一种酿酒酵母及其制备化妆品用糙米发酵滤液的应用的制作方法

1.本发明涉及一种新的酿酒酵母，具体还涉及该酿酒酵母在制备发酵产品尤其是糙米发酵产品——糙米发酵滤液中的应用，还涉及该糙米发酵滤液的具体制备方法以及该糙米发酵滤液在化妆品中的应用，属于微生物发酵和化妆品技术领域。


背景技术：

2.糙米是稻谷脱去外保护皮层稻壳后的颖果，内保护皮层（果皮、种皮、珠心层）完好的稻米籽粒，富含谷维素、稻糠甾醇、原花青素等活性成分，性质温和安全，在护肤方面具有良好的美白淡斑、滋润补水、嫩肤抗衰的功效。
3.酵母菌是一种单细胞真核生物，护肤用的酵母提取物大多数都来源于安全可食用的酿酒酵母。酵母菌细胞内含有或代谢排到体外大量营养物质，如氨基酸、维生素、多糖等，能够促进肌肤的新陈代谢，加快自我修复，改善肌肤的光泽度和屏障功能，经常被添加在化妆水或精华肌底液中，还有提升肌肤吸收能力的作用。
4.精华水介于普通清洁化妆水和精华之间，是对某类水质化妆护肤产品的一种特定诠释，表明该类产品为液体状、更为高效，因此才会定名为“精华水”。精华水一般含有舒缓肌肤、补水保湿的功效型成分，主要是激活肌肤细胞，让肌肤在清洁后得到舒缓，恢复润泽状态，帮助吸收后续保养品。
5.近年来将糙米与酵母菌结合应用于护肤品方面的研究也不少，但大多数都没有固定特定的酵母菌用于糙米发酵。如中国专利cn108324633b公开了“一种化妆品用糙米发酵原液的制备方法及其产品”，其提供了一种化妆品用糙米发酵原液的制备方法，将糙米催芽后粉碎为糙米粉，然后将其制为米浆，将其酶解后再加入酵母菌发酵，发酵液除杂除菌后得到成品，但是该产品含有较高浓度的酒精，为避免对皮肤的刺激，只能作为一种活性成分少量添加到配方中，无法直接涂抹使用。中国专利cn111321043a公开了“一种低酒精含量糙米发酵液制备方法及其产品”，其提供了一种低酒精含量糙米发酵原液的制备方法：将酵母细胞接种于含糙米糖化液的培养液中，搅拌条件下，先正压发酵，再负压发酵至终点，获得发酵液；发酵液除杂获得糙米发酵原液，该原液可直接作为溶剂应用于精华液等护肤品配方中，无需额外添加任何纯化水等溶剂。但是不同菌种的代谢途径和代谢产物是有所差别的，因此使用不同的菌种发酵后活性成分的含量可能差别较大。中国专利cn113797138a公开了“一种黄米酒发酵物的制备方法及其应用”，其将大米熟化制成米饭，按照每100kg大米中加入280～400g黄酒酵母，在28～30℃发酵48～60h，然后装入坛罐醅中，在28～30℃下发酵3～5天，发酵结束后过滤，得到的提取液含有胞外多糖、蛋白、氨基酸、维生素、变性淀粉等，可降低皮肤过敏和敏感度，具有综合的调理营养作用，促进营养物质渗透，具有非常明显的保湿、吸附油脂、收缩毛孔的作用，开拓了黄酒米发酵物的新用途，但是涉及两步发酵和固体发酵，产量较低，且对发酵产物中的具体成分没有进行分析，同样也没有固定具体的发酵菌种。
6.综上所述，不同酵母菌的发酵状态、代谢产物等等肯定有所差异，因此筛选出一株
发酵性能优良的酵母菌是十分有必要的，而且酵母菌发酵后氨基酸、γ-氨基丁酸等成分比较丰富，发酵结束后通过菌体破碎使其胞内物质充分释放出来，十分具有生产化妆品的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种新型的发酵性能优异的酿酒酵母，该酿酒酵母具有较好的活性，使用其对糙米进行发酵得到的发酵产品具有很好的抗氧化、舒缓、保湿、美白、修复等功效，在化妆品中具有很好的应用前景。
8.本发明从酒糟中自行筛选得到了一株性能优异的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），该酿酒酵母命名酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37，该酿酒酵母为发明人自行筛选得到，已于2022年2月21日在中国典型培养物保藏中心（简称cctcc）进行保藏，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 2022135。该酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37的26s dna基因序列如seq id no：1所示。
9.进一步的，本发明还提供了一种菌剂，该菌剂中包含上述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37。该菌剂中可以仅含有酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37这一种微生物，也可以含有其他的微生物。
