小鼠类气道培养方法

1.本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及小鼠类气道培养方法。


背景技术：

2.目前，永生化的细胞系和来源于哺乳动物供体的原代细胞可用于呼吸系统的疾病建模，但浸没式—单层贴壁培养环境下细胞的形态特征、生长方式、生理功能等与体内真实环境下存在明显差异，生理相关性不强。对于原代肺上皮干细胞，浸没式贴壁培养无法诱导粘液纤毛表型分化，因此传统的细胞培养方法并不适用于原代肺上皮干细胞的体外研究。
3.为了重现体内的粘液纤毛表型，必须在2d-气液界面（air liquid interface, ali）上培养原代肺上皮干细胞。2d-ali培养模型的主要特征是原代细胞的基底表面与下层液体培养基接触，而顶端表面则直接暴露于空气中。常见的接种方法为将细胞以适当密度接种于transwell小室的上室，上/下室由孔径为0.4μm的可渗透膜相隔。在细胞培养初期，上/下室都需加入扩增培养基，待细胞扩增铺满上室底面后吸尽上室及下室培养基，只于下室加入分化培养基，由此形成了细胞基底面接触下室培养基而顶端面暴露于空气的2d-ali培养系统。ali诱导分化完成后，可见细胞堆叠生长、纤毛节律摆动、表面粘液分布及紧密连接，这些表型均与原生呼吸道上皮高度相似。该系统模拟了在体呼吸道的生理特点、形态特征及屏障功能和特定的细胞生物学行为，可高效诱导粘液纤毛表型分化，明显缩短了体外培养与活体组织间的差距。
4.2d-ali培养系统适用于疾病建模，药物筛选及吸入毒理学等一系列研究。对来自于某些呼吸系统疾病（如哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺疾病等）供体的原代细胞进行2d-ali培养，可体外再现相关疾病的生理特征，探索其致病机制。此外，药物、悬浮颗粒可直接加入顶端细胞表面以模拟气道吸入过程，为相关药物有效性和吸入物毒性的研究提供了绝佳的平台。
5.目前，体外ali培养主要来自于原代人气道上皮细胞，人源性样本数量有限，培养过程易受到诸多伦理限制；此外，原代人气道上皮细胞分离、纯化步骤复杂、耗时且成本较高，大大限制了2d-ali培养系统在基础和临床研究中的应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种小鼠类气道培养方法。
7.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：一种小鼠类气道培养方法，包括：将小鼠肺球体利用细胞消化酶解离，解离的肺球体利用肺上皮干细胞扩增培养基重悬；将获取的细胞悬液加入transwell小室的上室，下室加入肺上皮干细胞扩增培养基；将transwell小室转移至二氧化碳细胞培养箱培养，在细胞铺满上室底面后吸尽
上室及下室的培养基，之后在下室加入气液界面分化培养基；将transwell小室放置于二氧化碳细胞培养箱继续培养，待小鼠肺上皮干细胞分化为类气道。
8.作为一种优选的实施方式，所述小鼠肺球体的制备方式如下：a. 取小鼠肺叶组织块，置于预热的胶原酶消化溶液中消化；b. 加入等量的含fbs的dmem/f12培养基终止消化，吹打混匀后细胞筛过滤；过滤液离心后弃除上清；c. 加入红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温孵育后加入dmem/f12培养基混匀，离心后弃除上清；d. 重复步骤c直至细胞沉淀变白；e. 加入dna酶溶液重悬细胞沉淀，加入dmem/f12培养基混匀，离心后弃除上清；f. 加入dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，细胞筛过滤，离心后弃除上清；g. 加入肺球体培养基重悬，调整细胞密度后悬浮培养。
9.作为一种优选的实施方式，收集培养12-15天后的肺球体，利用细胞消化酶解离。此时期的肺球体中所含肺上皮干细胞数量较多且保持未分化状态，特别适合下一阶段的气液界面分化培养；同时，此时期的肺球体较易完全解离为单个肺上皮干细胞。
10.作为一种优选的实施方式，所述细胞消化酶选用tryple细胞消化酶。前期小鼠肺组织原代上皮干细胞球培养方法稳定、可靠、成熟，经tryple细胞消化酶解离可高效得到单个肺上皮干细胞，此外， tryple细胞消化酶不含动物及人来源成分，可于室温下稳定存储，解离时间短、作用温和（可最大程度保持肺上皮干细胞的增殖、分化活性），且无需使用胰蛋白酶抑制剂来灭活。
11.作为一种优选的实施方式，将小鼠肺球体利用细胞消化酶解离后采用40μm细胞筛过滤去除未充分消化的细胞团块。在保证去除细胞团块的同时，尽可能收集得到所有解离的单个肺上皮干细胞。
