一种高效致病力生防菌斐济曲霉菌株及其应用

1.本发明涉及微生物防治技术领域，具体涉及一种高效致病力生防菌斐济曲霉菌株及其应用。


背景技术：

2.柑橘木虱(diaphorina citri kuwayama)是芸香科植物新梢期的重要害虫，以成虫若虫聚集在嫩梢、嫩芽和嫩叶上，通过刺吸式口器吸取寄主植物韧皮部汁液，被害叶片黄化、崎形、枯萎甚至死亡，取食后排出大量的白色蜜露，引起煤烟病，影响植物的光合作用，严重影响植株的生长发育。同时又是柑橘黄龙病的重要传播媒介。柑橘木虱在柑橘黄龙病病株上取食、产卵繁殖，可产生大量的带菌成虫，成虫可通过转移为害新植株而传播黄龙病。目前防治柑橘木虱的主要方法仍是依靠化学药剂，但长期、大量使用化学农药导致了柑橘果园天敌昆虫大量死亡、生物多样性丧失、产生不同程度的抗药性、果园生态环境受到污染等一系列负面问题，果实农药残留超标的问题也时有发生。面对这样的被动局面，研究与应用非化学手段防控柑橘木虱已是柑橘产业面临的急迫问题。因此，在国家提倡“农药、肥料”双减的大背景下，寻找高效且环境友好型的防治手段显得尤为重要。
3.生物防治即利用物种间相互依存或制约的关系，以一类生物抑制另一类生物，使生物间存在的动态平衡关系向农业生产的有利方向倾斜的防治措施。生物防治与其他防治方法相比，其对人畜、生态环境安全，具高效持久性，是害虫综合防治措施中最具前景的防治手段。因此，寻求有效的生物防治产品及应用技术是今后害虫可持续控制的主要研究方向之一。研发安全、高效、可持续控制柑橘木虱的微生物农药替代化学农药具有重要的社会经济效益与生态效益。
4.昆虫病原真菌正是一类优良的化学农药环保替代品，被广泛用于农业害虫的生物防治。虫生真菌对于具有抗药性和农药敏感性的柑橘木虱都具有相同控制效果，防治前景被广泛看好。研究表明昆虫病原真菌对害虫的致病机制复杂，不同于现有化学农药的杀虫机制。至今仍未发现有对昆虫病原真菌产生抗药性的害虫，因而在治理害虫的抗药性问题上昆虫病原真菌的应用开发潜力巨大。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有柑橘木虱防治技术上的不足，提供一种对柑橘木虱具有高致病力的生防菌及其防治方法。虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选主要考虑3个指标分别是产孢量、菌落生长速率、致病力。本发明以这些指标为依据，筛选优良菌株。
6.本发明的第一个目的是提供一株斐济曲霉菌(aspergillusfijiensis)gdizm-1，其保藏编号为：gdmcc no：62135。
7.本发明菌株gdizm-1在pda培养基上质地致密，菌落平坦，背面有放射状沟纹。菌落正面初期为白色菌丝，后期为黄褐色，呈粉末状；背面颜色逐渐加深，呈土黄色。分生孢子梗
长短不一，壁光滑，具有足细胞，大小为200-1100μm
×
8-16μm，分生孢子梗顶端膨大形成顶囊近球形，大小为20-45μm
×
10-15μm，顶囊上覆盖一层小梗，小梗单层，呈放射状排列，大小为3-6μm
×
2-3μm，表面3/4可育。小梗着生分生孢子近球形，壁粗糙，长满刺，呈链状排列，直径约为3-5μm。
8.本发明斐济曲霉菌gdizm-1的不同浓度分生孢子悬浮液(1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108个孢子/ml)对柑橘木虱(1-5龄若虫和成虫)的6个龄期的校正死亡率与对照相比均差异显著，表明斐济曲霉菌对柑橘木虱若虫和成虫具有高致病性。同时，gdizm-1对柑橘木虱1-2龄(低龄)、3-4龄(高龄)、5龄(末龄)若虫及成虫的lc
50
和lt
50
的值分别为0.43
×
104、1.41
×
104、2.41
×
104、3.79
×
104个孢子/ml和2.30、2.86、3.43、4.25天。表明斐济曲霉菌在柑橘木虱的生物防治方面具有重要的应用潜力。
9.本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，以上述gdizm-1的培养物或其发酵液作为活性成分。
10.优选地，是将gdizm-1接于sday平板上，于温度24-26℃、光照14l：10d中进行培养，从而获得gdizm-1的培养物。
11.本发明的第三个目的是提供斐济曲霉菌(aspergillusfijiensis)在以下任一项中的应用：
12.(1)防治柑橘木虱或其引起的病害；
13.(2)制备生物防治药物。