10.进一步的，所述菌剂既可以为固体制剂，也可以为液体制剂。
11.本发明还提供了上述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37或者上述菌剂在制备发酵产品中的应用。该应用中，一般是将酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37或者上述菌剂加入培养基中进行发酵，得到发酵产品。
12.在现有技术中公开了酿酒酵母在多种领域的发酵用途，本发明酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37在这些现有公开的领域中均可以使用，用于替换现有的酿酒酵母得到发酵产物。
13.优选的，本发明酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37或者上述菌剂用于发酵制备糙米发酵产品，所述糙米发酵产品是指含有糙米的培养基接种酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37或者上述菌剂发酵得到的发酵产物，也可称之为糙米发酵滤液。
14.进一步的，采用本发明酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37或者上述菌剂发酵糙米时，除了将发酵所用的菌种换成本发明新研发的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37，其他步骤和工艺参数可以借鉴现有技术中报道的采用酵母菌发酵制备糙米发酵产品的方法，例如可以采用专利cn111321043a、cn108324633b、cn110013027a、cn112890058a等中的方法来发酵糙米，糙米可以与其他米类、水果类等混合作为原料，也可以作为单一的原料，发酵得到的产物可以用于化妆品、食品等领域。
15.优选的，本发明提供了一种糙米发酵滤液的制备方法，该方法包括采用上述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37对糙米进行发酵的步骤。该方法中，除了发酵用的菌种为本发明酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37外，其它的步骤和工艺参数可以借鉴现有技术中报道的可以用于化妆品领域的糙米发酵产品的制备方法，例如cn108324633a、cn111321043a中的方法。
16.在本发明某一具体实施方式中，糙米发酵滤液的制备方法为：将糙米粉碎、酶解，
得到糙米粉酶解液，将糙米粉酶解液与发酵所需的其他成分混合，配成培养基，将酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37接种到含糙米粉酶解液的培养基中进行发酵，发酵结束后，将菌体破碎，使菌体胞内物质充分释放，然后离心、分离，取上清液，得糙米发酵滤液。其中，酶解所用的酶为α-淀粉酶和α-糖化酶，发酵所需的其他成分包括氮源、碳源、无机盐、维生素及其衍生物中的至少一种，这些成分可以从常用的培养基成分中进行选择，其用量可以根据实际情况进行调整。
17.进一步的，α-淀粉酶和α-糖化酶的质量比为1:1-2。糙米粉碎后与水混合，配成5-50g/l的分散液，然后加入酶液进行酶解。酶解温度为60-70℃，酶解ph为5.0-5.5，酶的加入量保证糙米中的成分充分转化为葡萄糖即可。
18.优选的，将α-淀粉酶和α-糖化酶分别配成酶液，α-淀粉酶酶液和α-糖化酶酶液的活力均为400-600u/ml，每升糙米粉分散液中加入0.1-0.5mlα-淀粉酶酶液、0.1-0.5mlα-糖化酶酶液。
19.进一步的，糙米粉酶解液主要作为培养基的碳源成分，其在培养基中的含量以糙米原料计为0.5-10g/l。
20.优选的，发酵培养基的成分为糙米粉酶解液、蛋白胨、酵母粉，其中糙米粉酶解液的含量以糙米原料计为3g/l，蛋白胨含量为5g/l，酵母粉含量为2.5g/l。
21.进一步的，酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37先进行种子培养，得到种子液，然后将种子液接种入培养基中进行发酵培养。发酵温度为25℃左右，发酵在搅拌状态下进行。
