一种同时检测七种流感病毒的试剂盒

1.本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种同时检测七种流感病毒的试剂盒技术领域。


背景技术：

2.甲型流感病毒(ifv-a、h1n1、h1n2、h3n2)，属于正黏病毒科甲型流感病毒属。甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异，甲型流感病毒的亚型则被人们称为"禽流感"，禽流感(bird flu)是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。
3.乙型流感病毒(influenza b virus，缩写ifv-b)，属于正黏病毒科乙型流感病毒属。流感病毒(正黏液病毒科)为单链rna膜病毒，其rna含有八个片断。流感病毒的基因结构使其有不断交换基因片断进而形成优势变异的条件。根据核蛋白和膜表面蛋白抗原，流感病毒分为甲、乙、丙三型。猪和禽类可携带甲型流感，人乙、丙型流感仅在人之间转播。甲型和乙型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。
4.呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytial virus)rsv-a,b，是一种rna病毒，属副粘液病毒科。呼吸道合胞体病毒感染分布全球,冬春季多发,有时可呈周期性流行,1～3月为流行高峰。在家庭、幼儿园及婴儿室易有爆发流行。该病经空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和6个月以内的婴儿。潜伏期3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。临床上确诊通过分离病毒以及做血清不提结合实验和中和实验，应用免疫荧光技术检查鼻炎分泌物中病毒抗体，可快速诊断。
5.以上病毒在检测时需要做到精准检测，且有时间上的要求，因此需要设计一种试剂盒，可以在同一时间对上述七种病毒做出检测成为需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种同时检测七种流感病毒的试剂盒。
7.本发明采用如下技术方案实现。
8.一种同时检测七种流感病毒的试剂盒，本发明所述的试剂盒包含以下引物对及探针：
9.ifv-a-f：5'-cggaggacttgaatggaatggtaac-3'；
10.ifv-a-r-cy3：5'-ctgctctggaggtagtgaaggtc-3'；
11.ifv-a-probe：5'-gagattcgcttggagaaactgtgatgaga-3'；
12.ifv-b-f：5'-ggaaggcttgttgctaaacttgttg-3'；
13.ifv-b-r-cy3：5'-ctggtgataatcggtgctcttgac-3'；
14.ifv-b-probe：5'-ctcaactcactcttcgagcgtcttaatga-3'；
15.h1n1-h1-f-1-r：5'-tgctggatctggtattatc-3'；
16.h1n1-h1-r-1-cy3-r：5'-tgggaggctggtgtttatag-3'；
17.h1n1-h1-probe：5'-gcaatacaacttgtcagacacccaaggg-3'；
18.h1n2-ha-f-1-r：5'-cacaatgggaagctgtgc-3'；
19.h1n2-ha-r-1-cy3-r：5'-tgatttcttggaaatcagtgat-3'；
20.h1n2-ha-probe：5'-gcgttgctggatggatattaggaaaccc-3'；
21.h3n2-h3-f-1-r：5'-gcagcaaagcctacagcaac-3'；
22.h3n2-h3-r-1-cy3-r：5'-ccggatgaggcaactagtga-3'；
23.h3n2-h3-probe：5'-ccttatgatgtgccggattatgcctcc-3'；
24.h3n2-n2-f-1-r：5'-tgggaaccaaacaagtgtgc-3'；
25.h3n2-n2-r-1-cy3-r：5'-tatcatccccagtgacacag-3'；
26.h3n2-n2-probe：5'-ccagctcaagttgccatgatgggaaag-3'；
27.rsv-a-f：5'-gccacatttacattcctggtcaac-3'；
28.rsv-a-r-cy3：5'-gtgtgtgctttgtaggcttaatgc-3'；
29.rsv-a-probe：5'-gaaatgaaactattgcacaaagtgggaagc-3'；
30.rsv-b-f：5'-agatgaagctattgcacaaagtagg-3'；
31.rsv-b-r-cy3：5'-acccgccatgattgataaatatagg-3'；