14.优选地，所述斐济曲霉菌为aspergillus fijiensis gdizm-1，其保藏编号为：gdmcc no：62135。
15.优选地，所述柑橘木虱引起的病害为柑橘木虱作为传播媒介所引起的病害。
16.优选地，所述柑橘木虱引起的病害包括但不限于柑橘黄龙病。
17.优选地，所述的斐济曲霉菌是对柑橘木虱若虫和成虫进行防治。
18.优选地，所述的生物防治药物含有斐济曲霉菌分生孢子或其悬浮液。
19.进一步地，制备所述的斐济曲霉菌分生孢子包括以下步骤：将斐济曲霉菌斜面菌种取出活化，接种到sday平板上，于恒温培养箱中培养10d，随后刮下培养基表面分生孢子，用含0.1％吐温80无菌水过滤收集分生孢子；所述的其悬浮液是将收集分生孢子配制得到分生孢子悬浮液。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.(1)本发明筛选得到了一株对柑橘木虱具有高致病力的斐济曲霉gdizm-1，经长期的侵染生物学和室内生物测定，测定对柑橘木虱1-2龄(低龄)、3-4龄(高龄)、5龄(末龄)若虫及成虫的lc
50
和lt
50
的值分别为0.43
×
104、1.41
×
104、2.41
×
104、3.79
×
104个孢子/ml和2.30、2.86、3.43、4.25天，表明该菌株对柑橘木虱具有很强的侵染杀虫效果，在柑橘木虱的生物防治中具有非常强的应用潜力；
22.(2)该斐济曲霉gdizm-1产孢量大，在sday培养基上培养10d后产孢量可达到3.86
×
108个孢子/ml；
23.(3)该斐济曲霉gdizm-1菌落生长速率快，在sday培养基上培养5d后菌落直径可达到83mm；
24.(4)斐济曲霉可作为一种活体生物杀虫剂，对环境无污染、无残留，能够解决柑橘
木虱防治过程中的抗药性问题与农药残留问题，适应有机食品生产的要求。
25.本发明的aspergillus fijiensis gdizm-1，于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：gdmcc no：62135。
附图说明
26.图1为柑橘木虱若虫和成虫感染斐济曲霉(1
×
107个孢子/ml)第10天的症状，图示a、b、c、d、e、f分别为1、2、3、4、5龄若虫和成虫；图示a、b、c、d、e、f的标尺值分别为100、200、200、200、200、500μm。
27.图2为斐济曲霉分离株的菌落形态图；图示a、b为第3天斐济曲霉菌落正面和反面；图示c、d为第10天斐济曲霉菌落正面和反面；图示e、f、g、h为斐济曲霉菌落渐变过程；图示a、b、c、d的标尺值均为10mm，图示e、f、g、h的标尺值分别为1mm、500μm、200μm、500μm。
28.图3为斐济曲霉菌株gdizm-1分生孢子囊及分生孢子的形态图，图示a为斐济曲霉gdizm-1顶囊及分生孢子；图示b为斐济曲霉gdizm-1足细胞；图示c为斐济曲霉gdizm-1分生孢子；图示a、b、c的标尺值均为10μm。
29.图4为斐济曲霉菌株gdizm-1的分子鉴定系统发育树。
30.图5为不同浓度的斐济曲霉孢子悬浮液(1
×
104，1
×
105，1
×
106，1
×
107，1
×
108个分生孢子/ml)对不同发育阶段柑橘木虱的死亡率。
具体实施方式
31.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
32.实施例1柑橘木虱致病菌株的分离纯化与鉴定
33.1.1材料来源
34.(1)样品：采集于柠檬园被虫生真菌侵染后的柑橘木虱虫尸。
35.(2)供试昆虫：柑橘木虱在广东省科学院动物研究所环境昆虫研究中心网室饲养繁殖多代。
36.(3)pda培养基：6g/l马铃薯浸粉，20g/l葡萄糖，20g/l琼脂；sday培养基：10g/l酵母浸粉，40g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，20g/l琼脂；上述培养基的溶剂为水，其制备方法是将各成分混合均匀，灭菌备用。
37.(4)无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭锅灭菌(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
38.1.2菌株的分离纯化
39.从被虫生真菌感染的柑橘木虱虫尸样品上分离目标菌。步骤如下：利用5％的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入pda平板中，倒置于25℃
±
