模拟皮肤微生物组的合成混合培养物的制作方法

发明领域本发明涉及借助于模拟皮肤微生物组的合成混合培养物筛选化合物的生物活性的体外方法。

背景技术：

0、现有技术

1、作为身体最大的器官，人体皮肤是一种极其复杂和动态的基质，其功能是提供针对损伤和微生物侵害的物理屏障。如今，充分确立的是，皮肤是大量和广泛种类的微生物诸如细菌、真菌和病毒的家园。每平方厘米的皮肤被估计100万个细菌栖息，其中数百种不同的微生物物种以混合群体生活在一起。平衡的微生物群落与组织处于动态平衡(holland，k.t.，bojar，r.a.，am.j.clin.dermatol.，2002，3，445-449)，且因此可被视为皮肤的必要组分。通过多种机制，皮肤控制以下事实：微生物不能任意地传播，特别是阻止致病微生物。这些微生物及其基因构成人类皮肤微生物组。

2、研究已经显示，性别、年龄、生活方式、居住区域、遗传易感性、饮食和药物使用(药物摄入)与皮肤微生物组千丝万缕地相关。此外，各种压力源可以促进皮肤微环境内的代谢变化。

3、在特定条件下，致病微生物诸如致病细菌、酵母和霉菌对定殖的限制可能受损，并引起皮肤微生物群落的干扰。此类微生物的定殖可以破坏健康微生物组的平衡。当这些群体的平衡被严重破坏时-一种称为“生态失调”的状态-可以观察到对宿主的皮肤状况和人类健康的负面影响。

4、通过比较健康和患病状态下部位特异性的真皮微生物组，几项研究已经清楚地表明，疾病与微生物群及其宏基因组的组成的扰动有关。

5、在健康皮肤中，可以发现各种各样的微生物，而微生物组的多样性经常随着皮肤状况异常而降低。这已经在具有特应性皮炎的患者中进行研究，其中观察到皮肤中显著不同且多样性较低的细菌定殖模式-不仅在具有急性或慢性湿疹的受影响区域，而且在非发炎皮肤区域中也是如此。

6、因此，ep3049533公开了与特应性皮炎相关的细菌特征的表征及其在特应性皮炎的预后和/或诊断的体外方法、用于监测对治疗的反应的方法、用于监测特应性皮炎的发展的方法以及用于选择可用于预防和/或治疗特应性皮炎的化合物的方法中的用途。

7、频繁洗涤和使用特定化妆品两者先前都与改变皮肤微生物组相关。

8、bouslimani等人在bmc biology 2019，17：47中公开了护肤品对皮肤化学和微生物组动力学的影响。

9、wallen-russell在cosmetics 2019，6，2中公开了一项关于经常使用的化妆品在改变皮肤微生物组中的作用的分析。

10、此外，在ep2776836中已经公开了一种用于鉴定对人类皮肤共生微生物表现出益生元活性的测试剂和包含此类试剂的组合物的方法。该方法包括提供测试剂、人皮肤共生微生物和基本碳培养基的测试培养物。

11、所有现有技术的一个缺点是，所公开的方法或者在皮肤基质中进行并需要长时间段才能得出结果，或者所述方法因为不同微生物的量非常有限而甚至没有接近真实皮肤微生物组的复杂性。