12.作为一种优选的实施方式，细胞悬液中细胞密度根据transwell小室的上室生长面积调整，使细胞于12-24小时之内贴壁。本技术中transwell小室的上室生长面积为1.12cm2，调整细胞悬液密度为2
×
105ꢀ‑ꢀ3×
105/ml，可保证细胞于12-24小时之内贴壁，细胞密度过高可形成细胞团块，延长细胞贴壁时间且导致贴壁不均匀；细胞密度过低可影响细胞活性和细胞间通讯，后续扩增阶段所需时间更长。
13.作为一种优选的实施方式，所述肺上皮干细胞扩增培养基为添加氢化可的松溶液、青霉素溶液、链霉素溶液、egf的pneumacult
tm-ex plus培养基。
14.作为一种优选的实施方式，所述肺上皮干细胞扩增培养基为添加氢化可的松溶液、青霉素溶液、链霉素溶液、肝素、egf的pneumacult
tm-ali培养基。商品化的pneumacult
tm-ex plus和pneumacult
tm-ali培养基目前主要用于人原代支气管上皮细胞的培养，本技术通过培养基配方改良使之更适合用于小鼠肺上皮干细胞的气液界面分化培养，改良的培养基除egf之外不需要额外添加其他多种细胞因子或组分，不同批次培养基之间差异性较小，可优化培养流程、降低研究人员的技术操作难度，保证实验结果的稳定性和可重复性；且两种培养基均不含牛脑垂体提取物或胎牛血清，特别适合用于肺上皮干细胞的培养。
15.作为一种优选的实施方式，首次将transwell小室转移至二氧化碳细胞培养箱培养时，每两天更换上室及下室培养基。
16.作为一种优选的实施方式，类气道分化培养过程中，每两天更换下室培养基。
17.本发明依托于前期小鼠肺组织原代上皮干细胞球的培养方法（cn111534477a），以transwell细胞培养小室为渗透膜，通过2d-ali培养模型建立了一种小鼠类气道的体外培养方法，成功制备出具有不同类型上皮细胞簇的类气道培养物，并在形态学、功能学及表型上进行了验证。小鼠体外类气道的建立为哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺疾病等疾病建模、药物筛选以及相关颗粒物吸入毒理学的研究提供了强大的技术支撑和应用平台。
18.本发明具有如下有益效果：（1）使用小鼠来源的原代肺上皮干细胞进行2d-ali培养，相较于人源性样本，组织来源充足、稳定、可靠，伦理限制较少；同时，小鼠原代肺上皮干细胞分离、纯化步骤简便、易于操作，培养周期短、成本低。此外，常规通过气液界面分化培养实现体外类气道培养主要是利用人原代支气管上皮细胞，而原代肺上皮干细胞相比支气管上皮细胞具有更强的增殖及分化能力，在后续气液界面诱导分化过程中形成体外类气道的效率更高、表型更典型、代表性更强。
19.（2）肺上皮干细胞扩增培养基和气液界面分化培养基不含牛脑垂体提取物或胎牛血清，培养条件均一可控，小鼠类气道培养物可更好地保持遗传稳定性和生理功能。
20.（3）小鼠类气道培养过程中只需定期更换培养基，无需在特定时间添加额外细胞因子或其他组分，显著降低了研究人员的技术操作难度。
21.（4）类气道分化过程可精确操控培养基的成分，特别适合于研究相关因子、不同时期及微环境对肺上皮干细胞功能的调控作用。
附图说明
22.图1是小鼠类气道免疫荧光染色的3d重建结果。
23.图2是小鼠类气道z轴石蜡切片的h&e和pas染色结果。
24.图3是小鼠类气道形态结构的扫描电镜观察结果。
25.图4是小鼠类气道纤毛内部结构的透射电镜观察结果。
26.图5是小鼠类气道表层扫描电镜和zo-1免疫荧光染色结果。
具体实施方式
27.实施例使用的主要材料及来源如下：transwell细胞培养小室：美国康宁（corning）公司，货号3460。
28.tryple细胞消化酶：赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号12604021。
29.肺上皮干细胞扩增培养基：[添加0.096 μg/ml 氢化可的松溶液，100 u/ml 青霉素溶液，100 μg/ml 链霉素溶液，20 ng/ml egf的pneumacult
tm-ex plus培养基]：氢化可的松溶液：加拿大stemcell有限公司，货号07925；青霉素、链霉素溶液：美国sciencell有限公司，货号0503；egf：美国peprotech有限公司，货号315-09；pneumacult
tm-ex plus培养基：加拿大stemcell有限公司，货号05040。
[0030]
气液界面分化培养基：[添加0.48 μg/ml 氢化可的松溶液，100 u/ml 青霉素溶
液，100 μg/ml 链霉素溶液，4 μg/ml 肝素，20 ng/ml egf的pneumacult
