一种用于筛选两季开花鸢尾品种的鸢尾SSR分子标记组及其应用

一种用于筛选两季开花鸢尾品种的鸢尾ssr分子标记组及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种用于筛选两季开花鸢尾品种的鸢尾ssr分子标记组及其应用。


背景技术：

2.花朵是花卉最主要的观赏部位之一。多季开花可以大幅延长花卉观赏期，因此多季开花是花卉育种的关键目标之一，具有重要的应用价值。两季开花是指在植物的年生长周期内，开两次花。在北方地区常见为春秋两季开花，在其他地区往往为春夏两季开花。两季开花的花卉，能够丰富夏或秋季园林中观赏花卉的种类，显著延长花卉的观赏期。
3.目前国外已经培育了许多能够两季开花的鸢尾，以有髯鸢尾为主。有髯鸢尾(bearded iris)是鸢尾科(iridaceae)鸢尾属(iris)多年生宿根草本植物中非常重要的类群，花型奇特，花色丰富，花期一般为4～5月，是重要的庭园、地被用植物。我国大多数两季开花鸢尾引种于国外，由于引种不规范以及两季开花遗传规律不明，在非花期时节，难以直接分辨出是否为两季开花鸢尾；此外，通过杂交育种等手段创制的鸢尾新品种通常需要三年以上时间才可开花，无法在早期对两季花鸢尾杂交子代的开花性状进行判断，这些给两季开花鸢尾的园林应用和新品种培育带来了很大的困难。
4.ssr(simple sequence repeats)又称微卫星(microsatellite)dna，是一种广泛分布于真核生物基因组中的串联简单重复序列，每个重复单元的长度在1～6bp之间。ssr分子标记具有重复性好、结果可靠、多态性丰富、共显性、所需dna少等优点。通过分子标记辅助选择(molecular marker-aided selection，mas)的方法可以实现两季开花鸢尾的早期鉴定。传统的ssr分子标记常配合聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性分析，该电泳具有有毒性、电泳时间较长和不同等位变异难以准确识别等问题。利用通过在正向引物5’端添加荧光标记及毛细管电泳的方法(dendauw,j.,et al.development of sequenced tagged microsatellite site(stms)markers in azalea:utilisation des marqueurs microsatellites a sequences etiquetees chez les azalees.2001,546(546):193-197.dendauw,j.,et al.identification of 33chinese rhododendron species using matk sequences and aflp data.acta horticulturae,2002,169-177.)，能够更大量、快速、精确的区分相差微小的条带，有效提高实验效率和准确性。
5.关联分析(association analysis)是以自然群体为研究对象，利用连锁不平衡(linkage disequilibrium，ld)，结合基因的多态性，能够找出与表型性状相关联的位点(李那，赵毅强.全基因组关联分析及其扩展方法的研究进展.农业生物技术学报，2019，27(01):150-158.)。通过将获得的高多态性分子标记位点与开花性状进行关联分析，可有效获得鉴定鸢尾两季花性状的优良ssr分子标记，这对于两季花鸢尾杂交子代早期鉴定和相关研究具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一组与鸢尾品种两季开花性状相关的ssr分子标记组及其应用。本发明还提供一组鸢尾转录组ssr特异性标记引物组，目的在于利用所述引物组辅助鉴定鸢尾两季开花品种。
7.本发明提供了一种用于筛选两季开花鸢尾品种的鸢尾ssr分子标记组，所述ssr分子标记组包括以下8个，核苷酸序列具体如下：(1)p2s19：序列如seq id no.17所示；(2)p2s45：序列如seq id no.18所示；(3)p2s48：序列如seq id no.19所示；(4)p3s12：序列如seq id no.20所示；(5)p3s17：序列如seq id no.21所示；(6)p3s28：序列如seq id no.22所示；(7)p3s30：序列如seq id no.23所示；(8)p3s41：序列如seq id no.24所示。