22.进一步的，种子培养的培养基成分为：蛋白胨15-25g/l，酵母粉5-15g/l，葡萄糖15-25g/l，其余为水，种子培养的温度为25℃左右，种子液在发酵培养基中的接入量为1-3 %（v/v）。
23.进一步的，菌体破碎可以采用现有技术中公开的方式进行，例如加热、酶解、均质、超声等方式。加热可以采用80-85℃左右的温度进行处理。
24.本发明酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37发酵得到的糙米发酵滤液中含有丰富的氨基酸、γ-氨基丁酸等成分，具有较好的抗氧化、舒缓、保湿、美白、修复功效，此外，可以通过采用现有技术中低酒精含量的发酵方法（例如cn111321043a）或者发酵结束后对发酵液进行加热的方式降低酒精的含量，从而实现发酵滤液中的低酒精含量，在化妆品中有很好的应用前景。因此，该糙米发酵滤液产品及其在制备化妆品中的应用也在本发明保护范围之内。
25.本发明还提供了一种化妆品，该化妆品包括上述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37发酵制备的糙米发酵滤液。根据糙米发酵滤液的成分，其在化妆品中可以作为保湿剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、抗炎剂、溶剂等成分。
26.进一步的，所述化妆品中还可以包括保湿剂、皮肤调理剂、抗氧化剂、抗炎剂、螯合剂和溶剂中的至少一种。
27.进一步的，所述保湿剂包括1,2-戊二醇、四氢甲基嘧啶羧酸、水解透明质酸钠、海藻糖、银耳子实体提取物、乙基己基甘油、γ-聚谷氨酸钠、甘油、丁二醇、鳄梨油、角鲨烷、甜菜碱中的至少一种；所述皮肤调理剂包括二裂酵母发酵产物溶胞物、四氢甲基嘧啶羧酸、水解透明质
酸钠、海藻糖、银耳子实体提取物、欧洲越桔叶提取物、鳄梨油、牛油果树果脂、肌酸、人参根提取物中的至少一种；所述抗氧化剂包括二裂酵母发酵产物溶胞物、四氢甲基嘧啶羧酸、石榴果皮提取物、银耳子实体提取物、肌肽、黄芩根提取物、人参根提取物、长角豆籽提取物中的至少一种；所述抗炎剂包括甘草酸二钾、尿囊素、柑橘果皮提取物中的至少一种；所述螯合剂包括edta二钠、柠檬酸、柠檬酸钠、肌醇六磷酸、肌醇六磷酸钠中的至少一种；所述溶剂包括甲基丙二醇、己二醇、丁二醇、1,3-丙二醇中的至少一种。
28.进一步的，上述各成分的用量按照实际情况进行调整。
29.在本发明某一具体实施方式中，提供了一种化妆品，其包括以下重量份的成分： 1,2-戊二醇1-10份、水解透明质酸钠0.05-0.5份、银耳子实体提取物0.01-0.1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、四氢甲基嘧啶羧酸0.01-2份、海藻糖0.1-5份、二裂酵母发酵产物溶胞物0.1-5份、石榴皮提取物0.1-1份、甘草酸二钾0.05-0.5份、edta二钠0.01-1份、糙米发酵滤液64.8-97.56份、甲基丙二醇1-10份。其中，1,2-戊二醇、水解透明质酸钠、银耳子实体提取物、乙基己基甘油作为保湿剂，四氢甲基嘧啶羧酸、海藻糖作为皮肤调理剂，二裂酵母发酵产物溶胞物、石榴皮提取物作为抗氧化剂，甘草酸二钾作为抗炎剂，edta二钠作为螯合剂，糙米发酵滤液、甲基丙二醇作为溶剂。
30.本发明具有以下优点：1、本发明自行筛选得到一株酿酒酵母cf-37，其对糙米进行恒温发酵后所得到的糙米发酵滤液具有较好的抗氧化、舒缓、保湿、美白、修复功效，在化妆品中有很好的应用前景。
31.2、本发明的糙米发酵滤液中除了发酵产物外，还在发酵结束后通过加热、酶解、超声、均质等方式使菌体破碎，将胞内物质充分释放到发酵液中，丰富了发酵滤液中的成分。
32.3、在发酵液通过加热等方式破碎菌体的过程中，还能挥发掉发酵液中的一部分酒精，减少了产品中酒精含量。
33.保藏信息本发明所述酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no: m2022135，保藏日期为2022年02月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编为430072。
附图说明
34.图1是酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37 cctcc no：m 2022135 的菌落形态特征的照片。