tm-ali培养基]：氢化可的松溶液：加拿大stemcell有限公司，货号07925；青霉素、链霉素溶液：美国sciencell有限公司，货号0503；肝素：美国apexbio有限公司，货号b3602；egf：美国peprotech有限公司，货号315-09；pneumacult
tm-ali培养基：加拿大stemcell有限公司，货号05001。
[0031]
实施例1首先采用cn111534477a所示方法培养出小鼠肺组织原代上皮干细胞球（即下述步骤1~步骤10）。
[0032]
（1）将小鼠用75%酒精彻底消毒皮肤，无菌分离肺组织并置于预冷的无菌pbs（磷酸盐缓冲溶液）中漂洗，清除结缔组织及肺内主支气管，同时分离肺叶，清洗2-3次去血。
[0033]
（2）无菌镊子转移清洗后的肺叶于新的细胞培养皿中，吸除残留的pbs，用眼科手术剪将肺组织均匀剪成约1mm3的组织块，转移至预热的胶原酶消化溶液中，37℃恒温摇床（100转/分钟）消化45-60分钟；（3）加入等量的含有10%fbs的dmem/f12培养基终止消化，吹打混匀后100μm细胞筛过滤；过滤液4℃ 700-900g 离心10分钟，弃上清；（4）加入2-3ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温孵育1-2分钟，加入6ml dmem/f12培养基混匀，4℃ 700-900g 离心10分钟，弃上清；（5）重复步骤（4）1-2次直至细胞沉淀变白；（6）加入4ml dna酶溶液（20u/ml）重悬细胞沉淀，室温手摇3-5分钟，加入6ml dmem/f12培养基混匀，4℃ 700-900g 离心10分钟，弃上清；（7）加入6ml dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，充分吹打混匀，40μm细胞筛过滤，4℃ 700-900g 离心10分钟，弃上清；（8）肺球体培养基重悬，调整细胞密度为2
×
10
6 ‑ꢀ3×
106/ml；（9）置于poly-hema包被的t25细胞培养瓶中培养，3-5ml肺球体培养基/瓶；（10）转移至二氧化碳细胞培养箱（37℃，5%co2），每三天更换培养基；（11）培养12-15天后收集肺球体，4℃ 200-300g 离心5-10分钟，弃上清；（12）加入5ml dmem/f12培养基重悬肺球体，4℃ 200-300g 离心5-10分钟，弃上清；（13）重复步骤（12）1-2次；（14）加入5mltryple细胞消化酶解离肺球体，37℃孵育5-10分钟；（15）40μm细胞筛过滤去除未充分消化的细胞团块，4℃ 200-300g 离心5-10分钟，弃上清；（16）肺上皮干细胞扩增培养基重悬，调整细胞密度为2
×
105ꢀ‑ꢀ3×
105/ml；（17）transwell小室的上室加入0.5ml细胞悬液，下室加入1ml肺上皮干细胞扩增培养基；（18）转移至二氧化碳细胞培养箱（37℃，5%co2），每两天更换上室及下室培养基；（19）细胞铺满上室底面后吸尽上室及下室培养基，只于下室加入1ml气液界面分化培养基；（20）转移至二氧化碳细胞培养箱（37℃，5%co2），每两天更换下室培养基，动态观察小鼠肺上皮干细胞分化及类气道形成、形态变化。
[0034]
图1分化成熟的小鼠类气道具有不同类型的上皮细胞簇分布：纤毛细胞（act
+
），杯状细胞（muc5ac
+
），基底细胞（ngfr
+
）。
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图2小鼠类气道z轴切面的组织学染色示纤毛细胞（h&e染色，左）和杯状细胞分泌的粘液（pas染色，右）。
[0036]
图3扫描电镜观察小鼠类气道培养物层次结构及表面纤毛形态、粘液分布：transwell渗透膜（t），纤毛（c），粘液（m）。
[0037]
图4透射电镜观察小鼠类气道培养物表层纤毛的内部结构：纤毛根部的基体（左）和“9*2+2”的微管结构（右）。
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图5扫描电镜观察小鼠类气道表层紧密连接和屏障（左），并经zo-1免疫荧光染色证实（右）。
[0039]
通过实施例的方法诱导分化培养28天后形成的类气道，具有明显的类似体内气道的假复层柱状上皮结构，并可观察到纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞及细胞之间的紧密连接。相较于常规的人原代支气管上皮细胞的体外气液界面分化培养，本实施例得到的类气道分化效率更高、形态层次更鲜明、表型更典型、代表性更强、稳定性更好。