一种植物乳杆菌微胶囊及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌微胶囊及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物乳杆菌常分布于各种发酵食品中，如蔬果、肉类、乳制品及葡萄酒等，同时也是人体肠道正常菌群成员，对人体健康具有促进作用。大量研究表明，植物乳杆菌能够定植于人体肠道内，发挥调节免疫、调节肠道菌群平衡、缓解慢性代谢性疾病、降低胆固醇水平等多种健康功效。众所周知，益生菌发挥益生功效的前提之一是需在肠道内达到足够的定植数量。部分植物乳杆菌稳定性较差，进入消化道后难以忍受胃酸、消化酶、胆汁酸等作用，限制了其功效的发挥。近几年，益生菌的稳定性和生物利用率的提高已成为功能性食品研究中的主要关注点之一。
3.微胶囊技术是指以天然或人工合成的高分子材料作为壁材，将固体、液体或气体等包裹形成一种微小液滴或颗粒状态的技术，被包裹的物质在酸性条件下耐受性提高，而在适宜环境中能够释放出来发挥作用。近年来，关于微胶囊的相关研究主要集中于微胶囊对芯材的保护、粒径的控制以及微生物包埋率等方面，常用的制备方法有挤压法、乳化法等。但是，上述方法也存在一定程度的局限性，例如挤压法制备微胶囊粒径较大，乳化法则因搅拌速度剪切力较大，导致微胶囊形态不规则。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌微胶囊，通过复合壁材对植物乳杆菌菌株进行包埋，提高微胶囊的包埋率、植物乳杆菌菌株的人工胃液中的耐受性，及其肠溶性。
5.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种植物乳杆菌微胶囊，包括植物乳杆菌芯材和复合壁材，所述复合壁材包括大豆分离蛋白和海藻酸钠。
7.优选的，所述大豆分离蛋白的质量百分浓度为2％-5％，所述海藻酸钠的质量百分浓度为1％-4％。
8.优选的，所述大豆分离蛋白和海藻酸钠的体积比为4-1:1。
9.优选的，所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1，保藏号为cgmcc no.18692。
10.本发明提供了上述植物乳杆菌微胶囊的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
11.将植物乳杆菌菌株与上述复合壁材混合得到混合液体；
12.使用微胶囊造粒仪将所述混合液体滴加到cacl2溶液中，经造粒、固化、洗涤、干燥后即得所述植物乳杆菌微胶囊。
13.优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌菌悬液；所述菌悬液由活化后的植物乳杆
菌菌株与pbs混匀所得。
14.优选的，所述植物乳杆菌菌悬液和复合壁材的体积比为4-1:1-3。
15.优选的，所述微胶囊造粒仪的气压为300pa，振动频率为500hz。
16.本发明还提供了上述的微胶囊或由上述制备方法所制备的微胶囊在乳酸菌发酵剂中的应用。
17.优选的，所述微胶囊的添加量为乳酸菌发酵剂总重量的1-30％。
18.本发明提供了一种植物乳杆菌微胶囊，以海藻酸钠-大豆分离蛋白为复合壁材，经其包埋获得的微胶囊具有较好的耐酸性、肠溶性。同时，本发明微胶囊采用微胶囊造粒仪进行制备，在温和条件下即可将微生物包埋在聚合物基质中，形成颗粒均匀、粒径适中的微胶囊，包埋效果稳定高效；将微胶囊用于乳酸菌发酵剂中可改善乳酸菌发酵剂品质，大大提高乳酸菌在加工、贮藏、运输过程中的稳定性及作用，具有良好的应用前景。
附图说明
19.图1为植物乳杆菌微胶囊在扫描电镜下的微胶囊形态。
20.图2为植物乳杆菌单一壁材微胶囊在扫描电镜下的微胶囊形态。
21.图3为植物乳杆菌微胶囊在模拟胃液中处理不同时间的活菌存活情况，其中不同大写字母表示各时间点差异显著，不同小写字母表示同一时间点组内差异显著。
22.图4为不同处理微胶囊组在模拟胃液中的存活率，其中不同小写字母表示不同处理组微胶囊具有差异显著。
23.图5为植物乳杆菌微胶囊在模拟肠液中处理不同时间的崩解情况，其中不同小写字母表示各时间点差异显著。