12、本发明的一个目的是提供一种用于快速和可重复地测试化合物的方法，其也模拟天然存在的皮肤微生物组的复杂性。

技术实现思路

1、令人惊讶地发现，权利要求1的方法能够为本发明的目的提供解决方案并且克服现有技术的至少一个缺点。

2、本发明因此提供了如权利要求1中所述的借助于模拟皮肤微生物组的合成混合培养物筛选化合物的生物活性的体外方法。

3、本发明进一步提供了如权利要求11中所述的模拟皮肤微生物组的合成混合培养物。

4、本发明的一个优点是本发明的方法在数小时内提供可靠的结果。

5、本发明的另一个优点是它能够模拟天然、健康人皮肤的微生物组及其由于外部施加的化合物而导致的变化。

6、本发明的一个进一步优点是可以有效地模拟不同身体区域的微生物组。

7、本发明的另一个优点是，节省资源，因为本发明的方法可以用最少的样品体积进行。

8、本发明的一个进一步优点是皮肤或皮肤样基质不是必需的。

9、本发明的另一个优点是代表用于机械和分子概况分析的明确定义且最可控的环境。

10、本发明的一个进一步优点是可以避免由种群结构、地理或环境条件的巨大差异导致的测量微生物群体的波动和变化。

11、本发明的另一个优点是可以极大地简化低生物量皮肤微生物组样品的收集和处理问题。

12、本发明的一个进一步优点是可以大大降低污染的风险。

13、本发明的一个方面因此为用于筛选化合物的生物活性的体外方法，所述方法包括以下步骤：

14、a)提供模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种不同细菌菌株的合成混合培养物，

15、b)在包含所述化合物的培养基中培养所述合成混合培养物一段时间，

16、c)在步骤b)之后测量所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况并将所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况与对照微生物组的多样性水平和/或多样性概况进行比较，和

17、d)通过步骤c)中获得的所述合成混合培养物和所述对照微生物组之间的偏差推断所述化合物的生物活性。

18、本发明上下文中的术语“生物活性”包括化合物在培养期间对合成混合培养物中含有的生物体在微生物的相对丰度如何改变的方面的影响。

19、通过分析化合物的这种生物活性，可以推断出化合物在体内对皮肤的影响，因为皮肤微生物组内不同微生物的作用和影响是已知的。

20、因此，本发明上下文中的术语“化合物的生物活性”包括化合物对皮肤的美容效果。

21、美容效果的实例是，例如，改善皮肤外观、皮肤脱脂、皮肤增脂、皮肤紧致、补偿皮肤的不规则色素沉着或皱纹、光滑皮肤、针对uv辐射和光老化的皮肤保护、使皮肤恢复活力、增强皮肤保湿和防止脱水、解决皮肤敏感性并减轻可导致负面皮肤状况诸如皮肤老化的环境影响。

22、除非另有说明，否则给出的所有百分比(％)均为质量百分比。

23、优选地，其生物活性被筛选的化合物是化妆品成分。

24、可以在根据本发明的方法中筛选任何种类的化妆品成分。实例为植物提取物、植物成分和植物化学物质、润肤剂、乳化剂、增稠剂、紫外线保护滤光剂、抗氧化剂、助水溶剂、多元醇、固体、填料、成膜剂、珠光添加剂、除臭剂和止汗活性成分、驱虫剂、自晒黑剂、防腐剂、调理剂、流变改性剂、着色剂、染料、气味吸收剂、富脂剂、溶剂和表面活性剂。

25、优选地，其生物活性被筛选的化合物选自防腐剂、植物提取物和植物成分、紫外线保护滤光剂、乳化剂和表面活性剂。

26、本发明上下文中的术语“合成混合培养物”包括之前已从天然来源分离的微生物的混合物，所谓的“分离的微生物”。该术语意味着，将不同的和单独分离的微生物组合(“混合”)以产生合成混合培养物。

27、本发明上下文中的术语“模拟皮肤微生物组”应理解为合成混合培养物的特性与皮肤上存在的天然存在的微生物组非常相似，尽管其在不同微生物数量方面的复杂性与相应皮肤上存在的天然存在的微生物组相比有所降低。

28、优选地，根据本发明的方法的步骤a)中模拟的皮肤微生物组是健康人类个体的皮肤微生物组。

29、在这种情况下，优选进行化合物的生物活性的筛选，以评价是否发现对健康人类个体皮肤的负面或正面影响。

30、或者，优选根据本发明的方法的步骤a)中模拟的皮肤微生物组是患有与特定皮肤微生物组相关的皮肤病症的人类个体的皮肤微生物组。此类病症包括但不限于脂溢性皮炎、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮和化脓性汗腺炎。

31、在该上下文中，优选进行化合物的生物活性的筛选，以评价是否发现对患有皮肤病皮肤的人类个体的皮肤微生物组的正面影响，因此改善相关病症的状况。

32、已知是皮肤微生物组、优选人皮肤微生物组的一部分的任何细菌菌株都可以用作根据本发明的模拟皮肤微生物组的细菌菌株。示例性皮肤共生细菌包括但不限于α变形菌、β变形菌、γ变形菌、丙酸杆菌、棒杆菌、放线菌、梭菌、乳杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、微球菌、链球菌、拟杆菌、黄杆菌、肠球菌和假单胞菌。

