效地产生双链断裂(dsb)。典型的靶向基因区域包括外显子、编码n末端区域的区域、第一外显子、第二外显子以及启动子或增强子区域。在一些实施方案中，zfn的瞬时表达促进工程化细胞中靶基因的高效和永久破坏。特别地，在一些实施方案中，zfn的递送导致基因的永久破坏，效率超过50％。许多基因特异性工程化锌指可商购获得。例如，sangamo biosciences(richmond,ca,usa)与sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)合作开发了锌指构造平台(compozr)，其允许研究人员完全绕开锌指的构造和验证，并提供数千种蛋白质的特异性靶向的锌指。gaj等,trends in biotechnology,2013,31(7),397-405。在一些实施方案中，使用可商购的锌指或定制设计可商购的锌指(例如，参见sigma-aldrich catalog numberscstzfnd,cstzfn,cti1-1kt,和pzd0020)。191、在一些实施方案中，靶向dna的分子包含天然存在或工程化的(非天然存在的)转录激活物样蛋白(tal)dna结合结构域，诸如在转录激活物样蛋白效应(tale)蛋白中；例如，参见美国专利公开号20110301073。在一些实施方案中，分子是dna结合核酸内切酶，诸如tale核酸酶(talen)。在一些方面，talen是包含衍生自tale的dna结合结构域和核酸酶催化结构域以切割核酸靶序列的融合蛋白。在一些实施方案中，将tale dna结合结构域工程化以结合编码靶抗原和/或免疫抑制分子的基因内的靶序列。例如，在一些方面，tale dna结合结构域可靶向cd38和/或腺苷受体，诸如a2ar。192、在一些实施方案中，talen识别并切割基因中的靶序列。在某些方面，dna的切割导致双链断裂。在一些方面，断裂刺激同源重组或非同源末端连接(nhej)的速率。通常，nhej是不完善的修复过程，通常会导致切割位点的dna序列发生变化。在某些方面，修复机制涉及通过直接重新连接(critchlow和jackson,trends biochem sci.1998oct；23(10):394-8)或通过所谓的微同源性介导的末端连接重新结合两个dna末端的残基。在一些实施方案中，经由nhej的修复导致小的插入或缺失，并可用于破坏并由此抑制基因。在一些实施方案中，修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。在一些方面，可通过本领域中众所周知的方法来鉴定和/或选择其中发生裂解诱导的诱变事件(即与nhej事件连续的诱变事件)的细胞。193、可组装tale重复序列以特异性靶向suv39h1基因(gaj等,trends inbiotechnology,2013,31(7),397-405)。已建立针对18,740种人蛋白质编码基因的talen文库(kim等,nature biotechnology.31,251-258(2013))。定制设计的tale阵列可通过cellectis bioresearch(paris,france)、transposagen biopharmaceuticals(lexington,ky,usa)和life technologies(grand island,ny,usa)商购。具体地，靶向cd38的talen是可商购的(参见gencopoeia,目录号htn222870-1、htn222870-2和htn222870-3，可在万维网上获得，网址为www.genecopoeia.com/product/search/detail.php？prt＝26&cid＝&key＝htn222870)。描述了示例性分子，例如在美国专利公开号us 2014/0120622和2013/0315884中。194、在一些实施方案中，talen作为由一种或多种质粒载体编码的转基因引入。在一些方面，质粒载体可以含有选择标志物，其提供用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞。195、rgen(crispr/cas系统)196、可使用一种或多种dna结合核酸来进行基因抑制，诸如通过rna引导的核酸内切酶(rgen)的破坏，或通过另一种rna引导的效应分子进行的其他形式的抑制。例如，在一些实施方案中，可使用成簇规则间隔的短回文重复(crispr)和crispr相关蛋白进行基因抑制。参见sander和joung,nature biotechnology,32(4):347-355。197、一般而言，“crispr系统”泛指与crispr相关(“cas”)基因的表达或引导其活性有关的转录本和其他元件，包括编码cas基因、tracr(反式激活crispr)序列(例如tracrrna或活性部分tracrrna)、tracr配对序列(在内源crispr系统中涵盖“直接重复”和tracrrna加工的部分直接重复)、向导序列(在内源crispr系统中也称为“间隔子”)和/或来自crispr基因座的其他序列和转录本。198、典型地，crispr/cas核酸酶或crispr/cas核酸酶系统包括序列特异性结合dna的非编码rna分子(向导)rna和具有核酸酶功能的crispr蛋白(例如两个核酸酶结构域)。crispr系统的一个或多个元件可衍生自i型、ii型或iii型crispr系统，诸如cas核酸酶。优选地，crispr蛋白是cas酶，诸如cas9。cas酶在本领域中是众所周知的；例如，化脓链球菌cas9蛋白的氨基酸序列可以在swissprot数据库中以登录号q99zw2找到。在一些实施方案中，将cas核酸酶和grna引入细胞中。在一些实施方案中，crispr系统在靶位点诱导dsb，随后如本文所述进行破坏。在其他实施方案中，被认为是“切割酶”的cas9变体可用于在靶位点切割单链。例如，成对的切割酶也可以用于提高特异性，每个酶由一对不同的grna靶向序列引导。还在其他实施方案中，可将无催化活性的cas9融合至异源效应物结构域，诸如转录抑制剂，以影响基因表达。199、通常，crispr系统的特征在于促进靶序列位点处的crispr复合物形成的元件。