一株在低糖环境下生产透明质酸的马链球菌兽疫亚种及其应用

1.本发明属于生物多糖生产技术领域，主要涉及一株在低糖环境下生产透明质酸的马链球菌兽疫亚种及其应用。


背景技术：

2.透明质酸由双糖单位d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺重复交替连接而成，是一种高分子量酸性粘多糖，由于存在的大量羧基末端链，而羧基易解离一个氢离子使透明质酸双糖单位呈现负电进而使透明质酸多糖具有非常强的亲水性。正由于该特性，透明质酸已经被开发应用于化妆品保湿、膝关节注射、整容手术、口服药品等多个领域。
3.目前透明质酸的生产方法主要包括动物组织提取、微生物发酵和化学合成三种方法，其中透明质酸组织提取法虽然简单快捷，但面临原料有限和产量低的严重弊端，难以大量生产。而化学合成法虽然解决了成本高的问题，但也会具有合成透明质酸产品不纯的严重问题。伴随着透明质酸应用范围的逐步扩大，市场上对透明质酸的需求量也越来越大，微生物发酵法生产具有发酵周期短、产率高、安全性高等优点而逐渐成为透明质酸生产的主流。中国专利文献cn104059865a(申请号201410257052.7)以兽疫链球菌awa008(cgmcc no.9111)为透明质酸发酵菌株，经种子液培养、菌种扩培、发酵、提纯生产透明质酸，种子液培养、菌种扩培和发酵的培养液包括葡萄糖3-5％、酵母粉1.5-2％、七水硫酸镁1-2％、四水硫酸锰0.01-0.1％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、磷酸氢二钠0.5-0.8％、碳酸钙0.1-1％、氯化锌0.05-0.1％，余量为水，透明质酸产量可达7-9g/l；中国专利文献cn106834387a(申请号201710074784.6)以兽疫链球菌为发酵菌株，先接种至固体培养基活化，再接种至种子培养基培养，最后接种至发酵培养液中，其中发酵培养液中葡萄糖浓度50-100g/l、酵母粉浓度5-10g/l、蛋白胨浓度10-20g/l、硫酸镁浓度0.5-2g/l、硫酸二氢钾浓度0.5-2g/l、谷氨酸钠浓度10-20g/l、微量元素浓度0.5-10ml/l，微量元素中氯化钙浓度0.5-5g/l、硫酸镁浓度1-20g/l、硫酸亚铁浓度0.2-2g/l、硫酸锰浓度0.2-2g/l、乙二胺四乙酸二钠浓度1-50g/l，所得发酵液中玻尿酸产量可达12g/l；中国专利文献cn109161571a(申请号201811190519.5)使用兽疫链球菌h23进行发酵，用于生产透明质酸钠的培养基每100kg包括以下组分：白砂糖28-35kg，酵母浸粉8-12kg，七水硫酸镁0.8-1.1kg，二水磷酸二氢钠1.2-1.4kg，硫酸钾0.5-1.0kg，l-精氨酸15-25kg，消泡剂15-30ml，用水补至100kg，透明质酸钠的产量可达到7.5-8.5g/l。当今，国内外透明质酸的发酵生产菌株主要以兽疫链球菌为主，而大多数文献报道的兽疫链球菌透明质酸产量较低或发酵培养基含糖量较高，兽疫链球菌透明质酸的产量和发酵条件还有待进一步提高和优化。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一株在低糖环境下生产透明质酸的马链球菌兽疫亚种及其应用。本发明提供了一株适合低糖生长的马链球菌兽疫亚种wtf101，在低糖
条件下高产透明质酸，透明质酸产量可达12.2g/l，生产过程易于控制，发酵周期短，成本低，适合透明质酸规模化生产。
5.本发明的技术方案如下：
6.一株马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)wtf101，于2022年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 2022051。
7.根据本发明优选的，所述马链球菌兽疫亚种wtf101的16s rrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.马链球菌兽疫亚种，旧称兽疫链球菌，本发明的马链球菌兽疫亚种菌落形态呈规则球形，晶莹透彻，有荚膜，无鞭毛，革兰氏染色呈阳性。
9.上述马链球菌兽疫亚种wtf101在低糖环境下生产透明质酸中的应用。
10.根据本发明优选的，所述低糖环境下生产透明质酸是指在低糖发酵培养基中生产透明质酸，所述低糖发酵培养基的组分为：3-5％葡萄糖、1-2％蛋白胨、0.5-1.0％酵母浸粉、0.1-0.5％三水磷酸氢二钾、0.05-0.2％七水硫酸镁，并在发酵过程中补加葡萄糖，保证葡萄糖浓度维持在1.0-2.6％之间，最终发酵培养基的葡萄糖总浓度为7.2-8.0％。
11.进一步优选的，所述低糖发酵培养基的组分为：4％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁，并在发酵过程中补加葡萄糖，保证葡萄糖浓度维持在1.0-2.6％之间，最终发酵培养基的葡萄糖总浓度为7.2％。
12.根据本发明优选的，所述生产透明质酸的产量为9.5-12.2g/l，发酵液的粘度为52500-74000mpa
·
s，原料与产物之间的转化效率为13.2-16.9％，发酵周期为16-20h。
13.本发明在利用马链球菌兽疫亚种wtf101生产透明质酸时，在低糖发酵培养基中进行。发酵初始的葡萄糖浓度为4％，在发酵过程中补加葡萄糖，葡萄糖总浓度为7.2％：在5l的小试中，最终透明质酸产量达11.9g/l，发酵液的粘度达65000mpa
·
s，原料与产物之间的转化效率达16.5％；在50l的中试中，最终透明质酸产量达12.2g/l，发酵液的粘度达74000mpa
·
s，原料与产物之间的转化效率达16.9％。
14.本发明一种优选的技术方案，利用上述马链球菌兽疫亚种wtf101生产透明质酸的方法，包括步骤：
15.(1)种子活化：将马链球菌兽疫亚种wtf101接种至种子培养基中，150-220rpm、36-37℃活化至od
600