35.图2是酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37 cctcc no：m 2022135 菌体的显微照片。
36.图3是无水乙醇含量与峰面积标准曲线。
37.图4 斑马鱼胚胎尾巴面积减少抑制率，a、空白组，b、样品组。
38.图5 斑马鱼胚胎黑色素抑制率，a、空白组，b、样品组。
39.图6 斑马鱼胚胎尾鳍修复促进率，a、空白组，b、样品组。
40.图7 斑马鱼胚胎中性粒细胞抑制率，a、空白组，b、样品组。
具体实施方式
41.下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
42.除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
43.下述实施例中，所用的α-淀粉酶和α-糖化酶均为市购，α-淀粉酶和α-糖化酶分别配制成酶液，α-淀粉酶和α-糖化酶的酶液活力均为500u/ml。
44.实施例1 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37筛选及鉴定过程以酒糟为原料，将酒糟用100质量倍无菌水分散，用涂布器将各溶液均匀涂布在含0.1g/l氨苄青霉素钠的酵母菌固体培养基平板上，于25℃培养箱中静置培养1~2d，挑选菌落形态圆润光滑的单菌落，接种于酵母菌固体培养基试管斜面上，于25℃培养箱中静置培养1~2d，菌体长好后，于4℃冰箱保藏。其中，酵母菌固体培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，其余为水。
45.将筛选得到的菌种命名为cf-37，送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因组测序鉴定，结果显示菌种为酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）。 该菌株的26s rdna基因序列测定结果如seq id no：1所示。
46.该酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37的形态学特征如下：酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37在酵母菌固体培养基平板上菌落质地均匀，边缘整齐，乳白色，颜色均一，表面光滑、湿润，如图1所示；该菌体为单细胞，成卵圆形，形态简单，出芽生殖，如图2所示。
47.实施例2 糙米发酵滤液的制备（1）种子液的制备：用接种环从试管中挑取一环cf-37菌种，接入种子培养基中，25℃静置培养24h，得种子液；种子培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，其余为水。
48.（2）取3kg糙米，经粉碎、过100目筛，得到糙米粉；（3）将糙米粉加入到100l饮用水中混匀，调ph至5.5，然后加30mlα-淀粉酶酶液（500u/ml）和30mlα-糖化酶酶液（500u/ml），升温至65℃，每隔0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，得到糙米粉酶解液；（4）将糙米粉酶解液补充饮用水至1吨，并加入5kg蛋白胨、2.5kg酵母粉，升温灭菌，待发酵培养基冷却至室温时，将20l酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37种子液接种到含糙米粉酶解液的发酵培养基中，在25℃、50rpm搅拌条件下发酵至终点，获得发酵液；（5）发酵液升温至85℃加热1h，然后5000rpm离心10min，取上清液，经过0.22μm聚
醚砜滤芯过滤后获得糙米发酵滤液，即糙米发酵滤液s1。
49.实施例3 糙米发酵滤液的制备（1）种子液的制备：用接种环从试管中挑取一环cf-37菌种，接入种子培养基中，25℃静置培养24h，得种子液；种子培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，其余为水。
