碱蓬来源曲霉菌TR15及其应用

碱蓬来源曲霉菌tr15及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体是碱蓬来源曲霉菌tr15及其 应用。


背景技术：

2.吡咯烷醇类化合物是一类由真菌代谢产生的次级代谢产物，它们 中有一些具有显著的生物学活性，如具有抗原虫和变型虫、抗真菌、 抗病毒、癌细胞死亡增敏剂、免疫抑制活性及抗肿瘤等活性。
3.吡咯烷醇类化合物preussin对丝状真菌、酵母、耐药细菌、病毒 和多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用，其对多种肿瘤细胞的ic
50
值为 12-50μm，其广泛的生理活性和其独特的全顺式取代吡咯环结构，使 其从被分离出来就一直吸引着合成化学家的目光。截至2021年，已 有四十多条合成路线被报道。preussin现有的合成方法大多数存在合 成步骤繁琐、收率偏低，以及不能放大生产(仅限于毫克级别)等问 题，从而引起此类药物的批量化生产受阻。据我们调研，现在国内外 大多数合成preussin的整体收率低于20％，一次性产量低于500毫 克；而且化学合成生产过程存在高温、高压、强酸、强碱等较为极端 的化工过程，生产安全性低、环境污染较重。并且目前吡咯烷醇类化 合物preussin多为进口产品，商品价格偏高，因此，开发具有我国自 主知识产权的高产preussin微生物菌株显得尤为必要。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供碱蓬来源曲霉菌tr15及其应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.碱蓬来源曲霉菌tr15，分离于东营市黄河入海口湿地采集的碱蓬根 际土壤；该菌株于2021年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no:m 20211402。
7.本发明所述的曲霉菌菌株tr15在制备吡咯烷醇类化合物 preussin中的应用。
8.在上述方案的基础上，所述曲霉菌菌株tr15制备吡咯烷醇类化 合物preussin的方法，该方法包括下列步骤：将曲霉菌菌株tr15接 种至固体培养基中，室温静置发酵28-30d，所得发酵培养基经提取 分离得到吡咯烷醇类化合物preussin。
9.优选地，所述固体培养基为大米70g，玉米粉0.15g，蛋白胨0.45 g，海盐6g，用蒸馏水定容至200ml，ph 8.5-9.0。
10.优选地，所述吡咯烷醇类化合物preussin的提取分离步骤为：
11.(1)固体发酵培养基以2倍体积乙酸乙酯浸提2-3次，提取液 减压浓缩，得到粗浸膏；
12.(2)将上述粗浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯及二氯 甲烷-甲醇为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集二氯 甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分；
13.(3)将上述二氯甲烷-甲醇＝40-1洗脱组分进行反相硅胶柱层析， 以甲醇-水为洗脱溶剂按照极性由小到大的顺序梯度洗脱，收集20％ 甲醇-水洗脱组分；
基平板上进行划线分离，定时观察菌落生长情况；(4)继续采用平板 稀释划线法分离纯化菌株，编号保存。
28.(2)菌株鉴定
29.将菌株tr15接种至含3.0％海盐的pda平板表面，28℃培养4d 观察，结果见图1。可见，菌株tr15培养4d，菌丝即可铺满整个平 板，该菌株菌丝为白色，黄色孢子丰富，以子囊孢子和菌丝分裂两种 方式繁殖，产褐色色素，在海盐浓度为3％(w/v)长势仍然旺盛。
30.所述菌株的rdna基因序列测定结果(its1-5.8s-its2区)如下：
31.cctcccacccgtgtataccgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgcgc aagcggccgccggggggggcgtcaaacccccctccctaggcgagcgcccgcc ggagacaccaacgtgaacactgtctgaagttttgttgtctgagttcgattgtat cgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaag aacgcagcgaaatgcgataattaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcga gtctttgaacgcacattgcaccccctggtattccggggggtatgcctgtccgag cgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggtcgtcgtccccccggg gacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggg gctttgtcacccgctcttgtaggcccggccggcgctggccgacgctgaaaagc aaccaactatttctccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaact taagcatatcaata
