NK细胞的大量增殖培养方法与流程

本发明涉及一种应用于免疫疗法的自然杀伤细胞(nk细胞)的大量增殖培养方法，更特别地，涉及一种大量增殖培养nk细胞的方法，其能够培养来自人外周血的淋巴细胞，从而有效地增殖和激活对治疗恶性肿瘤非常有效的nk细胞，同时又能显著提高nk细胞所占比例。

背景技术：

1、免疫疗法是一种从患者血液中提取对癌症治疗而言最重要的免疫细胞(例如自然杀伤细胞(nk细胞)、树突状细胞(dc)、b细胞和t细胞)，使用各种类型的刺激剂将这些细胞培养成对癌症有强烈作用的免疫细胞，并将其注射回患者体内的方法。由于使用了患者自己的血液，所以与常规化疗相比，副作用更少，施用方法更简单。因此，近年来，人们积极地研究免疫疗法。

2、在免疫疗法中被激活的免疫细胞中，特别地，nk细胞是大颗粒淋巴细胞(lgl)，是淋巴细胞的一种特征类型，其具有在不杀死大多数正常细胞的情况下杀死感染病毒和肿瘤细胞的优异能力。抗肿瘤作用是通过坏死或凋亡，或通过这两种作用机制同时发生来实现的。nk细胞对例如il-2、il-12和干扰素等细胞因子产生响应，从而增加细胞毒性、分泌和增殖功能。人类nk细胞的表型是cd16(fcγriii)和cd56，其中cd16和cd56在细胞表面缺乏trc(t细胞受体复合物)，被用作nk细胞的标志物。

3、已知这些nk细胞在人体的早期生物防御机制及肿瘤免疫中发挥重要的作用。

4、换句话说，nk细胞可以杀死特定的自体细胞、同种异体细胞，甚至异质癌细胞，而无需根据主要组织相容性复合体(mhc)的表达来获得免疫性的过程，并且能够更有效地杀死mhc 1类表达少或不表达的靶细胞。因此，nk细胞可以有效杀死多数不表达mhc的癌细胞，并且可以杀死一些病毒感染的细胞和细菌，例如伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。

5、这些nk细胞是负责先天免疫的重要细胞，与t细胞不同，它们在肝脏和骨髓中成熟。特别是，它们具有自主识别和杀死异常细胞(例如病毒感染细胞或肿瘤细胞)的功能。在过去十年中，利用患者自身免疫系统的肿瘤免疫疗法得到了稳步发展，使用该系统的“细胞疗法产品”也已经商业化。细胞疗法被定义为通过体外增殖和选择自体、同种异体或异种细胞的方法，通过一系列改变细胞生物学特性的作用而用于治疗、诊断和预防的药物产品(食品药品管理局通知2003-26号第2条)。

6、由于nk细胞是用于治疗难治性疾病(例如癌症)的细胞疗法，能够解决免疫排斥问题，并且提供为患者定制的细胞疗法，因此需要大量增殖nk细胞的方法和培养具有增强活性的nk细胞的方法。

7、然而，对杀死癌细胞具有优异效果的nk细胞，即使在正常人中也仅占外周血淋巴细胞的5％至15％，特别是在癌症患者中，这一比例降低到低于1％。因此，在没有单独的增殖过程的情况下，nk细胞在通过免疫疗法有效攻击癌细胞的方面存在局限性。

8、就其功能而言，nk细胞的分化、增殖和存活在很大程度上受到细胞因子的影响，先前的几项研究表明，细胞因子例如il-2、il-12、il-15和il-18等增加细胞毒性和活化。目前，il-2等细胞因子和cd3等抗体被用于激活和增殖免疫细胞，特别是nk细胞。在目前的技术中，cd3抗体在免疫细胞的增殖中起着关键作用，但问题在于通过使用该抗体激活免疫细胞非常困难。

9、特别地，当从一开始就施加cd3抗体的强烈刺激时，未成熟的祖细胞就会成熟为t细胞。因此，目前普遍进行的的方法利用在开始时稍微刺激cd3抗体的方法，这在很大程度上取决于环境需求，例如个体之间的差异。因此，要获得大量增殖的活化nk细胞具有挑战性。

10、因此，需要开发新的培养基组合物和新的培养方法，其能够稳定地大量扩增和增殖nk细胞，同时能够消除应该将cd3抗体固定在烧瓶中并进行一段时间的反应的现有方法中困难。