33、模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组：痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)、非发酵棒杆菌(corynebacterium afermentans)、无枝菌酸棒杆菌(corynebacteriumamycolatum)、粘金色棒杆菌(corynebacteriumaurimucosum)、corynebacterium fastidiosum、克罗彭斯特棒杆菌(corynebacteriumkroppenstedtii)、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌(corynebacteriumsimulans)、纹带棒杆菌(corynebacterium striatum)、结核硬脂酸棒杆菌(corynebacterium tuberculostearicum)、干燥棒杆菌(corynebacterium xerosi)、气囊水栖菌(enhydrobacter aerosaccus)、藤黄微球菌(micrococcus luteus)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、头状葡萄球菌(staphylococcus capitis)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)、缓症链球菌(streptococcus mitis)、口腔链球菌(streptococcus oralis)、假肺炎链球菌(streptococcus pseudopneumoniae)、血红链球菌(streptococcus sanguinis)和小韦荣氏球菌(veillonella parvula)。

34、皮肤可以在生理上分为不同的部位：

35、例如，小鱼际手掌和前臂掌侧被认为是干燥部位，

36、鼻孔、肘前窝、腹股沟皱缝、指间蹼(interdigital web)、胭窝被认为是潮湿部位，鼻翼皱缝、面颊、眉间、外耳道、柄状体、耳后皱缝、枕骨部和背部被认为是分泌皮脂部位，且

37、脚趾蹼空间、脚趾甲和足底跟被认为是足部部位。

38、当在本发明的方法的步骤a)中模拟不同皮肤部位的皮肤微生物组时，优选的是，

39、在模拟干燥部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，

40、a)结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓症链球菌、口腔链球菌、假肺炎链球菌、血红链球菌和小韦荣氏球菌，

41、在模拟潮湿部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，

42、b)非发酵棒杆菌、corynebacterium fastidiosum、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、气囊水栖菌、藤黄微球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，

43、在模拟分泌皮脂部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，

44、c)无枝菌酸棒杆菌、粘金色棒杆菌、克罗彭斯特棒杆菌、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和缓症链球菌，

45、在模拟足部部位的情况下，模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，

46、d)非发酵棒杆菌、corynebacterium resistens、模拟棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、藤黄微球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌和沃氏葡萄球菌。

47、模拟皮肤微生物组的细菌菌株优选选自包含以下、优选由以下组成的组，

48、痤疮丙酸杆菌、非发酵棒杆菌、结核硬脂酸棒杆菌、干燥棒杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、头状葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和缓症链球菌。

49、本发明的合成混合培养物不仅限于细菌物种，因为人类皮肤的微生物组还含有真核和病毒物种。

50、因此，根据本发明优选的是，本发明的步骤a)中的合成混合培养物包含真核和/或病毒物种，优选真核物种，优选马拉色菌属(malassezia)、曲霉属(aspergillus)、德巴利酵母属(debaroyomyces)和隐球菌属(cryptococcus)，并且最优选马拉色菌属，且优选限制性马拉色菌(mrestricta)和球形马拉色菌(m.globosa)。

51、本发明的方法的一个优点是，且因此优选，步骤b)中的培养可以是在模拟皮肤微生物组的细菌菌株至少部分悬浮的情况下进行的。已经令人惊讶地发现，模拟皮肤微生物组的细菌菌株的生长比它们在基质上的生长更快，同时仍然经历多样性水平和/或多样性概况相同的变化。

52、根据本发明的步骤b)中的培养可以在通气、减少通气或不通气的情况下进行。

53、取决于通气等级(其可例如受氧气供应和/或培养基搅动程度的影响)，培养被认为是有氧或无氧的。

54、本发明上下文中的术语“无氧培养”意指在与培养基接触的氧浓度小于5vol.％的气体存在的情况下的培养。

55、本发明上下文中的术语“有氧培养”意指在与培养基接触的氧浓度为5vol.％或更高的气体存在的情况下的培养。

56、根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养无氧进行，更优选向与培养基接触的气体提供氮气。

57、根据本发明的一种替代优选方法的特征在于，步骤b)中的培养以低搅拌速率有氧进行，优选以小于800rpm的搅拌速率，更优选以50rpm至700rpm的搅拌速率，最优选以300rpm至600rpm的搅拌速率进行。

58、根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养在实验室培养皿中进行，所述实验室培养皿优选选自多孔板，优选选自6-、24-、48-、96-和384孔板。

59、根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤b)中的培养进行2小时至48小时、优选4小时至36小时、更优选6小时至24小时、甚至更优选8小时至20小时的时间段。