典型地，在形成crispr复合物的情况下，“靶序列”通常是指被设计为其具有互补性的向导序列的序列，其中靶序列和向导序列之间的杂交促进crispr复合物的形成。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进crispr复合物的形成，则不一定需要完全互补。靶序列可以包含任何多核苷酸，诸如dna或rna多核苷酸。通常，可用于重组为包含靶序列的靶基因座的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。200、应注意，在一些实施方案中，催化死亡的cas9(dcas9)可与激活物或抑制物结构域结合使用以控制基因表达。201、在一些实施方案中，将驱动crispr系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞，以使得crispr系统的元件的表达引导crispr复合物在一个或多个靶位点处的形成。例如，cas酶、连接至tracr-配对序列的向导序列和可各自可操作地连接至单独载体上的单独调控元件的tracr序列。或者，可以将由相同或不同调控元件表达的两个或多个元件组合在单个载体中，其中一个或多个其他载体提供不包含在第一载体中的crispr系统的任何组分。在一些实施方案中，可以在任何合适的方向上排列在单个载体中组合的crispr系统元件。在一些实施方案中，crispr酶、向导序列、tracr伴侣序列和tracr序列可操作地连接至同一启动子并由同一启动子表达。在一些实施方案中，载体包含与编码crispr酶的酶编码序列(诸如cas蛋白)可操作地连接的调控元件。202、在一些实施方案中，将与导向序列结合(和任选地与导向序列复合)的crispr酶递送至细胞。典型地，crispr/cas9技术可用于敲低工程化细胞中suv39h1的基因表达。例如，可将cas9核酸酶和suv39h1基因特异性的向导rna引入细胞，例如，使用慢病毒递送载体或多种用于转移到细胞的已知递送方法或媒介的任何一种，诸如多种用于递送cas9分子和向导rna的多种已知方法或媒介的任何一种(另参见下文)。203、在一些实施方案中，可诱导的基因抑制系统，尤其是可诱导的crispr基因失活，可以是有利的，如在chylinski,k.,hubmann,m.,hanna,r.e.et al.crispr-switchregulates sgrna activity by cre recombination for sequential editing of twoloci.nat commun 10,5454(2019),or in macleod,r.s.,cawley,k.m.,gubrij,i.etal.effective crispr interference of an endogenous gene via a single transgenein mice.sci rep 9,17312(2019)中所述。204、编码基因破坏分子和复合物的核酸的递送205、在一些实施方案中，将编码dna靶向分子、复合物或组合的核酸施用或引入细胞。典型地，基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码crispr、zfp、zfn、tale和/或talen系统的组分的核酸引入培养的细胞。206、在一些实施方案中，由于将编码多肽的多核苷酸引入细胞，因此多肽在细胞中原位合成。在一些方面，多肽可在细胞外产生，并且然后被引入细胞内。207、将多核苷酸构建体引入动物细胞的方法是已知的，且作为非限制性实例，包括其中将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的稳定转化方法、其中没有将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法、以及病毒介导的方法。208、在一些实施方案中，可通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等将多核苷酸引入细胞。瞬时转化方法包括显微注射、电穿孔或粒子轰击。所述核酸以表达载体的形式施用。优选地，表达载体是逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、dna质粒表达载体或aav表达载体。在哺乳动物表达载体中，要注意的是，启动子驱动cas9表达可以是组成型的或诱导型的。u6启动子典型地用于grna。209、核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质、核酸缀合物、裸露的dna、人工病毒体和试剂增强的dna吸收。脂质转染在例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355中描述，且脂质转染试剂是商售的(例如transfectamtm和lipofectintm)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括feigner的wo 91/17424；wo 91/16024的那些。可以递送到细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。在一些实施方案中，可以使用cas9rnp(核糖核蛋白)。cas9 rnp由与grna复合的纯化的cas9蛋白组成。它们在体外组装并且可以使用标准电穿孔或转染技术直接递送至细胞。与基于质粒的cas9/grna表达相比，cas9rnp能够以相似的效率切割基因组靶标。cas9 rnp作为完整复合物递送，在转染后不久以高水平可检测，并且经由蛋白质降解途径从细胞中快速清除。