一种以N-乙酰葡萄糖胺发酵液为底物全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的方法

一种以n-乙酰葡萄糖胺发酵液为底物全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的方法
技术领域
1.本发明涉及一种以n-乙酰葡萄糖胺发酵液为底物全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的方法，属于生物工程应用领域。


背景技术：

2.唾液酸是一系列9-碳单糖及其衍生物的统称，因最初由颌下腺粘蛋白中分离出而得名。neu5ac(n-乙酰神经氨酸)是唾液酸的主要种类之一，含量占唾液酸家族的99％以上，主要以α-糖苷的形式位于糖蛋白或糖脂类等非还原性寡聚糖的末端。neu5ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生等多个生理过程，此外，neu5ac还能促进婴儿大脑的发育。neu5ac可以作为潜在的抗流感药物前体，用于预防和治疗流感，由于其具有多样的生物学功能，neu5ac在医药和生物技术产业上的需求日益增加。
3.neu5ac的制备方法有天然产物提取法、化学合成法、微生物发酵法、酶法合成和全细胞催化法。酶法生产neu5ac具有转化率高、提取简单、产品纯度高等优点，但对合成所用原料要求高，价格较为昂贵，且n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶需要atp作为活化剂，从而限制了生产规模的扩大。全细胞催化法的基本原理是利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化，将某种前体分子转化成特定产物，其实质是利用生物体系中酶的催化作用。全细胞催化法因其具有操作简便、高效、产物易于分离提纯等优点，是一种较好的生产neu5ac的方法。全细胞催化法与酶法相比不需要额外添加atp，节约了生产成本，同时也避免了繁琐的酶纯化步骤；但是全细胞生物催化方法中需要外源添加昂贵的n-乙酰葡萄糖胺作为底物，并且由于底物转化率不高，增加了后期底物回收和产物分离的难度，由于细胞膜的存在增加了底物和产物的传质阻力等，限制了全细胞生物催化方法在neu5ac生产中的工业应用。目前全细胞催化法生产neu5ac均以纯度较高的glcnac为底物，成本较高，考虑到neu5ac的生产成本和市场竞争性，不利于规模化生产。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种生物催化生产n-乙酰神经氨酸的方法，以含n-乙酰葡萄糖胺的发酵液为原料，利用细胞催化剂在30～37℃反应至少24h。
5.在一种实施方式中，所述细胞催化剂是重组大肠杆菌(escherichia coli)δnte/pet28a-(t7-shnal)-(tac-slr)，公开于2017年公开的江南大学学位论文《全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌构建》中。
6.在一种实施方式中，所述全细胞催化是将所述全细胞催化剂加入至反应体系中，控制初始od
600
为10-50，初始ph为6-8、丙酮酸浓度为0.83mol/l-2.2mol/l，表面活性剂tritonx-100按体积计≤1％，于温度20℃-50℃条件下反应24～40h。
7.在一种实施方式中，所述全细胞催化剂是将重组大肠杆菌在lb培养基中培养至od
600
约为0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/l异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，于28℃培养8h诱
导重组蛋白表达；诱导结束后，离心收集菌体，用ph7.5，100mmol/l tris-hcl缓冲液洗涤2次并收集菌体，获得全细胞催化剂。
8.在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌接种在lb培养基中，于37℃，200r/min培养10h得到种子液，再转接至lb培养基中进行诱导。
9.在一种实施方式中，所述全细胞催化是在如下反应参数下进行：细胞催化剂在反应体系中的菌体od
600
为20～30、转化液初始ph为6-8、glcnac与丙酮酸的比例为1:(5～8)；表面活性剂tritonx-100的添加量为0-1％、温度30℃-37℃条件下转化30～40h。
10.在一种实施方式中，反应体系中丙酮酸浓度为0.83mol/l-2.2mol/l。
11.在一种实施方式中，所述全细胞催化是在如下反应参数下进行：反应温度为30℃，初始ph为6.5，glcnac浓度为0.28mol/l，丙酮酸浓度为1.38mol/l，tritonx-100添加量为0.4％，菌体od
600
为30，转化70h，液相检测转化液中各组分含量情况。
12.在一种实施方式中，所述含n-乙酰葡萄糖胺的发酵液是在如下条件下发酵制备：
13.控制初始发酵温度为34℃，发酵过程中糖浓度低于2g/l时，补加葡萄糖母液以控制发酵体系中的残糖为2～5g/l；当od
600
达到55，提温至37℃，控制残糖为0.2～0.5g/l；发酵过程中通过自动补加氨水调节ph为6.9，关联转速从200到850r/min，调节溶氧在10-30％。