60、测量微生物组的多样性水平和/或多样性概况的不同方法是本领域技术人员众所周知的。它们的范围从sanger-测序、16s rrna分析、对转录间隔区1(its1)区域分析到全基因组测序，后者不经靶向扩增步骤即捕获微生物组中的遗传物质的全部互补序列。例如在wo2020150723中公开了微生物组的16s rrna分析以评价样品的多样性。例如在wo2015170979中公开了微生物组的转录间隔区1区域分析以评价样品的多样性。oh等人在cell 165，854-866(2016)中公开了通过鸟枪宏基因组测序评价微生物组的多样性的合适方法。

61、根据本发明的一种优选方法的特征在于，所述微生物组的多样性水平和/或多样性概况通过16s rrna分析进行测量。当合成混合培养物仅含有细菌菌株作为模拟皮肤微生物组的微生物时尤其如此。

62、在本发明的合成混合培养物包含真核和/或病毒物种的情况下，微生物组的多样性水平和/或多样性概况优选地通过鸟枪宏基因组测序来测量。

63、根据本发明的方法的步骤c)包括将所述合成混合培养物的多样性水平和/或多样性概况与对照微生物组的多样性水平和/或多样性概况进行比较。

64、这优选地包括确定合成混合培养物和对照微生物组中包含的微生物的相对丰度，以及确定两种培养物之间相对丰度的偏差。

65、根据本发明的一种优选方法的特征在于，步骤c)中的对照微生物组选自与所述合成混合培养物相同培养、但在步骤b)开始时不含所述化合物和所述合成混合培养物的合成混合参考培养物，优选地，它是与所述合成混合培养物相同培养、但不含所述化合物的合成混合参考培养物。

66、根据本发明的方法的步骤d)包括通过步骤c)中获得的所述合成混合培养物和所述对照微生物组之间的偏差推断所述化合物的生物活性。

67、本领域技术人员将容易理解，当已经确定合成混合培养物中物种相对丰度的变化时，筛选的化合物具有什么生物活性：

68、例如，如果合成混合培养物的微生物组成在暴露于植物或微生物提取物时以与任何给定皮肤病相关的微生物物种的生长速率受到抑制的方式有所不同，而共生微生物物种显示出更高的生长，则该方法可用作可能对治疗所述皮肤病具有有益作用的化合物的早期诊断标志物。

69、l.weyrich等人在2015年在australasian journal of dermatology56(4)中发表了一篇综述文章，其描述了人类皮肤上改变的微生物群体和疾病之间的关联。

70、evonik正在商业化提供产品这是一种基于天然益生菌乳杆菌的无细胞提取物，其被设计为保持和恢复皮肤微生物群的自然平衡，促进有益细菌表皮葡萄球菌的生长，同时防止金黄色葡萄球菌的生长，所述金黄色葡萄球菌与皮炎和皮肤干燥相关。在本发明的方法中，可以在数小时内显示这两种细菌菌株的这种相对丰度变化。

71、本发明的另一个方面是模拟皮肤微生物组的至少8种、优选至少10种、更优选至少12种分离的不同细菌菌株的合成混合培养物。

72、本发明的合成混合培养物的优选实施方案在上文中描述为本发明方法的步骤a)中提供的优选合成混合培养物。

73、                         序列表

74、<110>  evonik operations

75、<120>  模拟皮肤微生物组的合成混合培养物

76、<130>  202000368

77、<160>  2

78、<170>  patentin version 3.5

79、<210>  1

80、<211>  17

81、<212>  dna

82、<213>  人工序列

83、<220>

84、<223>  引物

85、<220>

86、<221>  misc_feature

87、<222>  (9)..(9)

88、<223>  n为a、c、g或t

89、<220>

90、<221>  misc_feature

91、<222>  (13)..(13)

92、<223>  w为a或t

93、<400>  1

94、cctacgggng gcwgcag                                                     17

95、<210>  2

96、<211>  21

97、<212>  dna

98、<213>  人工序列

99、<220>

100、<223>  引物

101、<220>

102、<221>  misc_feature

103、<222>  (6)..(6)

104、<223>  h为a、c或t

105、<220>

106、<221>  misc_feature

107、<222>  (7)..(7)

108、<223>  v为a、c或g

109、<220>

110、<221>  misc_feature

111、<222>  (19)..(19)

112、<223>  k为g或t

113、<400>  2

114、gactachvgg gtatctaakc c                                                21