24.图6为植物乳杆菌单一壁材微胶囊在模拟肠液中处理不同时间的崩解情况，其中不同小写字母表示各时间点差异显著。
具体实施方式
25.本发明提供了一种植物乳杆菌微胶囊，包括植物乳杆菌芯材和复合壁材，所述复合壁材包括大豆分离蛋白和海藻酸钠。
26.本发明中，所述大豆分离蛋白的质量百分浓度优选为2％-5％，更优选为3％，所述海藻酸钠的质量百分浓度优选为1％-4％，更优选为1.5％。所述大豆分离蛋白和海藻酸钠的体积比优选为4-1:1，更优选为1:1。本发明使用大豆分离蛋白和海藻酸钠作为复合壁材，能够对植物乳杆菌抗噬菌体菌株进行更好的包埋，提高微胶囊的耐酸性、肠溶性。
27.本发明中，所述植物乳杆菌菌株优选为植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1，该菌株已于2019年10月16日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为cgmcc no.18692。所述菌株公开于发明专利cn111548958b中。
28.本发明提供了上述植物乳杆菌菌株微胶囊的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
29.将植物乳杆菌菌株与上述复合壁材混合得到混合液体；
30.使用微胶囊造粒仪将所述混合液体滴加到cacl2溶液中，经造粒、固化、洗涤、干燥
后即得所述植物乳杆菌微胶囊。
31.本发明中，所述植物乳杆菌优选为植物乳杆菌菌悬液；所述菌悬液优选的由活化后的植物乳杆菌菌株与pbs混匀所得。本发明中，所述活化的步骤优选包括：将植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于活化培养基中，在37℃下培养20～24h，然后按照以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将活化一次的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于mrs液体培养基中，在37℃下培养20～24h，以同样方式传代培养2～3次，使其活菌数达到108cfu/ml以上。本发明所述活化培养基优选的由10％复原脱脂乳溶液在温度115℃下灭菌7min所得。
32.本发明中，所述植物乳杆菌菌悬液和复合壁材的体积比优选为4-1:1-3，更优选为1:1。本发明中，所述微胶囊造粒仪的参数优选为：喷嘴孔径300μm，气压300pa，振动频率500hz，电场300v。在本发明的具体实施例中，所述微胶囊造粒仪的型号优选为b-390，由瑞士buchi公司制造。本发明中，所述固化的时间优选为25-35min，更优选为30min。所述洗涤的试剂优选为pbs溶液，本发明所述洗涤后所得的湿态微胶囊在干燥前优选的置于-80℃的低温冰箱中预冻3h，所述预冻能够使微胶囊较好保持原有的结构。本发明中，所述干燥优选为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度优选为-40～-50℃，更优选为-46℃，所述真空冷冻干燥的真空度优选为8-15pa，更优选为10pa。本发明中，所述真空冷冻干燥能够使物料的化学组成和物理性质(如多孔结构、胶体性质等)较好地保存，且具有良好的复水性，能在短时间内恢复干燥前的状态。本发明采用微胶囊造粒仪，在温和条件下将微生物细胞包埋在聚合物基质中，形成颗粒均匀、粒径适中的微胶囊，提高了微胶囊的包埋效果。
33.本发明还提供了上述的微胶囊或由上述制备方法所制备的微胶囊在乳酸菌发酵剂中的应用。本发明中，所述微胶囊的添加量优选为乳酸菌发酵剂总重量的1-30％，更优选为乳酸菌发酵剂总重量的10-25％。本发明中，所述乳酸菌发酵剂优选的包括一种或多种选自嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌或双歧杆菌的乳酸菌发酵剂。本发明对所述微胶囊制备乳酸菌发酵剂的方法并没有特殊限定，优选的包括将所述微胶囊均匀地加到所述的乳酸菌发酵剂或制剂中，或者采用其它方式加到所述的乳酸菌发酵剂或制剂中。