50.（2）取3kg糙米，经粉碎、过100目筛，得到糙米粉；（3）将糙米粉加入到100l饮用水中混匀，调ph至5.0，然后加40mlα-淀粉酶酶液（500u/ml）和40mlα-糖化酶酶液（500u/ml），升温至60℃，每隔0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，得到糙米粉酶解液；（4）将糙米酶解液补充饮用水至1吨，并加入5kg蛋白胨、2.5kg酵母粉，升温灭菌，待发酵培养基冷却至室温时，将20l酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37种子液接种到含糙米粉酶解液的发酵培养基中，在25℃、50rpm搅拌条件下发酵至终点，获得发酵液；（5）发酵液升温至80℃加热1h，然后5000rpm离心10min，取上清液，经过0.22μm聚醚砜滤芯过滤后获得糙米发酵滤液，即糙米发酵滤液s2。
51.实施例4糙米发酵滤液的制备（1）种子液的制备：用接种环从试管中挑取一环菌种，接入种子培养基中，25℃静置培养24h，得种子液；种子培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，其余为水；（2）取3kg糙米，经粉碎、过100目筛，得到糙米粉；（3）将糙米粉加入到100l饮用水混匀，调ph至5.5，然后加20mlα-淀粉酶酶液（500u/ml）和20mlα-糖化酶酶液（500u/ml），升温至70℃，每隔0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，得到糙米粉酶解液；（4）将糙米酶解液补充饮用水至1吨，并加入5kg蛋白胨、2.5kg酵母粉，升温灭菌，待发酵培养基冷却至室温时，将20l酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）cf-37种子液接种到含糙米粉酶解液的发酵培养基中，在25℃、50rpm搅拌条件下发酵至终点，获得发酵液；（5）发酵液使用均质机均质1h，升温至80℃加热1h，然后5000rpm离心10min，取上清液，经过0.22μm聚醚砜滤芯过滤后获得糙米发酵滤液，即糙米发酵滤液s3。
52.实施例5 糙米肌底精华水的制备以847kg糙米发酵滤液s1为主要溶剂，加入50kg 1,2-戊二醇、3kg水解透明质酸钠、0.5kg银耳子实体提取物、0.5kg乙基己基甘油、10kg四氢甲基嘧啶羧酸、20kg海藻糖、10kg二裂酵母发酵产物溶胞物、5kg石榴皮提取物、2kg甘草酸二钾、2kgedta二钠、50kg甲基丙二醇，搅拌充分溶解、混合均匀后，经过0.22μm聚醚砜滤芯过滤、无菌灌装后，得到糙米肌底精华水w1。
53.实施例6 糙米肌底精华水的制备以975.6kg糙米发酵滤液s1为主要溶剂，加入10kg 1,2-戊二醇、0.5kg水解透明质酸钠、0.1kg银耳子实体提取物、0.1kg乙基己基甘油、0.1kg四氢甲基嘧啶羧酸、1kg海藻糖、1kg二裂酵母发酵产物溶胞物、1kg石榴皮提取物、0.5kg甘草酸二钾、0.1kgedta二钠、10kg甲基丙二醇，搅拌充分溶解、混合均匀后，经过0.22μm聚醚砜滤芯过滤、无菌灌装后，得到糙米肌底精华水w2。
54.实施例7 糙米肌底精华水的制备
以648kg糙米发酵滤液s1为主要溶剂，加入100kg 1,2-戊二醇、5kg水解透明质酸钠、1kg银耳子实体提取物、1kg乙基己基甘油、20kg四氢甲基嘧啶羧酸、50kg海藻糖、50kg二裂酵母发酵产物溶胞物、10kg石榴皮提取物、5kg甘草酸二钾、10kgedta二钠、100kg甲基丙二醇，搅拌充分溶解、混合均匀后，经过0.22μm聚醚砜滤芯过滤、无菌灌装后，得到糙米肌底精华水w3。
55.对比例1将酿酒酵母cf-37换成购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc）编号为cgmcc no.2.3854的酿酒酵母，其余同实施例2，得到糙米发酵滤液c1。
56.对比例2将酿酒酵母cf-37换成保藏编号为cctcc no: m 20211621的酿酒酵母，其余同实施例2，得到糙米发酵滤液c2。
57.试验例1. 氨基酸含量测定以实施例2-4中样品s1、s2、s3与对比例中样品c1、c2为实验样品，进行氨基酸含量测定，采用氨基酸自动分析仪进行，结果如表1所示。
58.从表中可以看出，采用本发明cf-37菌种发酵得到的糙米发酵滤液s1、s2和s3中小分子氨基酸含量明显高于其他酵母菌发酵得到的样品c1和c2。
59.2.γ-氨基丁酸含量测定以实施例2-4中样品s1、s2和s3与对比例中样品c1、c2为实验样品，采用邻苯二甲醛柱前衍生法进行γ-氨基丁酸含量测定，hplc条件：色谱柱：hypersil ods c
18
，柱温：40℃；流动相：0.75%乙酸钠:乙腈（75:25），流速：1.0 ml/min，检测波长：338 nm；结果如表2所示。