典型地，通过脂质介导的转染或电穿孔将cas9 rnp递送至靶细胞(详见wang,ming,et al."efficient delivery ofgenome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles."proceedingsof the national academy of sciences 113.11(2016):2868-2873；liang,xiquan,etal."rapid and highly efficient mammalian cell engineering via cas9proteintransfection."journal of biotechnology 208(2015):44-53；zuris,john a.,et al."cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-basedgenome editing in vitro and in vivo."nature biotechnology 33.1(2015):73-80orkim,sojung,et al."highly efficient rna-guided genome editing in human cellsvia delivery of purified cas9ribonucleoproteins."genome research 24.6(2014):1012-1019)。210、基于rna或dna病毒的系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和用于基因转移的单纯疱疹病毒载体。211、有关基因治疗程序的综述，参见anderson,science 256:808-813(1992)；nabel&feigner,tibtech 11:211-217(1993)；mitani&caskey,tibtech 11:162-166(1993)；dillon.tibtech 11:167-175(1993)；miller,nature 357:455-460(1992)；van brunt,biotechnology6(10):1149-1154(1988)；vigne,restorative neurology andneuroscience 8:35-36(1995)；kremer&perricaudet,british medical bulletin 51(1):31-44(1995)；haddada等,in current topics in microbiology and immunologydoerfler and bohm(eds)(1995)；and yu等,gene therapy 1:13-26(1994)。212、可将包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(gst)、辣根过氧化物酶(hrp)、氯霉素乙酰转移酶(cat)β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、hcred、dsred、蓝绿色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)和包括蓝色荧光蛋白(bfp)的自发荧光蛋白的报道基因引入细胞中，以编码作为标志物的基因产物，所述标志物用于测量基因产物的表达的改变或修饰。213、细胞制备214、细胞分离包括根据本领域熟知技术的一个或多个基于制备和/或非亲和力的细胞分离步骤。例如，在一些实施例中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育细胞，以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实施例中，基于一种或多种性质，诸如密度、粘附性质、尺寸、敏感性和/或对特定组分的抗性，来分离细胞。215、在一些实施方案中，细胞制备包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。216、典型地，在基因工程和/或socs1(和/或suv39h1和/或fas和/或β2m)抑制之前或与基因工程和/或socs1(和/或suv39h1和/或fas和/或β2m)抑制一起孵育细胞。217、孵育步骤可以包括培养、孵育、刺激、激活、扩增和/或增殖。218、在一些实施方案中，根据本发明的socs1(在一些实施方案中，和/或suv39h1和/或fas，和/或β2m)的抑制也可以在将细胞注射至靶向患者后在体内实现。典型地，socs1的抑制可以使用如先前描述的药理学抑制剂进行。219、在其它实施方案中，还可以在刺激、活化和/或扩增步骤期间进行按照前述方法的socs1(在一些实施方案中，和/或suv39h1，和/或fas，和/或β2m)的抑制。例如，在过继转移至患者之前，在存在socs1和/或fas和/或suv39h1和/或β2m的药理学抑制剂的情况下，在体外扩增pbmc或纯化的t细胞或纯化的nk细胞或纯化的淋巴样祖细胞。在一些实施方案中，组合物或细胞在刺激条件或刺激剂存在下孵育。这些条件包括设计用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化，诸如用于引入基因工程化抗原受体。220、孵育条件可包括一种或多种特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子)和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体)和设计以活化细胞的任何其他试剂。221、在一些实施方案中，刺激条件或试剂包括能够活化tcr复合物的细胞内信号转导结构域的一种或多种试剂，例如配体。在一些方面，所述试剂在t细胞中开启或启动tcr/cd3细胞内信号转导级联。这样的试剂可包括抗体，诸如对tcr组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如与固体载体(诸如珠)结合的抗cd3，抗cd28，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括将抗cd3和/或抗cd28抗体添加到培养基中的步骤(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)。在一些实施方案中，刺激剂包括1l-2和/或il-15，例如，il-2浓度为至少约10单位/ml。