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
35.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
36.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.实施例1
38.1.菌种活化
39.配置10％复原脱脂乳溶液，在温度115℃下灭菌7min，得到活化培养基；按照以活化培养基重量计2％的接种量，将在温度-80℃下冷冻保藏的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于上述的活化培养基中，在温度37℃下培养20h，然后按照以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将活化一次的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于mrs液体培养基中，在温度37℃下培养24h，以同样方式传代培养2次，使其活菌数达到108cfu/ml以上。
40.2.植物乳杆菌微胶囊的制备
41.将活化好的菌液4000rpm离心5min，收集菌体，pbs洗菌两次后，加入pbs振匀后作
为菌悬液；
42.配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，浓度为3％大豆分离蛋白溶液，按体积比1:1的比例混合制成混合溶液，将菌悬液和混合溶液按体积比1:1的比例混合，搅拌均匀后制成混合液体并倒入耐压瓶中，使用微胶囊造粒仪经高频振荡混合液体滴加到浓度为3％的cacl2溶液中，调整参数为喷嘴孔径300μm，气压300pa，振动频率500hz，电场300v，使液滴颗粒无连结且均匀，造粒结束后固化30min；2000rpm离心5min得到样品，用pbs洗涤两次，洗去微胶囊表面的cacl2残留液，制得成品微胶囊，将制得的湿态微胶囊放入-80℃的低温冰箱中预冻3h，置于-46℃、10pa真空冷冻干燥机中干燥，制得本发明所述植物乳杆菌微胶囊。
43.实施例2
44.1.菌种活化
45.配置10％复原脱脂乳溶液，在温度115℃下灭菌7min，得到活化培养基；按照以活化培养基重量计2％的接种量，将在温度-80℃下冷冻保藏的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于上述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将活化一次的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于mrs液体培养基中，在温度37℃下培养20h，以同样方式传代培养3次，使其活菌数达到108cfu/ml以上。
46.2.植物乳杆菌微胶囊的制备
47.将活化好的菌液4000rpm离心5min，收集菌体，pbs洗菌两次后，加入pbs振匀后作为菌悬液；
48.配制浓度为2％的海藻酸钠溶液，浓度为1％大豆分离蛋白溶液，按体积比1:4的比例混合制成混合溶液，将菌悬液和混合溶液按体积比1:1的比例混合，搅拌均匀后制成混合液体并倒入耐压瓶中，使用微胶囊造粒仪经高频振荡混合液体滴加到浓度为3％的cacl2溶液中，调整参数为喷嘴孔径300μm，气压300pa，振动频率500hz，电场300v，使液滴颗粒无连结且均匀，造粒结束后固化30min；2000rpm离心5min得到样品，用pbs洗涤两次，洗去微胶囊表面的cacl2残留液，制得成品微胶囊，将制得的湿态微胶囊放入-80℃的低温冰箱中预冻3h，置于-40℃、15pa真空冷冻干燥机中干燥，制得本发明所述植物乳杆菌微胶囊。
49.实施例3
50.1.菌种活化