14.在一种实施方式中，所述n-乙酰葡萄糖胺发酵液是用重组大肠杆菌e.coli-glms-gna1-δnage(公开于公开号为cn102268399b的专利中)、e.coli 7107-18(公开于论文《engineering a new pathway for n-acetylglucosamine production:coupling a catabolic enzyme,glucosamine-6-phosphate deaminase,with a biosynthetic enzyme,glucosamine-6-phosphate n-acetyltransferase》)、或mg:ec glm s-gnal(公开于论文《大肠杆菌乙酰氨基葡萄糖代谢工程研究》)作为出发菌株经过补料分批发酵，得到glcnac≥60g/l的发酵液。
15.在一种实施方式中，所述葡萄糖母液的浓度为700g/l。
16.在一种实施方式中，所述发酵液还经过离心去除菌体细胞。
17.本发明还提供了所述方法在制备含有唾液酸化学品中的应用。
18.有益效果：本发明建立一种全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的方法，将n-乙酰葡萄糖胺与全细胞催化方法偶联，以含有n-乙酰葡萄糖胺的发酵液为底物直接进行全细胞催化生产n-乙酰神经氨酸的工艺流程。本发明的一种实施方式通过控制温度为30℃、转化液初始ph为6.5、底物丙酮酸浓度为1.38mol/l、tritonx-100添加量为0.4％、菌体od
600
为30的条件下进行全细胞转化，可以得到n-乙酰神经氨酸180mmol/l，摩尔转化率为65.45％。本发明的方法能够降低工业化生产neu5ac的成本，为neu5ac工业化生物催化生产提供一定的参考依据。
附图说明
19.图1重组e.coli atlwx生产glcnac的发酵过程曲线。
20.图2重组e.coli全细胞催化glcnac发酵液合成neu5ac的浓度变化。
21.图3以发酵液为底物进行全细胞催化的条件优化结果图；a，菌体浓度对合成neu5ac的影响；b，丙酮酸浓度对合成neu5ac的影响；c，转化液起始ph对合成neu5ac的影响；
d，表面活性剂添加量对合成neu5ac的影响；e，温度对合成neu5ac的影响。
22.图4在5l发酵罐中重组e.coli全细胞催化合成neu5ac图。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
24.实施例1：n-乙酰葡萄糖胺发酵液的制备
25.从平板挑取生产n-乙酰葡萄糖胺重组大肠杆菌菌株(e.coli-glms-gna1-δnage，e.coli7107-18、或mg:ec glm s-gnal，本实施例以e.coli-glms-gna1-δnage为例)单菌落接种至装有含有100μg/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基的三角瓶中，置于32℃摇床中，200rpm培养12h，得到一级种子液。将培养好的一级种子以1％的接种量转接到含有100μg/ml氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，34℃，200rpm培养6h至od
600
＝2.5～3.3得到二级种子液。二级种子液以16％的接种量接入装液量为2.5l的5l发酵罐中，发酵培养基：葡萄糖10g/l，硫酸铵6.17g/l，磷酸二氢钾7g/l，磷酸氢二钠7g/l，柠檬酸2g/l，七水硫酸镁3g/l；微量元素：氯化钙
·
2h2o 60mg/l，硫酸锰
·
h2o 10mg/l，硫酸锌
·
7h2o 3mg/l，硫酸亚铁
·
7h2o50mg/l，三氯化铝
·
6h2o 5mg/l，钼酸钠
·
2h2o 3mg/l，氯化钴
·
6h2o 0.1mg/l，硫酸铜
·
5h2o0.1mg/l,硼酸0.5mg/l；lb培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l。初始发酵温度为34℃，葡萄糖的添加量为10g/l，发酵过程中待初始糖浓度低于2g/l时，手动补加浓度为700g/l的葡萄糖控制残糖在2～5g/l，当od
600
达到55后，提温至37℃，控制残糖在0.2～0.5g/l，发酵过程中通过自动补加氨水调节ph为6.9，关联转速从200到850rpm，调节溶氧在10％～30％，当发酵45h时，菌体浓度od
600
达到135，glcnac产量达到61g/l(图1)。
26.实施例2：以glcnac发酵液为底物进行全细胞催化
27.将-80℃甘油管保存的大肠杆菌e.coliδnte/pet28a-(t7-shnal)-(tac-slr)在卡那霉素(50μg/ml)抗性lb固体平板上划线，挑取单菌落接种到20ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，200r/min培养10h得到种子液。将培养的种子液以体积百分比为1％的接种量转接至至lb培养基中，在37℃摇床中继续培养至od
600
约为0.6～0.8时，加入1mmol/l异丙基-β-d-硫代半乳糖苷于28℃培养8h诱导重组蛋白表达，诱导结束后，离心收集菌体，用ph7.5，100mmol/l tris-hcl缓冲液洗涤2次并收集菌体，获得全细胞催化剂。
28.将实施例1获得的发酵液经过离心除去菌体，得到含n-乙酰葡萄糖胺的发酵上清液。控制n-乙酰葡萄糖胺发酵上清液终浓度为0.28mol/l，添加终浓度0.74mol/l丙酮酸钠和按体积计0.2％tritonx-100，添加e.coliδnte/pet28a-(t7-shnal)-(tac-slr)菌体，获得全细胞催化剂全细胞菌体催化剂使其终浓度od
600