1℃、光照(14l:10d)的恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到pda斜面中，再转入4℃冰箱贮存。将菌株分别在pda培养基上培养10d，待其形成孢子后，挑取分生孢子制成1
×
103个孢子/ml的分生孢子悬浮液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入培养基上，放在培养箱中培养，获得分离
株。
40.在自然条件下，被真菌寄生的柑橘木虱虫体上长出典型孢梗束。分离纯化后获得一真菌菌株，编号为gdizm-1。经回接验证，该株菌能够成功感染各龄期柑橘木虱，接种2d后均能观察到在体表长出白色菌丝体，同时表现出反应迟钝、行动迟缓、体色变化等症状，接种10d后虫体长出典型孢梗束，感染形态见图1。分离结果显示，接种虫体上长出的菌体与原接种菌株培养性状和形态特征均相同，表明上述菌株是侵染柑橘木虱的虫生真菌。
41.1.3菌株的鉴定
42.(1)形态学鉴定：
43.将菌株点种于pda平板上在25
±
1℃恒温培养箱内培养，每天观测菌落正面和背面的颜色、质地、大小、高度、表面纹饰、边缘、渗出物等拍照。用接种针挑取少量孢子点植于pda平板上待其产孢成熟时制作玻片，选取质地细腻的透明胶带，用镊子夹住已剪为适当大小的小块胶带，从菌落的边缘向中央轻柔缓慢粘黏后用95％酒精固定并侵入棉兰染色，将粘有产孢结构的透明胶带面朝上放，2-3min后轻轻放下盖玻片，小心避免产生气泡。在低倍镜下观察找到视野，然后滴加香柏油或石蜡油，于油镜下观察分生孢子梗、产孢细胞及孢子的结构特征。用imaging mp5.0-rtv-clr-10-a相机在1000倍下拍摄，随后合成整理图片。
44.菌株在pda培养基上质地致密，菌落平坦，背面有放射状沟纹。菌株在pda培养基上的菌落形态如图2所示，菌落正面初期为白色菌丝，后期为黄褐色，呈粉末状；背面颜色逐渐加深，呈土黄色。如图3所示，分生孢子梗长短不一，壁光滑，具有足细胞，大小为200-1100μm
×
8-16μm，分生孢子梗顶端膨大形成顶囊近球形，大小为20-45μm
×
10-15μm，顶囊上覆盖一层小梗，小梗单层，呈放射状排列，大小为3-6μm
×
2-3μm，表面3/4可育。小梗着生分生孢子近球形，壁粗糙，长满刺，呈链状排列，直径约为3-5μm。
45.(2)分子鉴定：
46.本研究特有的dna序列由三个基因组成，包括转录间隔区、伸长因子和rna聚合酶ⅱ大亚基。取已培养成熟的菌株100mg，采用真菌基因组dna抽提试剂盒提菌丝的基因组dna，以菌株的基因组dna为模板，以its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)和its5(5
’‑
ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’)、ef-1983f(5
’‑
gc(y)cc(y)gg(h)ca(y)g gtga(y)tt(y)at-3’)和ef-12218r(5
’‑
atac(r)tg(r)gc(r)ac(r)gt(y)tg-3’)、frpb2-5f(5
’‑
ga(y)ga(y)(m)g(w)gatca(y)tt(y)gg-3’)和frpb2-7cr(5
’‑
cccat(r)gcttg(y)tt(r)cccat-3’)为引物扩增，然后在genbank中进行blast比对分析。上述的(y)、(h)、(r)、(w)符号代表简并碱基，即一个符号代替某两个或者更多碱基，其中(y)表示c/t；(h)表示a/t/c；(r)表示a/g；(w)表示a/t。
47.pcr 50μl反应体系：上下游引物各1μl、ddh2o 22μl、dna模板1μl、2
×
master mix 25μl。扩增rdna-its序列的pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增ef-1α基因序列的pcr扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸10min。扩增frpb2基因序列的pcr扩增程序：95℃预变性10min；94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察是否有目的条带，将条带大小正确的扩增产物于深圳华大基因有限公司进行测序。将测序结果通过生信软件mega 7.0进行序列的拼接去除首尾参差不齐的部分序列，并通过ncbi