222、在某些方面，根据诸如riddell等的美国专利号6,040,177，klebanoff等,jimmunother.2012；35(9):651-660,terakura等,blood.2012；1:72-82,和/或wang等jimmunother.2012,35(9):689-701中描述的技术进行孵育。223、在一些实施方案中，通过将饲养细胞(诸如非分裂外周血单核细胞(pbmc))添加至培养起始组合物来扩增t细胞(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个t淋巴细胞，所得细胞群体均含有至少约5、10、20或40或更多个pbmc饲养细胞)；并孵育培养物(例如，持续足以扩增t细胞数目的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ-辐照的pbmc饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000-3600rads的γ射线辐照pbmc以阻止细胞分裂。在一些方面，在添加t细胞群之前将饲养细胞添加至培养基。224、在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人t淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，且通常为37摄氏度或约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂的ebv转化的淋巴母细胞(lcl)作为饲养细胞。可以用约6000-10,000rads的γ射线照射lcl。在一些方面，以任何合适的量提供lcl饲养细胞，诸如lcl饲养细胞与初始t淋巴细胞的比率为至少约10:1。225、在实施方案中，通过用抗原刺激初始或抗原特异性t淋巴细胞来获得抗原特异性t细胞，诸如抗原特异性cd4+和/或cd8+ t细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离t细胞并用相同抗原在体外刺激细胞来产生巨细胞病毒抗原的抗原特异性t细胞系或克隆。226、在一些方面，该方法包括评估一种或多种标志物在经工程化细胞或待工程化细胞的表面上的表达。在一个实施方案中，该方法包括评估寻求通过过继细胞疗法靶向的一种或多种靶抗原(例如，基因工程化抗原受体识别的抗原)的表面表达，例如通过基于亲和力的检测方法，诸如通过流式细胞仪。227、细胞基因工程的载体和方法228、在一些方面，基因工程涉及将编码基因工程化成分或其他用于引入的成分(诸如编码基因破坏蛋白或核酸的成分)的核酸引入细胞。229、通常，将car工程化为免疫细胞(例如，t细胞)需要培养细胞以允许转导和扩增。转导可以利用多种方法，但是需要稳定的基因转移以在克隆扩增和持久工程化细胞中实现持续的car表达。230、在一些实施方案中，通过首先刺激细胞生长，例如t细胞生长、增殖和/或活化，然后转导活化的细胞，并在培养中扩增至足以用于临床应用的数目来实现基因转移。231、用于引入基因工程化成分(例如抗原受体，例如car)的各种方法是众所周知的，且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒、转导、转座子和电穿孔)。232、在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(诸如衍生自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(诸如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到t细胞中(例如，参见koste等(2014)gene therapy 2014apr 3.；carlens等(2000)exp hematol 28(10):1137-46；alonso-camino等(2013)mol ther nucl acids 2,e93；park等,trendsbiotechnol.2011november；29(11):550-557)。233、在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增生肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)、脾聚焦形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括衍生自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。典型地，逆转录病毒是两亲性的，这意味着它们能够感染包括人的若干物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因取代了逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；miller and rosman(1989)biotechniques 7:980-990；miller,a.d.(1990)humangene therapy 1:5-14；scarpa等(1991)virology 180:849-852；burns等(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:8033-8037；和boris-lawrie and temin(1993)cur.opin.genet.develop.3:102-109)。234、慢病毒转导的方法也是已知的。例如，示例性方法描述于wang等(2012)j.immunother.35(9):689-701；cooper等(2003)blood.101:1637-1644；verhoeyen等(2009)methods mol biol.506:97-114；和cavalieri等(2003)blood.102(2):497-505。