8.本发明还提供了一种用于筛选两季开花鸢尾品种的引物组，包括以下8对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列具体如下：
9.(1)p2s19：正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示；(2)p2s45：正向引物序列如seq id no.3所示，反向引物序列如seq id no.4所示；(3)p2s48：正向引物序列如seq id no.5所示，反向引物序列如seq id no.6所示；(4)p3s12：正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物序列如seq id no.8所示；(5)p3s17：正向引物序列如seq id no.9所示，反向引物序列如seq id no.10所示；(6)p3s28：正向引物序列如seq id no.11所示，反向引物序列如seq id no.12所示；(7)p3s30：正向引物序列如seq id no.13所示，反向引物序列如seq id no.14所示；(8)p3s41：正向引物序列如seq id no.15所示，反向引物序列如seq id no.16所示。
10.本发明还提供了一种用于筛选两季开花鸢尾品种的检测试剂或试剂盒，含有上述引物组。
11.本发明还提供了上述的引物组、或上述的检测试剂或试剂盒在筛选两季开花鸢尾品种中的应用。
12.本发明还提供了一种两季开花的鸢尾品种的筛选方法，包括以下步骤：
13.(1)提取鸢尾基因组dna；
14.(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用权利要求2所述的引物组进行pcr扩增；
15.(3)用毛细管电泳对步骤(2)的pcr产物进行检测；
16.(4)分析步骤(3)检测结果，与作为标准样品的两季及单季开花的鸢尾检测结果一起构建鸢尾品种聚类树状图；
17.(5)根据步骤(4)构建的鸢尾品种聚类树状图，与作为标准样品的两季开花的鸢尾聚为一类的，即为两季开花的鸢尾品种。
18.具体的，步骤(2)中所述pcr扩增体系为：20μl，其中上下游引物各1.0μl，上下游引物的浓度为10mm，5u/μl taq polymerase 10μl，20ng/μl dna模板1.0μl，ddh2o 7.0μl；所述pcr扩增程序为：94℃预变性3min；93℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min。
19.具体的，步骤(3)中毛细管电泳检测步骤为：将步骤(2)的pcr产物中加入0.5μl分子量内标和去离子甲酰胺8.5μl进行变性，变性条件为95℃，5min；置于冰上冷却10min以上，离心10s后进行毛细管电泳检测仪。
20.分析步骤(3)检测结果具体步骤为：根据步骤(3)毛细管电泳检测结果，按照upgma法对鸢尾品种进行遗传聚类分析：首先制作鸢尾品种的(0，1)矩阵，具体为：将毛细管电泳检测出的条带按照从小到大排列并标号，每个品种对应每个带型，有条带的记为1，无条带的记为0；再通过ntsys-pc软件制作鸢尾品种的聚类树状图；鸢尾品种聚类树状图可聚为不同类群，与标准样品的两季开花的鸢尾聚为一类的，即为两季开花的鸢尾品种。
21.本发明还提供了上述的筛选方法在在筛选两季开花鸢尾品种中的应用。
22.本发明的有益效果：本发明开发的ssr分子标记是可以对两季开花鸢尾品种进行鉴定的共显性分子标记，与现有技术相比具有以下优点和效果：(1)通过添加荧光标记及毛细管电泳的方法，本发明可以简单、快速、稳定、毒性小地鉴别出两季开花鸢尾品种；(2)本发明将ssr分子标记与两季开花性状关联，通过本发明的方法能够发掘与两季开花显著关联的ssr标记，为鸢尾两季开花辅助育种和遗传改良提供重要理论依据。
23.本发明提供的ssr分子标记引物组能够很好的区分不同鸢尾品种，并用于鉴别鸢尾两季开花鸢尾品种。
附图说明
24.图1为采用分子标记p2s19引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
25.图2为采用分子标记p2s45引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
26.图3为采用分子标记p2s48引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
27.图4为采用分子标记p3s12引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