51.配置10％复原脱脂乳溶液，在温度115℃下灭菌7min，得到活化培养基；按照以活化培养基重量计2％的接种量，将在温度-80℃下冷冻保藏的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于上述的活化培养基中，在温度37℃下培养22h，然后按照以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将活化一次的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于mrs液体培养基中，在温度37℃下培养22h，以同样方式传代培养2次，使其活菌数达到108cfu/ml以上。
52.2.植物乳杆菌微胶囊的制备
53.将活化好的菌液4000rpm离心5min，收集菌体，pbs洗菌两次后，加入pbs振匀后作为菌悬液；
54.配制浓度为5％的海藻酸钠溶液，浓度为4％大豆分离蛋白溶液，按体积比1:3的比例混合制成混合溶液，将菌悬液和混合溶液按体积比1:1的比例混合，搅拌均匀后制成混合
液体并倒入耐压瓶中，使用微胶囊造粒仪经高频振荡混合液体滴加到浓度为3％的cacl2溶液中，调整参数为喷嘴孔径300μm，气压300pa，振动频率500hz，电场300v，使液滴颗粒无连结且均匀，造粒结束后固化30min；2000rpm离心5min得到样品，用pbs洗涤两次，洗去微胶囊表面的cacl2残留液，制得成品微胶囊，将制得的湿态微胶囊放入-80℃的低温冰箱中预冻3h，置于-50℃、8pa真空冷冻干燥机中干燥，制得本发明所述植物乳杆菌微胶囊。
55.对比例1
56.1.菌种活化
57.配置10％复原脱脂乳溶液，在温度115℃下灭菌7min，得到活化培养基；按照以活化培养基重量计2％的接种量，将在温度-80℃下冷冻保藏的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于上述的活化培养基中，在温度37℃下培养22h，然后按照以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将活化一次的植物乳杆菌抗噬菌体菌株imau10120-1接种于mrs液体培养基中，在温度37℃下培养22h，以同样方式传代培养2次，使其活菌数达到108cfu/ml以上。
58.2.植物乳杆菌单一壁材微胶囊的制备
59.将活化好的菌液4000rpm离心5min，收集菌体，pbs洗菌两次后，加入pbs振匀后作为菌悬液。配制浓度1.8％的海藻酸钠溶液，将菌悬液和海藻酸钠溶液按体积比1:1的比例混合，搅拌均匀后制成混合液体并倒入耐压瓶中，使用微胶囊造粒仪经高频振荡混合液体滴加到浓度为3％的cacl2溶液中，调整参数使液滴颗粒无连结且均匀，制备参数为喷嘴孔径300μm，气压300pa，振动频率500hz，电场300v。造粒结束后固化40min；2000rpm离心5min得到样品，用pbs洗涤两次，洗去微胶囊表面的cacl2残留液，制得成品微胶囊，将制得的湿态微胶囊放入-80℃的低温冰箱中预冻3h，置于-50℃、8pa真空冷冻干燥机中干燥，制得植物乳杆菌单一壁材微胶囊。
60.实施例4
61.通过扫描电子显微镜(sem-su8010型，hitachi日本)观察本发明实施例1与对比例1制备得到的微胶囊的超微结构，具体方法如下：
62.用导电胶将微胶囊粉末黏在sem载物台上，样品表面喷金，30min后将载物台至于sem扫描电镜中进行扫描(加速电压15kv，电流75ma)，拍照得到图1和图2。
63.根据图1和图2可以看出，本发明所述微胶囊表面光滑，结构致密，具有良好的完整性和致密性。以海藻酸钠为单一壁材制备的微胶囊表面孔隙较多且粗糙凹陷。表明本发明复合壁材微胶囊表面更加圆润饱满，制备效果更好，由于大豆分离蛋白较好的乳化性与成膜性，使得微胶囊表面孔隙减少，制备更为均匀。
64.实施例5
65.微胶囊包埋率的测定：
66.将1g实施例1以及对比例1制备所得的微胶囊分别与9ml0.06mol/l的柠檬酸钠溶液混合，置于摇床，37℃、180r/min的条件下温育3h后，进行活菌计数，活菌数测定方法如下：
67.将完全崩解的微胶囊溶液依次作10倍的递增稀释，当稀释度为10-8
时停止稀释。用移液枪吸取1000μl稀释菌液，加入约45℃的已灭菌的mrs琼脂培养基摇匀，待其凝固后倒置，在温度37℃下培养48h，接着进行活菌计数，计算包埋率，结果如表1所示。