235、在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到t细胞中(例如，参见chicaybam等,(2013)plos one 8(3):e60298和van tedeloo等(2000)gene therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，重组核酸通过转位转移到t细胞中(例如，参见manuri等(2010)hum gene ther 21(4):427-437；sharma等(2013)molec ther nucl acids 2,e74；和huang等(2009)methods mol biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如current protocols in molecular biology,john wiley&sons,new york.n.y.所描述的)；原生质体融合；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston,nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等,mol.cell biol.,7:2031-2034(1987))。236、用于转移编码基因工程化产物的基因工程化核酸的其他方法和载体在例如国际专利申请公开号wo2014055668和美国专利号7,446,190中描述。237、本发明的组合物238、本发明还包括含有本文所述和/或通过提供的方法产生的细胞的组合物。典型地，所述组合物是用于施用(诸如用于过继细胞疗法)的药物组合物和制剂。239、本发明的药物组合物通常包含至少一种本发明的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体。240、如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以将补充活性化合物进一步掺入组合物中。在一些方面，药物组合物中载体的选择部分地由特定的工程化car或tcr、表达car或tcr的载体或细胞、以及通过用于施用表达car的所述载体或宿主细胞的特定方法来确定。因此，存在多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。例如，合适的防腐剂可包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。典型地，防腐剂或其混合物以占总组合物的约0.0001-约2重量％的量存在。241、将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。242、治疗方法243、本发明还涉及如前定义的细胞，其用于过继性疗法(尤其是过继性t细胞疗法)，典型地，用于治疗有需要的受试者中的癌症。在一些实施方案中，如本文公开的细胞可用于异源转移，尤其是在任选地与suv39h1和/或β2m的失活组合的socs1和/或fas缺陷的细胞的情况下。244、如本文所用，“治疗(treatment/treating)”定义为向有此需要的患者应用或施用本发明的细胞或包含细胞的组合物，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病(诸如癌症)或疾病(例如癌症)的任何症状。特别地，术语“治疗”是指降低或减轻至少一种与疾病(诸如癌症)相关的不良临床症状，例如疼痛、肿胀、低血细胞计数等。245、关于癌症治疗，术语“治疗”也指减缓或逆转肿瘤性不受控制的细胞增殖的进展，即缩小现有肿瘤和/或中止肿瘤生长。术语“治疗”还指在受试者的癌症或肿瘤细胞中诱导凋亡。246、本发明的受试者(即患者)是哺乳动物，典型地，是灵长类动物，诸如人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是男性或女性，且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物。在一些实例中，患者或受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性结果(诸如细胞因子释放综合征(crs))的经验证的动物模型。在本发明的一些实施方案中，所述受试者患有癌症、处于患癌的风险中、或处于癌症缓解中。247、癌症可以是实体癌或“液体肿瘤”，诸如影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症，也称为造血系统和淋巴组织的肿瘤，尤其包括白血病和淋巴瘤。例如，液体肿瘤包括急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴细胞性白血病(all)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)(包括各种淋巴瘤，诸如套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、胆囊癌和胆管癌、视网膜癌(诸如成视网膜细胞瘤))。248、实体癌尤其包括影响选自下组的器官之一的癌症：结肠、直肠、皮肤、子宫内膜、肺(包括非小细胞肺癌)、子宫、骨骼(诸如骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、釉质瘤和脊索瘤)、肝、肾、食道、胃、膀胱、胰腺、子宫颈、脑(诸如脑膜瘤、胶质母细胞瘤、低级星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、垂体瘤、神经鞘瘤和转移性脑癌)、卵巢、乳房、头颈部、睾丸、前列腺和甲状腺。249、在一些实施方案中，所述受试者患有感染性疾病或病症或处于感染性疾病或病症的风险中，诸如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。在一些实施方案中，该疾病或病症是自身免疫或炎性疾病或病症，诸如关节炎(例如类风湿性关节炎(ra))、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、炎性肠病、牛皮癣、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘、和/或与移植相关的疾病或病症。