32.该序列信息与genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其 与菌株aspergillus persii cbs 112795(accession number：nr 135421.1) 的同源性最高，为99.40％。
33.综上所述，曲霉菌tr15(aspergillus sp.tr15)，保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号 为：cctcc no:m 20211402，保藏日期为：2021年11月11日。
34.实施例2：曲霉菌菌株tr15制备吡咯烷醇类化合物preussin的 方法
35.(1)发酵生产
36.生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取曲霉菌菌株 tr15适量，接种到pda固体斜面培养基上，在28℃恒温培养箱中培 养5天。
37.取斜面培养5天的曲霉菌菌株tr15适量，接种到装有200ml 大米培养基的1000ml锥形瓶中，28℃静置培养30d，获得固体发酵 培养基(10l)。
38.所述大米培养基组成：大米70g，玉米粉0.15g，蛋白胨0.45g， 海盐6.0g，蒸馏水定容至200ml，ph 8.5-9.0。
39.(2)发酵培养基的提取
40.固体发酵培养基用其2倍体积的乙酸乙酯浸提2-3次，浸提液减 压浓缩得乙酸乙酯粗浸膏约53g。
41.(3)吡咯烷醇类化合物preussin的制备方法
42.粗浸膏用乙酸乙酯混悬，加硅胶(200-300目)搅拌，减压除去 溶剂后，干法上样，用硅胶柱层析(28
×
6.5cm)，以石油醚-乙酸乙酯 (20:1,10:1,5:1,1:1,v/v,下同)和二氯甲烷-甲醇(40:1,20:1,10:1,0:1)为 溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率为2ml/min。收集二氯甲烷-甲醇＝40:1 洗脱组分，所得洗脱液经薄层色谱跟踪分析，preussin在254nm和 365nm波长下无紫外吸收，碘显黄褐色色斑，1％硫酸乙醇显色为砖 红色斑，洗脱液减压浓缩，称重为7.4g。
43.二氯甲烷-甲醇＝40:1洗脱组分以甲醇溶解，经反相硅胶柱层析(60
ꢀ×
3.5cm)，以甲醇-水(10:90，20:80，30:70，50:50，70:30，100:0) 为溶剂进行梯度洗脱，洗脱速率为2ml/min。收集甲醇-水＝20:80的 洗脱组分，所得洗脱液经薄层色谱跟踪分析，检测方法同上，洗脱液 减压浓缩，称重为5.9克。
44.甲醇-水＝20:80洗脱组分经制备型高效液相色谱分离(ods-c
18
， 10
×
250mm，柱号：2820195x)，检测波长210nm，洗脱速率为2ml/min， 甲醇-水＝57:43等度洗脱，收集tr＝17.0min的色谱峰，洗脱液减压浓 缩，得到吡咯烷醇类化合物preussin 3.1g，其总产率为3.1g/10l培 养基。
45.(4)吡咯烷醇类化合物preussin的结构表征
46.将制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin进行波谱分析，结果表 明，esi-ms显示其分子离子峰为318.28[m+h]
+
，由此可以推断其分 子量为317.27，进一步结合nmr波谱分析，确定化合物的分子式为： c
21h35
no，结构式如下所示：
[0047][0048]
制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin的1h-nmr(500mhz, cdcl3)和
13
c-nmr(125mhz,cdcl3)结果如表1所示。
[0049]
表1.吡咯烷醇类化合物preussin的1h与
13
c nmr数据(δin ppm,j in hz)
[0050][0051]
实施例3：体外抗菌活性测试
[0052]
将将制备得到的吡咯烷醇类化合物preussin进行体外抗菌活性 测试。
[0053]
供试菌株：多耐药灰葡萄孢(botrytis cinerea)。
[0054]
实验方法：微量刃天青显色法(nat.commun.2020,11(01):1608: 1-19)，具体步骤如下所示：1)将多耐药灰葡萄孢接种于pda平板， 于25℃的人工培养箱中培养至7-10d，用无菌水收集孢子，调整孢子 液浓度为1
×
105个/ml。在96孔细胞培养板中每孔分别加入45μl 液体培养基(35μl的1％葡萄糖无菌水溶液和10μl的pdb溶液)、5μl 的不同浓度的供试化合物和10μl孢子悬浮液，以加入等体积的溶剂 做阴性对照。2)调零孔里加入等量的液体培养基和供试化合物(不 加孢子液)，以茴香霉素、啶酰菌胺和嘧菌酯作为阳性对照。每个浓 度3个复孔，震荡混匀后，封板，25℃的恒温培养箱中培养24h后， 加入刃天青染料(40μmol/l)，避光，25℃恒温继续培养。3)待阴 性对照孔的颜色变为浅粉色，采用酶标仪在波长570nm下测定吸光 值。利用spss统计软件，计算抑菌率，求取ic
50
和mic值。
[0055]
试验结果表明，吡咯烷醇类化合物preussin对多耐药灰葡萄孢的 ic
50
值和mic值分别为5.56mg/l和20mg/l，抑菌活性显著优于茴香 霉素、啶酰菌胺和嘧菌酯，详见表2和图3。因此，preussin有望开 发为新型抗多耐药灰葡萄孢的杀菌剂。
[0056]
表2.刃天青法测定化合物对多耐药灰葡萄孢的抑菌活性
[0057]