32.rsv-b-probe：5'-accaaatacaagaaatacactgaatataataca-3'。
33.本发明所述的试剂盒包含以下以下引物对及探针：
34.ic-f：5'-ggggtgttgaaggtctcaaa-3'；
35.ic-r-cy3：5'-ggcatcctcaccctgaagta-3'；
36.ic-probe：5'-gctcattgtagaaggtgtggtgccaga-3'。
37.本发明所述的试剂盒包含以下以下探针：hc-probe：5'-acttcagggtgaggatgcc-3'。
38.本发明所述的试剂盒包含基因芯片。
39.本发明所述的试剂盒包含pcr扩增试剂混合物：dntp、缓冲系统。
40.本发明所述的试剂盒包含酶混合物：hot start taq酶、逆转录酶。
41.本发明所述的试剂盒包含杂交缓冲液：tris-hcl、tritonx-100、nacl。
42.本发明所述的试剂盒包含阴性参考品：纯化水、定位点。
43.本发明所述的试剂盒包含20
×
ssc、10％sds。
44.本发明所述的试剂盒包含操作说明书。
45.本发明的有益效果为，1、本试剂盒可同时检测临床样本中的为甲型流感病毒(ifv-a、h1n1、h1n2、h3n2)；乙型流感病毒(ifv-b)；呼吸道合胞体病毒(rsv-a，rsv-b)。2、检测灵敏度：5
×
103copies/ml。3、符合率和精密度检测均为100％。4、本试剂盒的检测项目之间不存在交叉反应；少量血液、脓性分泌物，低浓度抗生素、抗病毒药物等潜在干扰物对检测结果无明显影响。
46.下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
47.图1为本发明基因芯片检测结果图。
48.图2为本发明基因芯片检测结果图。
49.图3为本发明基因芯片检测结果图。
50.图4为本发明基因芯片检测结果图。
51.图5为本发明基因芯片检测结果图。
52.图6为本发明基因芯片检测结果图。
53.图7为本发明基因芯片检测结果图。
54.图8为本发明基因芯片检测结果图。
55.图9为本发明基因芯片检测结果图。
56.图10为本发明基因芯片检测结果图。
57.图11为本发明基因芯片检测结果图。
58.图12为本发明基因芯片检测结果图。
59.图13为本发明基因芯片检测结果图。
60.图14为本发明基因芯片检测结果图。
61.图15为本发明基因芯片检测结果图。
62.图16为本发明基因芯片检测结果图。
63.图17为本发明基因芯片检测结果图。
64.图18为本发明基因芯片检测结果图。
65.图19为本发明基因芯片检测结果图。
66.图20为本发明基因芯片检测结果图。
67.图21为本发明基因芯片探针布局图。
具体实施方式
68.本试剂盒采用dna聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)技术，对待测样本进行扩增和荧光标记，将扩增标记产物与基因芯片上特异的探针进行杂交，通过荧光扫描设备获得杂交数据，分析检测数据从而判断被检样品中是否有甲型流感病毒(ifv-a、h1n1、h1n2、h3n2)，乙型流感病毒(ifv-b)，呼吸道合胞体病毒(rsv-a，b)，从而进行定性分析。
69.【样本要求】
70.1采集：呼吸道标本。
71.1.1咽拭子取样：让病人头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，手持拭子在病人两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子放入采样管中。
72.2存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时，-18℃以下保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。应避免反复冻融。
73.3运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
74.【检验方法】
75.1仪器和耗材
76.1.1无菌操作台、生物安全柜；
77.1.2基因扩增(pcr)仪(适用0.2ml pcr薄壁管)；
78.1.3取样器(0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl)；
79.1.4台式离心机(转速可达12,000rpm)；
80.1.5可调42℃的恒温热台
81.1.6水浴芯片洗脱仪(可恒温42℃)；
82.1.7载玻片架；
83.1.8芯片激光扫描仪(axon genepix 4000a/b)；
84.1.9pcr扩增所需一次性耗材。
85.2检测前准备
86.2.1芯片洗脱液配制(若10％sds出现白色絮状沉淀，请于42℃条件加热至溶液透明后再使用)
87.2.1.1在芯片洗脱容器中按照蒸馏水(或纯化水):20