250、本发明还涉及治疗方法，尤其是过继细胞疗法，优选过继t细胞疗法，其包括向有此需要的受试者施用前述组合物。251、在一些实施方案中，将细胞或组合物施用于受试者，诸如患有如上所述的癌症或任何一种疾病或处于罹患如上所述的癌症或任何一种疾病的风险中的受试者。在一些方面，这些方法由此通过减轻表达由工程化细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负担来治疗(例如改善)疾病或病症(诸如与癌症有关的疾病或病症)的一种或多种症状。252、用于过继细胞疗法的细胞施用方法是已知的，且可与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继性t细胞疗法在例如gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)nat rev clin oncol.8(10):577-85)中有描述。例如，参见themeli等(2013)nat biotechnol.31(10):928-933；tsukahara等(2013)biochem biophys res commun 438(1):84-9；davila等(2013)plos one 8(4):e61338。253、在一些实施方案中，通过自体转移进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继t细胞疗法，其中从将接受细胞疗法的受试者或从来自此类受试者的样品中分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞衍生自需要治疗的受试者(例如患者)，且在分离和加工后将所述细胞施用于同一受试者。254、在一些实施方案中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继性t细胞疗法，其中从将接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在该实施方案中，然后将细胞施用给同种的不同受试者(例如第二受试者)。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相同。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上相似。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超型。在该实施方案中，有利的是使用任选地与suv39h1和/或β2m失活组合的socs1和/或fas缺陷的细胞。255、向有此需要的受试者施用至少一种根据本发明的细胞可以与一种或多种其他治疗剂组合或与另一种治疗干预组合，以同时或以任何顺序依次进行。在一些情况下，将这些细胞与另一种在时间上足够接近的疗法共同施用，以使细胞群增强一种或多种其他治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之前施用细胞群。在一些实施方案中，在一种或多种其他治疗剂之后施用细胞群。256、对于癌症治疗，组合的癌症治疗可以包括但不限于化疗剂、激素、抗血管生成素、放射性标记化合物、免疫疗法、外科手术、冷冻疗法和/或放疗。257、免疫疗法包括但不限于免疫检查点调节剂(即抑制剂和/或激动剂)、单克隆抗体、癌症疫苗。258、优选地，在根据本发明的过继性t细胞疗法中施用细胞与施用免疫检查点调节剂，尤其是检查点抑制剂组合。检查点抑制剂包括但不限于pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、lag-3抑制剂、tim-3抑制剂、tigit抑制剂、btla抑制剂、t细胞活化的v结构域ig抑制剂(vista)抑制剂和ctla-4抑制剂，例如ido抑制剂。共刺激抗体通过免疫调节受体递送阳性信号，所述免疫调节受体包括但不限于icos、cd137、cd27ox-40和gitr。最优选地，免疫检查点调节剂包含pd-1抑制剂(如抗pd-1)、pdl1抑制剂(如抗pdl1)和/或ctla4抑制剂。259、除了与检查点阻断组合之外或作为与检查点阻断组合的替代方案，还可以使用包括但不限于talen和crispr/cas的基因编辑技术来遗传修饰本公开的免疫细胞(尤其是免疫细胞组合物)以使它们对免疫检查点具有抗性。这些方法是本领域已知的，参见例如us20140120622。基因编辑技术可用于阻止t细胞表达的免疫检查点的表达，包括但不限于pd-1、lag-3、tim-3、tigit、btla、ctla-4和这些的组合。这里讨论的免疫细胞可以通过这些方法中的任何一种进行修饰。260、根据本公开的免疫细胞还可以被遗传修饰以表达增加归巢到肿瘤中的分子和/或将炎性介质递送到肿瘤微环境中，包括但不限于细胞因子、可溶性免疫调节受体和/或配体。261、本发明还涉及包含本文所述的工程化免疫细胞的组合物在制备用于治疗受试者中的癌症、感染性疾病或病症、自身免疫性疾病或病症或炎性疾病或病症的药物中的用途。262、本发明还涵盖制备通用免疫细胞，特别是通用t细胞的方法，所述通用免疫细胞可用于同种异体过继性治疗，例如用于治疗癌症，所述方法包括在t细胞中抑制fas和/或socs1活性(如前所述，在基因、mrna或基因水平)的步骤，任选地与suv39h1和/或β2m的失活组合。263、本发明还涵盖用于同种异体过继性治疗，尤其用于同种异体癌症过继性治疗，特别是同种异体atct的方法，所述方法包括以下步骤：264、-从受试者获得至少一种免疫细胞265、-修饰所述至少一种免疫细胞以失活fas和/或soc1266、-向需要其的另一个受试者施用所述至少一种免疫细胞，典型地以药物组合物的形式；267、任选地，其中所述至少一种免疫细胞被进一步修饰以表达如前所述的一种或多种遗传修饰的抗原受体；268、任选地，其中所述至少一种免疫细胞被进一步修饰以失活suv39h1和/或β2m；269、任选地，其中所述至少一种细胞是如前所述的cd4+ t细胞或混合的cd4+/cd8+ t细胞群。270、该方法也可以与前述实施方案组合。技术实现思路当前第1页12当前第1页12