68.包埋率测定方法如下：
69.包埋率＝包埋后微胶囊中总活菌数/包埋前的总活菌数，其中包埋后微胶囊中的总活菌数为每克微胶囊的含菌量与收集得到微胶囊总质量的乘积，包埋前的总活菌数为每毫升浓缩菌液的含菌量与浓缩菌液体积的乘积。
70.表1不同处理微胶囊的包埋率
71.组别实施例1对比例1包埋率86.02％83.10％
72.如表1可知，实施例1制备的微胶囊包埋率可达86.02％，对比例1制备的微胶囊包埋率为83.1％，复合壁材微胶囊相比单一壁材微胶囊具有更好的包埋率。
73.实施例6
74.微胶囊在人工胃液中的耐受性：
75.1.人工胃肠液的制备
76.在ph为2.5的已灭菌的pbs(0.1mol/l hcl调)中加入已除菌的胃蛋白酶3.0g/l，制成人工模拟胃液(现配现用)。配制0.65％的磷酸二氢钾溶液100ml，使用naoh溶液(0.1mol/l)将磷酸二氢钾溶液的ph值调节至8.0，加入0.1g胰蛋白酶，0.22μm无菌滤膜过滤后备用，制成人工模拟肠液。
77.2.植物乳杆菌微胶囊在人工胃液中的耐受性
78.将实施例1、对比例1制备好的微胶囊分别取1g，放入9ml的人工模拟胃液中，在37℃、180r/min的条件下摇床振荡处理，分别在0、30、60、90、120min取样，4000rpm离心5min去上清，继续转入9ml的人工模拟肠液解囊计数，得到经过胃液耐受后微胶囊内存活的植物乳杆菌活菌数，计算存活率，以未经过包埋的游离植物乳杆菌菌株做空白对照，计算微胶囊经胃液处理后所包埋的活菌的存活率，结果如图3和图4。
79.根据图3和图4可以看出，随着微胶囊和游离菌在胃液内处理时间的增加，微胶囊组与未包埋组的活菌数均有所降低(p＜0.05)。微胶囊组存活率为88.62％，较未包埋组有极大提高，说明微胶囊包埋可提高植物乳杆菌imau10120-1对胃液的耐受性。而且，实施例1与对比例1制备的微胶囊相比，在人工模拟胃液中处理两小时后，实施例1制备的微胶囊存活率为88.62％，对比例1制备的微胶囊存活率为85.68％，因此复合壁材微胶囊在模拟胃液中对菌株具有更好的保护性。
80.实施例7
81.植物乳杆菌微胶囊肠溶性测定：
82.1.人工肠液的制备
83.配制0.65％的磷酸二氢钾溶液100ml，使用naoh溶液(0.1mol/l)将此溶液的ph值调节至8.0，加入0.1g胰蛋白酶，0.22μm无菌滤膜过滤后备用。
84.2.植物乳杆菌微胶囊肠溶性测定
85.将实施例1、对比例1制备好的微胶囊取1g加入到9ml的人工肠液内，在37℃、180r/min的条件下摇床温育2.5h，并在0min、30min、60min、90min、120min、150min时取样计数，所述的植物乳杆菌微胶囊在不同时间崩解情况如图5和图6所示。
86.可以看出，本发明所述的植物乳杆菌微胶囊在人工肠液中60min完全崩解，其活菌数维持在9.4
×
109cfu/ml，释放率达到100％，全部释放，表明本发明制备的微胶囊具有较
好的肠溶性，60min后能够完全释放。对比例1由海藻酸钠制备的植物乳杆菌微胶囊在人工肠液处理60min后，释放率达到95％。实施例1制备的微胶囊与对比例1相比，具有更好的肠溶性。
87.实施例8
88.植物乳杆菌(imau10120-1)微胶囊应用于乳酸菌发酵剂
89.将植物乳杆菌冻干菌粉按10wt％加入到由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合直投型发酵剂中，混合均匀即可得到含植物乳杆菌抗噬菌体突变株(lactobacillusplantarum imau10120-1)的乳酸菌发酵剂。
90.在发酵剂中添加本发明实施例1制备得到的植物乳杆菌imau10120-1微胶囊，可增加该乳酸菌发酵剂的潜在益生效果。经上述方法包埋的l.plantarum imau10120-1经过ph2.5人工胃液处理后与未被包埋的菌体相比可保持较高的存活率。其在ph2.5人工胃液中的存活率为88.62％。
91.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。