＝30，进行全细胞转化，转化温度为30℃，转化时间为30-40h，转化过程中用naoh调节反应体系ph为7.5。结果如图2所示，当反应36h时，neu5ac产量达到44.5mmol/l，转化率为16.18％，继续延长反应时间至50h后，产物会发生降解。
29.实施例3：以glcnac发酵液为底物在不同条件下进行全细胞催化
30.按照实施例2的方法制备含n-乙酰葡萄糖胺的发酵上清液，在含有一定浓度glcnac、丙酮酸、tritonx-100的不同ph的转化液中进行全细胞催化，反应进行36h。
31.(1)在不同菌体浓度od
600
下进行全细胞催化
32.向含0.28mol/lglcnac的发酵液、0.74mol/l丙酮酸，0.2％triton x-100的反应体系中加入全细胞催化剂，分别控制细胞催化剂在反应体系中的菌体浓度od
600
为(10、20、30、40、50)，转化液初始ph为7.5，结果显示，菌体浓度od
600
为10～50时，neu5ac产量为30～43mmol/l；菌体浓度od
600
为30时，neu5ac可达到42.8mmol/l，转化率为15.57％。
33.(2)在不同丙酮酸浓度下进行全细胞催化
34.向含0.28mol/lglcnac的发酵液、0.2％triton x-100的反应体系中加入菌体浓度od
600
为30的全细胞催化剂，分别控制丙酮酸浓度为0.83mol/l、1.10mol/l、1.38mol/l、1.65mol/l、1.93mol/l、2.20mol/l，使glcnac与丙酮酸的比例分别为1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8，转化液初始ph为7.5，考察不同丙酮酸浓度对合成neu5ac的影响，结果显示，丙酮酸浓度为0.83～2.20mol/l时，neu5ac产量为45～80mmol/l，丙酮酸浓度为1.65mol/l时，产量为75.9mmol/l，转化率提高到27.6％；
35.(3)在不同初始ph下进行全细胞催化
36.向含0.28mol/lglcnac的发酵液、1.65mol/l丙酮酸，0.2％triton x-100的反应体系中加入菌体浓度od
600
为30的全细胞催化剂，调节转化液初始ph分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0进行全细胞催化，考察转化液初始ph对合成neu5ac的影响，结果显示，ph为6～8时neu5ac产量为87～98mmol/l，ph为6.5时，产量为97.16mmol/l，转化率为35.33％。
37.(4)在不同tritonx-100添加量下进行全细胞催化
38.向含0.28mol/lglcnac的发酵液、1.65mol/l丙酮酸的反应体系中加入菌体浓度od
600
为30的全细胞催化剂，转化液初始ph为7.5，控制tritonx-100的添加量分别为(按体积百分比计)0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％的条件下进行全细胞转化，考察不同triton x-100对合成neu5ac的影响，结果显示，tritonx-100添加量≤0.8％时neu5ac产量为96～103mmol/l，tritonx-100添加量为0.4％时，neu5ac产量可达102.5mmol/l，转化率为37.3％。
39.(5)在不同温度下进行全细胞催化
40.向含0.28mol/lglcnac的发酵液、1.65mol/l丙酮酸，0.2％triton x-100的反应体系中加入菌体浓度od
600
为30的全细胞催化剂，转化液初始ph为7.5，分别在20℃、30℃、37℃、40℃、50℃下进行全细胞催化反应，考察温度对合成neu5ac的影响，结果显示，温度为30～37℃时neu5ac产量为86～101mmol/l；温度为30℃时产量最高，为103.4mmol/l，转化率为37.6％。
41.实施例4：正交试验优化全细胞催化生产neu5ac条件
42.选择菌体浓度、丙酮酸浓度、表面活性剂添加量三个因素进行三因素三水平正交试验，采用此条件进行全细胞催化试验，各因素水平安排如表1所示
43.表1因素水平表
[0044][0045]
以转化液中neu5ac的含量为指标，采用l9(34)正交表进行试验，正交试验结果如表2所示。
[0046]
表2交试验结果表
[0047][0048][0049]
菌体浓度对neu5ac产量的影响最大，其次为表面活性剂的添加量，丙酮酸浓度对产量影响最小，三因素的最佳组合为a2b1c3，即菌体浓度od
600
为30，丙酮酸浓度为1.38mol/l，表面活性剂添加量为0.4％。
[0050]
控制菌体浓度od
600
为30，glcnac浓度为0.28mol/l，丙酮酸浓度为1.38mol/l，表面活性剂添加量为0.4％，反应48h后，neu5ac产量为(141
±
3)mmol/l，转化率为(51.27
±
1.09)％。该工艺可行性好，为后续的生产工艺研究提供了一定的依据。
[0051]
在5l发酵罐中，催化条件为：反应温度为30℃，初始ph为6.5，glcnac浓度为0.28mol/l，丙酮酸浓度为1.38mol/l，tritonx-100添加量为0.4％，菌体od
600
为30，进行全细胞转化，液相检测转化液中各组分含量情况。结果如图4所示，反应70h时，neu5ac产量可达180mmol/l，转化率为65.45％，比优化前(实施例2)提高了49.27％。
[0052]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。