60.由表2数据可知，不同菌种发酵后的γ-氨基丁酸的含量有所不同，样品s1、s2、s3中γ-氨基丁酸含量明显高于c1和c2中。
61.3.乙醇含量测定1）.仪器与试剂agilent 7890b气相色谱仪，配置fid检测器；agilent 7697a顶空进样器，配置10ml顶空瓶；无水乙醇：色谱纯2）. 色谱条件色谱柱：db-17（0.32mm
×
30m，膜厚0.50
µ
m）柱温：50℃保持2min，以10℃/min升至160℃，保持5min检测器：fid载气：n2进样口温度：180℃检测器温度：180℃载气流速：3ml/min顶空进样器条件：平衡温度：80℃平衡时间：30minloop温度：90℃transfer line温度：95℃加压时间：0.10min进样时间：0.5min。
62.3）. 溶液的配制空白溶液：取水2.0ml于10ml顶空瓶中，密封；对照品贮备溶液：精密称取无水乙醇0.10g于已加入少量水的100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含1mg乙醇的对照品贮备溶液；对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0ml于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成50-500μg/ml的系列对照品溶液。分别取对照品溶液各1.0ml于10ml顶空瓶中，加水1.0ml，混匀，密封；供试溶液：精密量取供试品s1-s3、c1、c2各0.5ml于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，精密量取上述溶液1ml于10ml顶空瓶中，加水1.0ml，混匀，密封。供试溶液平行制备两份。
63.4）. 测定分别取系列对照品溶液和供试品溶液置于顶空进样器中，按上述“2.色谱条件”中的顶空条件进样，以无水乙醇加入量（μg）对峰面积绘制标准曲线如图3所示，以外标法计算
供试品溶液中的乙醇含量。
64.5）. 检测结果由表3数据可知，不同菌种发酵后的乙醇的含量略有不同，但乙醇含量都比较低，应该是发酵液加热等方式降低了糙米发酵滤液中的乙醇含量。
65.4.清除dpph自由基试验0.1mm dpph溶液配制：精密称取4.0mg dpph置100ml棕色容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容。
66.不同浓度样品溶液配制：以纯化水作为稀释液，分别将实施例中的样品s1-s3及对比例中的样品c1、c2配制成体积浓度为1~5％的溶液。
67.分别精密量取0.1mm dpph溶液5.0ml和不同浓度样品溶液5.0ml置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取dpph溶液5.0ml和纯化水5.0ml混合，操作同上。计算方法如下：结果如表4所示，从表中结果可以看出，使用cf-37发酵后得到的糙米发酵滤液其抗氧化性明显高于其他菌种发酵得到的糙米发酵滤液。
68.5.糙米发酵滤液功效测试检测机构：水中银（国际）生物科技有限公司空白组：不加样品的试验组；样品组：加样品s1的试验组；样品组和空白组斑马鱼胚胎尾巴面积减少抑制率实验、斑马鱼胚胎黑色素抑制率实验、斑马鱼胚胎尾鳍修复促进率实验、斑马鱼胚胎中性粒细胞抑制率实验结果如图4-7所
述，具体数据如表5所示。从表5中结果可以看出，糙米发酵滤液具有显著的保湿、提亮、促进修复和舒缓的功效。
69.6.糙米肌底精华水功效测试检测机构：上海复硕正态信息技术有限公司实验样品：实施例5的糙米肌底精华水w1，空白样品：除了将糙米发酵滤液替换成纯化水外，其他同实施例5。
70.实验方法：全脸使用面霜，采用自身对照，半脸使用实验样品，另一半脸使用空白样品。
71.客观仪器无创测量：皮肤水分含量corneometer
®
cm825、经皮水分流失vapometer、皮肤油脂含量sebumeter，将各组数据进行统一，计算平均值。
72.研究人群：共筛选入组34名年龄为20-35周岁健康女性受试者，最终有34名受试者完成了整个测试。
73.受试者主要入组标准：（1）年龄20-35周岁中国女性；（2）混合型肌肤，脸颊干，额头油。
74.从表6中结果可以看出，采用本发明制备得到的糙米肌底精华水无论是短期的补水、保湿和控油，还是长期的试验，都具有显著的效果。