28.图5为采用分子标记p3s17引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
29.图6为采用分子标记p3s28引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
30.图7为采用分子标记p3s30引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
31.图8为采用分子标记p3s41引物扩增17个鸢尾品种dna的ssr琼脂糖凝胶电泳图。
32.图9为17个鸢尾品种的聚类树状图。
33.图10为鸢尾品种两季开花性状关联分析qq图(glm模型)。
34.图11为鸢尾品种两季开花性状关联分析qq图(mlm模型)。
35.图12为毛细管电泳峰示例图。
具体实施方式
36.实施例1
37.(1)植物材料
38.供试植物材料：本研究植物材料为采自宁波市北仑区园艺实验场的17个有髯鸢尾品种，见表1。并对17个鸢尾品种从1～17依次进行编号。将17个鸢尾品种的叶片擦净剪下后放入自封袋中，置于干冰中带回实验室，保存于-80℃冰箱中备用。
39.表1鸢尾品种信息
[0040][0041]
(2)引物设计
[0042]
根据鸢尾转录组初选出110对ssr引物，所选引物具体为：pcr产物在200～300bp、tm值58.8～60.2℃、gc含量40％～60％；其中二碱基突变和三碱基突变的ssr引物各55对，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0043]
(3)基因组dna提取
[0044]
采用诺维赞基因组dna快速提取试剂盒提取待测样品基因组dna，利用1％琼脂糖凝胶电泳和nanodrop紫外分光光度计测定dna的质量和浓度，稀释至20ng/μl，保存于-20℃冰箱中备用。
[0045]
(4)鸢尾ssr分子标记的筛选与检测
[0046]
用上述初选的110对引物对4个鸢尾品种(从17个鸢尾样品中随机挑选)进行pcr扩增。从中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的8对ssr引物，见表2。在这8对引物的正向引物5’端加上荧光基团标记fam，序列为：tgtaaaacgacggccagt，反向引物不变。用加了标记序列的8对引物对全部样品进行pcr扩增。所得的pcr产物分为两份，一份用于琼脂糖凝胶电泳分离，一份用于荧光毛细管电泳检测。pcr产物序列见表3。
[0047]
表2 8对ssr标记引物信息
[0048][0049]
[0050]
表3 8对ssr标记序列信息
[0051]
[0052][0053]
a.ssr标记pcr扩增条件
[0054]
ssr标记检测pcr反应体系，见表4；pcr程序，见表5；pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，12分钟后在紫外凝胶成像仪上观察并拍照记录结果，所有ssr标记扩增条带清晰、重复性好，扩增产物大小均在200～300bp，见图1～8。
[0055]
表4 ssr标记检测pcr反应体系
[0056]
组分体积(μl)上游引物f(10mm)1.0下游引物r(10mm)1.0taq polymerase(5u/μl)10dna模板(20ng/μl)1.0ddh2o7.0
[0057]
表5 pcr反应扩增程序
[0058][0059]
b.毛细管电泳检测
[0060]
取步骤a获得的荧光标记的扩增产物、分子量内标和去离子甲酰胺加入到遗传分析仪专用96孔板上，变性，置于冰上冷却10min以上，离心10s；随后将96孔板放入毛细管电泳检测仪(3730xl型仪器，美国abi公司)；
[0061]
所述内标的用量为0.5μl；去离子甲酰胺的用量为8.5μl；变性的条件为95℃，5min。
[0062]
(5)结果分析
[0063]
a.ssr分子标记的遗传多样性分析
[0064]