网站在线程序blast进行基因的同源相似性比对，下载相关已发表模式菌株对应序列。基于its、ef-1α、和frpb2标记基因，采用进化分析软件mega7.0对待鉴定的真菌构建系统发育树。选用邻接法(neighbor joining)建树，步长检验(bootstrapmethod)选择参数为1000，遗传距离计算模型(substitutionmodel)选择p-distance。
48.将gdizm-1菌株的pcr产物经纯化、回收并测序得到的its(seq id no.1)、ef-1α(seq id no.2)、frpb2(seq id no.3)三个基因片段拼接，串联后用邻接法构建neighbor joining tree(图4)。将得到的dna序列在ncbi上进行blast比对。比对后发现菌株gdizm-1与斐济曲霉的相似度为99％～100％。同时菌株gdizm-1与斐济曲霉相关株系聚为一支，而与外群遗传距离较远。再结合对gdizm-1的菌种形态鉴定，可确定菌株gdizm-1为斐济曲霉(aspergillus fijiensis)。
49.因此结合形态学、分子生物学，将gdizm-1菌株命名为斐济曲霉(aspergillus fijiensis)gdizm-1，于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：gdmcc no：62135。
50.实施例2斐济曲霉gdizm-1菌株菌丝生长和产孢特性研究
51.菌落生长速率和产孢量的测定：将斐济曲霉gdizm-1的斜面菌种取出活化，接种到sday平板上，于恒温培养箱中培养10d，随后刮下培养基表面分生孢子，用含0.1％吐温80无菌水过滤收集分生孢子，配制成1
×
107个孢子/ml的孢子悬浮液。吸取1ml孢子悬浮液滴于sday平板中央，抹匀后封口于恒温培养箱培养，观测10d，每天记录各菌落直径，5个重复。10d后，用含0.1％吐温80的无菌水过滤分生孢子，使用血球计数板测定产孢量。
52.斐济曲霉分离菌株菌落生长速率及产孢量如表1所示，数据为平均值
±
标准误。研究发现斐济曲霉培育5天后，其菌落直径达到83.7
±
0.47mm(平均值
±
标准误)；培育10天后其在sday培养基产孢量为3.86
×
108个孢子/ml。
53.表1斐济曲霉分离菌株gdizm-1菌落生长速率及产孢量
[0054][0055]
实施例3斐济曲霉gdizm-1菌株对柑橘木虱的致病力测定
[0056]
(1)斐济曲霉gdizm-1菌株分生孢子悬浮液的制备:将斐济曲霉gdizm-1斜面菌种取出活化，接种到sday平板上，于恒温培养箱中培养10d，随后刮下培养基表面分生孢子，用含0.1％吐温80无菌水过滤收集分生孢子，配制成1
×
104，1
×
105，1
×
106，1
×
107，1
×
108个孢子/ml的孢子悬浮液。
[0057]
(2)选取健康柠檬植株，将老叶剪除，清水洗净叶片，待将1-5龄柑橘木虱若虫及成虫完全浸泡于5个不同浓度的孢子悬浮液2分钟后，用滤纸干燥，随即转移至柠檬幼苗嫩叶上并套袋，在条件为温度25
±
2℃，湿度75
±
5％rh，和光周期14:10(l:d)的人工气候室内饲养，每个处理20头，重复3次。连续观察记录8d死亡率，评估柑橘木虱幼龄若虫(1-2龄)、老龄若虫(3-4龄)、末龄若虫(5龄)和成虫(孵化3天)的lc
50
值和lt
50
值。阴性对照为双无菌水。上述所有试验数据均在数据处理软件spss系统上处理完成。
[0058]
致病力研究结果如图5所示，5个分生孢子浓度的斐济曲霉gdizm-1孢子悬浮液(1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108个孢子/ml)对柑橘木虱(1-5龄若虫和成虫)的6个龄期的校正死亡率与对照相比差异显著。浓度为1
×
108个孢子/ml的斐济曲霉gdizm-1对柑橘木虱若虫(88.67％-98.14％)和成虫(87.32％)具有高致病性。同时，其对柑橘木虱1-2龄(低龄)、3-4龄(高龄)、5龄(末龄)若虫及成虫的lc
50
和lt
50
的值分别为0.43
×
104、1.41
×
104、2.41
×
104、3.79
×
104个孢子/ml(表2)和2.30、2.86、3.43、4.25天(表3)。其中，表2和表3中的x表示孢子悬浮液浓度的对数值，y表示孢子悬浮液浓度的对数值对应的数值。
[0059]
表2感染8d后斐济曲霉对不同发育阶段柑橘木虱的毒力
[0060][0061]
表3感染斐济曲霉(1
×
108个孢子/ml)对不同发育阶段柑橘木虱的毒力
[0062][0063]