×
ssc:10％sds＝100:5:1配制洗脱液ⅰ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；
88.2.1.2在芯片洗脱容器中按照蒸馏水(或纯化水):20
×
ssc:10％sds＝400:1:4配制洗脱液ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；
89.2.1.3洗脱液一次配制可连续使用15天。
90.3样本处理
91.以下仅对热裂解法提取目的dna进行描述，也可采用市售磁珠或离心柱法核酸提取试剂盒。
92.3.1向采样管中加入1ml1
×
te溶液，充分震荡混匀；
93.3.2将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min；
94.3.3弃上清，沉淀(或5μl阴性参考品)中加入100μl核酸提取液，震荡混匀后(30秒以上)100℃恒温处理10min(误差不超过1min)；
95.3.4震荡混匀后(30秒以上)12,000rpm离心5min，上清液即为临床样本dna(或参考品模板)；
96.4 pcr扩增及标记
97.检测按下表配制扩增-标记反应体系，按其循环参数在0.2ml pcr薄壁管中进行扩增和标记。
[0098][0099]
5杂交
[0100]
5.1恒温热台升温恒定到42℃，用42℃预热的杂交模块将芯片固定好。
[0101]
5.2将pcr产物加热至95℃(置于pcr仪中)变性5min,立即冰浴3min。
[0102]
5.3取75μl杂交缓冲液加入临床样本扩增反应管中充分混匀，将混合物由加样孔滴加入对应微阵列反应室内(操作过程中禁止触碰到微阵列区，避免将混合液滴落到杂交模块表面)，杂交60min。
[0103]
6洗脱
[0104]
洗脱前将洗脱液在37℃预热，小心将芯片从杂交模块中取出，立即放入洗脱容器中，42℃下浸洗。
[0105]
洗脱流程：洗脱液ⅰ，震荡洗脱1min；洗脱液ⅱ，震荡洗脱1min。洗脱完毕后，将芯片自然晾干或低速甩干即可进行扫描。
[0106]
7扫描及结果判定
[0107]
7.1将干燥后的芯片置于激光扫描仪中，使用532nm波长激光扫描(按说明书操作)，获得扫描图谱及数据。
[0108]
7.2按照说明书要求对检测数据进行分析，生成检测报告(为简化操作，数据判读可采用数据辅助分析软件进行)。
[0109]
【阳性判断值】
[0110]
1判定值
[0111]
1.1芯片探针布局如图21所示，其中bc为空白点，ic为提取对照兼阳性对照探针，hc为杂交对照探针，ifv-a、h1n1、h1n2、h3n2为甲型流感病毒的检测探针；ifv-b为乙型流感病毒的检测探针；rsv-a为呼吸道合胞体病毒a的检测探针；rsv-b为呼吸道合胞体病毒b的检测探针；
[0112][0113][0114]
1.2对于任意探针位点，其荧光值中值≥1.5倍荧光背景中值，判断该位点为“阳性”，否则该位点判断为“阴性”。
[0115]
2结果判读步骤
[0116]
2.1判断nc：若其2个重复位点均为阴性，则继续进行第2.2步判读，否则判读结果为“失败”；
[0117]
2.2判断ic：若其2个重复位点均为阳性，则继续进行第2.3步判读，否则判读结果为“失败”；
[0118]
2.3判断hc：若其2个重复位点均为阳性，则继续进行第2.4步判读，否则判断结果为“失败”；
[0119]
2.4判断病原体检测探针：例如ifv-b探针，若其2个重复位点均为阳性，则判为乙型流感病毒的检测结果为“阳性”，否则判断结果为“阴性”；
[0120]
2.5重复第2.4步操作，对其病原体探针的扫描数据进行判读；
[0121]
2.6整理判读结果，生成检测报告。
[0122]
[0123][0124]
【检验结果的解释】
[0125]
1.nc(阴性质控探针)不满足要求引起的判读“失败”，原因为检测体系出现问题。
[0126]
2.ic(提取对照兼内对照探针)判读为“阳性”，表明标本中含有人体基因组rna；该探针判读为“阴性”，表明标本采集时可能未取到足量的人体脱落细胞或核酸提取、pcr扩增
体系出现问题，建议重新取样检测。
[0127]
3.hc(杂交阳性对照探针)不满足要求引起的判读“失败”，原因为杂交体系出现问题。
[0128]
4.检测阴性质控时，ic判读应为阳性，其余病原体探针应为阴性，否则表明扩增体系被污染。
[0129]
5.对某一病原体检测探针，若其2个重复位点中，满足“阳性”的位点数只有一个，则需重新检测；若该问题重复出现，请与试剂盒生产厂商联系。
[0130]
【本试剂盒的特别说明】
[0131]
1检测结果仅表示标本中是否含有病原体核酸，不能区分活性病原体与非活性病原体。
[0132]
2不合理的标本采集、储运或低于检测限的病原体浓度可能导致假阴性结果。
[0133]
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。