用genemapper 4.0软件对荧光毛细管电泳数据进行分析，根据位点名称、荧光标记、片段大小和重复长度进行分析所需kit、panel和marker参数的创建，从tools菜单中打开genemapper manager，在genemapper manager的analysis method中选择microsatellite，其他参数选择默认值。用popgene软件分析数据获得引物等位基因数(na)、观察杂合度(ho)、期望杂合度(he)、nei氏遗传距离(nei)和香农指数(i)；具体参数设置为：the number of group为17，number of populations为1，number of loci为8，其余参数使用软件默认值。利用pic_calc软件计算ssr位点的多态性信息含量(pic)，使用默认参数。利用structure软件对17个鸢尾品种的遗传结构进行分析，确定种群数量(k值)，取值范围定为1～10，length of burnin period设定为30000，markov chain monte carlo(mcmc)设定为100000，其他参数使用软件默认值，运行软件，将得到的results文件夹打包成zip格式后，提交给在线软件structure harvester分析最佳k值，本实施例中k＝4。
[0065]
表6基于8对ssr标记的鸢尾品种遗传多态性分析
[0066][0067][0068]
根据表6引物多态性分析可以看出，此8对引物的等位基因数变化范围为3～9，平均数为5.375；pic值的变化范围为0.5072～0.8226，均大于0.5，平均值约为0.6228，说明此8种引物多态性高。
[0069]
b.17个鸢尾品种亲缘关系分析
[0070]
根据上述所得pcr产物毛细管电泳检测结果，按照upgma法对17个鸢尾品种进行遗传聚类分析。首先制作17个鸢尾品种的(0，1)矩阵(如表7所示)，具体为：将毛细管电泳检测出的条带按照从小到大排列并标号，本实施例中有39个带型，每个品种对应每个带型，有条带的记为1，无条带的记为0。再通过ntsys-pc软件，使用软件的默认参数制作17个鸢尾品种的聚类树状图(如图9所示)。在相对距离0.43处，从品种聚类树状图可以看出：17个鸢尾品种可聚为4个类群。其中antyrmn gircys，antumn encorc，city lights，donhle your，earl of essex，gnn rayz，i’ll be back，peach jam，victona fall共计9个品种聚为一类，均为两季开花鸢尾品种。change of p，broad way star，john naa，sultan’s palace，tide’sim共计5个品种聚为一类；black beard，berkeley gold共计2个品种聚为一类；fufted cloud单独聚为一类。后三类均为不可两季开花的鸢尾品种。聚类分析结果表明本发明提供的ssr引物组可有效的将上述材料按照是否具有两季开花性状进行划分，该ssr引物组可用于是否为两季开花鸢尾品种的鉴定。另外，该聚类树状图表明，17个鸢尾品种间遗传多样性较高。
[0071]
表7 17个鸢尾品种的(0，1)矩阵
[0072]
[0073][0074]
当需要鉴定鸢尾品种是否具有两季开花性状时，可以按照上述方法，通过上述引物组进行pcr扩增和毛细管电泳检测，将检测结果与图9中的亲缘关系聚类树状图相对比，得到与其最接近或者一致的类群，即可辅助判断待测鸢尾品种是否为两季开花品种。利用本发明提供的引物组可以为两季开花鸢尾育种提供帮助。
[0075]
实施例2
[0076]
ssr标记与鸢尾两季开花性状的关联分析。
[0077]
根据tassel官网上的软件操作手册，将实施例1中的8对ssr引物扩增结果进行转化。具体为每对引物中，出现最多次数的条带标为“a”，出现次数排第二的条带标为“c”，出现次数排第三的条带标为“g”，出现次数排第四的条带标为“t”，出现次数排第五的条带标为“+”，其他条带标为
“‑”
；按照上述规则得到一个基因型矩阵以供后续分析。
[0078]
将两季开花性状进行赋值，可两季开花的为1，不能两季开花的为0；加上不同品种的花茎大小和株高值，共3种性状，得到性状(trait)文件。
[0079]
使用clumpp对structure分析的重复运算结果进行重复抽样分析，得到最佳k值下各个品种相应的q值。利用tassel 5.0软件分析基因型文件的kinship。运行tassel 5.0软件的一般线性模型(glm)和混合模型(mlm)将3个性状与ssr标记基因型数据进行回归分析。在glm模型中，以q值为协变量；在mlm模型中，采用k值+q值对3个表型性状进行回归分析，确定关联位点。
[0080]
glm分析结果显示(图10)，在显著(p《0.05)条件下，检测到1个位点与两季开花性状关联，即p2s19。mlm分析结果中(图11)，未检测到与性状关联的位点。
[0081]
上述实验结果表明，通过实施例1和实施例2，本发明提供的ssr分子标记能够很好的区分不同鸢尾品种，并用于鉴别鸢尾两季开花鸢尾品种。