11、因此，在考虑使用细胞因子的nk细胞的大量增殖培养方法时，本发明人分离和培养了淋巴细胞(淋巴细胞是来源于人外周血的免疫细胞)，并证实在包被有抗cd16抗体而非抗cd3抗体的培养器中，用各种细胞因子(特别是il-2和il-15)一起处理时，nk细胞大量增殖并活化，从而完成了本发明。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目的是提供一种使用细胞因子的nk细胞的大量增殖培养方法。

3、技术方案

4、为了达到上述目的，本发明提供了一种nk细胞的培养方法，该方法包括：1)通过使用ficoll和离心从血液中分离含有免疫细胞的外周血单个核细胞(pbmc)沉淀；2)在抗cd16抗体包被的培养器中，在含有rpmi培养基、血浆、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30的培养基中培养分离的pbmc；3)将培养的pbmc在rpmi培养基、白蛋白、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30中传代培养(subculturing)；和4)在基于rpmi的培养基组合物中处理传代培养的pbmc，所述rpmi中添加了抗nkp30、抗nkp46和抗cd56抗体，以及选自由il-2、il-15和il-2+il-15组成的细胞因子组中的细胞因子以激活nk细胞。

5、在下文中，将详细描述本发明。

6、nk细胞是大颗粒淋巴细胞(lgl)(一种淋巴细胞)，具有在不杀死大多数正常细胞的情况下杀死感染病毒和肿瘤细胞的优异能力。因此，在活性细胞毒性t淋巴细胞大量产生之前，nk细胞在病毒感染或肿瘤发生的早期阶段发挥着重要作用。例如，当nk细胞接触靶细胞时，一些分子在靶细胞膜上形成孔隙并裂解细胞，而其他分子进入靶细胞并增加核dna的碎片，从而导致坏死、凋亡或程序性细胞死亡。

7、因此，nk细胞可以裂解特定的病毒感染细胞和癌细胞，而无需预先刺激它们。与通过表达tcr特异性地识别抗原的细胞毒性t淋巴细胞不同，nk细胞缺乏抗原特异性受体。

8、nk细胞表达与正常细胞的mhc i类结合的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)。杀伤细胞抑制性受体在与mhc i类结合时，产生诱导特定转录因子抑制的细胞内信号。因此，nk细胞的激活和靶细胞的降解和破坏受到抑制。在病毒感染的细胞或癌细胞中，在其表面上mhc i类分子显著降低。因此，当这些细胞遇到nk细胞时，因为它们无法有效地与杀伤细胞抑制性受体结合，它们就会暴露于nk细胞介导的细胞毒性，从而被裂解。

9、nk细胞可以来源于例如哺乳动物、人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠或兔子。nk细胞可以从正常人或癌症患者获得。nk细胞可以从血液或外周血单个核细胞(pbmc)分离出来。分离血液的方法、由其分离pbmc的方法和由其分离nk细胞的方法可以通过已知的方法进行。

10、在本发明的nk细胞培养方法中，上述步骤4)的细胞因子优选用il-2+il-15处理，更优选用il-2 20ng/ml和il-15 50ng/ml处理。

11、另外，在本发明的nk细胞培养方法中，在上述步骤1)中分离免疫细胞时，优选通过用rbc裂解缓冲液处理免疫细胞沉淀来去除红细胞；并且上述步骤2)中的培养,当细胞数为3×107以下时，优选在包被有抗cd16抗体的t25烧瓶中进行，当细胞数为3×107以上时，优选在包被有抗cd16抗体的t75烧瓶中进行，其通过如下进行：添加rpmi 8ml、血浆2ml、il-220ng/ml、il-15 50ng/ml、抗cd56 5ng/ml、抗nkp465ng/ml和抗nkp30 5ng/ml，将pbmc沉淀悬浮在10ml rpmi中，并进一步添加混合物，在37℃和5％co2的培养器中培养3至4天。

12、此外，在本发明的nk细胞培养方法中，上述步骤3)的传代培养优选通过以下方式进行：在一次传代中，添加上述步骤2)的细胞培养悬液20ml、rpmi 72ml、白蛋白8ml、il-220ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养3至5天；以及在二次传代中，添加一次传代培养悬液50ml、rpmi180ml、白蛋白20ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养5至7天。

13、有益效果

14、如上所述，本发明是在各种细胞因子中用il-2和il-15处理nk细胞时，能够有效激活细胞的最佳组合，并且当用il-2+il-15处理时，可以大量培养nk细胞，特别是，当用20ng/ml il-2和50ng/ml il-15处理时，培养是最高效的。由于使用这种方法时，可以促进对癌细胞的凋亡或杀伤能力，因此本发明可以用作预防或治疗癌症的有效的免疫细胞疗法。