为1.0-1.5，得一级种子液；
16.(2)种子扩培：将步骤(1)得到的一级种子液按照1-5％体积百分比接种量接种至种子培养基中，150-220rpm、36-37℃培养至od
600
为1.0-1.5，得二级种子液；
17.(3)发酵：将步骤(2)得到的二级种子液接种至发酵培养基中，接种量为5-10％体积百分比，设定发酵温度36-37℃，ph＝7.0，转速200-500rpm，通风比1:1，溶氧大于30％，维持并执行以上发酵条件，待发酵液中残糖低于2g/l时即可结束发酵，放罐提纯；
18.(4)提纯：将步骤(3)得到的发酵液经提取、纯化、精制后得透明质酸成品。
19.根据本发明优选的，步骤(1)和步骤(2)中所述种子培养基的组分为：0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0。
20.根据本发明优选的，步骤(3)中所述发酵培养基的组分为：3-5％葡萄糖、1-2％蛋白胨、0.5-1.0％酵母浸粉、0.1-0.5％三水磷酸氢二钾、0.05-0.2％七水硫酸镁，并在发酵
过程中补加葡萄糖，保证葡萄糖浓度维持在1.0-2.6％之间，最终发酵培养基的葡萄糖总浓度为7.2-8.0％。
21.进一步优选的，步骤(3)中所述发酵培养基的组分为：4％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁，并在发酵过程中补加葡萄糖，保证葡萄糖浓度维持在1.0-2.6％之间，最终发酵培养基的葡萄糖总浓度为7.2％。
22.本发明中，步骤(4)中所述提纯按照现有技术进行，在本发明优选的技术方案中，所述提纯的步骤如下：
23.①
粗提：将步骤(3)得到的发酵液用95％乙醇边喷淋边搅拌，待出现白色絮状物后停止搅拌但继续喷淋95％乙醇，至体系中乙醇浓度为60％后停止，随后静置4-8小时使透明质酸充分沉淀，抽滤或离心收集沉淀物；
24.②
打碎分散：将
①
收集的沉淀物继续边喷淋95％乙醇边搅拌，待体系中乙醇浓度达到70％-80％停止，抽滤或离心收集沉淀物；
25.③
溶解：将
②
收集的沉淀物加入到50-60℃去离子水中搅拌溶解4-6小时，并将氯化钠和edta试剂添加至溶解体系中，溶解体系中氯化钠的浓度为5％，edta的浓度为0.05％；
26.④
除杂：将
③
得到的溶解体系调节ph至6.0-7.0之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将体系中的菌体和金属离子除掉；再用活性炭进行脱色处理；然后调节体系ph至10-11之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将体系中的蛋白质除掉；最后依次经过0.45μm和0.2μm的滤膜进行深层过滤；
27.⑤
精制：将
④
过滤得到的透明质酸溶液调节ph至4.0-6.0，边喷淋95％乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到40％-45％，再调节ph至6.0-7.0，边喷淋95％乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到50-60％，搅拌1小时后进行抽滤或离心；
28.⑥
成品：将
⑤
收集的透明质酸沉淀物烘干后碾碎即得透明质酸成品。
29.本发明中未详细说明的步骤均按照现有技术进行。
30.本发明的有益效果为：
31.本发明通过artp等离子诱变技术，筛选到一株适合在低糖环境下高产透明质酸的马链球菌兽疫亚种wtf101，结合分批补料发酵技术，优化发酵培养基，平衡菌种生长与代谢之间的关系，最终马链球菌兽疫亚种wtf101在总糖含量为7.2％的条件下，透明质酸产量可达12.2g/l，发酵液的粘度可达74000mpa
·
s，原料与产物之间的转化效率可达16.9％，大大提高了透明质酸的生产效率，节约生产成本。
32.本发明的发酵技术和提纯技术工艺简单且易于调控，通过该发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短，经过提纯得到的产品杂质含量更低，产品收率更高，大大降低了生产成本，适合大规模工业化生产，具有良好的应用前景。
33.马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)wtf101，于2022年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 2022051。
附图说明
34.图1为野生型马链球菌兽疫亚种wtf001的结晶紫染色电子显微镜照片；
35.图2为突变型马链球菌兽疫亚种wtf101的结晶紫染色电子显微镜照片。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均按照本领域常规操作进行。实施例中未作特别说明的百分数均为质量百分数。
37.实施例1：高产透明质酸的马链球菌兽疫亚种筛选
38.初筛：以野生型马链球菌兽疫亚种wtf001为初始菌株，野生型马链球菌兽疫亚种wtf001为本实验室保藏菌株，将经artp等离子诱变的菌株用无菌水稀释适当倍数涂布于固体筛选培养基上，37℃倒置培养24小时，挑选菌落边缘规则、隆起、菌落晶莹透彻、透明圈大的单菌落，将单菌落接种并保存于试管斜面。
39.复筛：将挑选出来的单菌落从试管斜面接种至发酵培养基中，200rpm，37℃，ph 7.0条件下发酵24小时，硫酸咔唑法检测透明质酸含量，挑选发酵透明质酸产量高的摇瓶对应的单菌落试管斜面。
40.上述固体筛选培养基和试管斜面的组分如下：0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0，再加入2％琼脂；
41.发酵培养基的组分如下：4％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁，并在发酵过程中补加葡萄糖，最终发酵培养基的葡萄糖总浓度为7.2％。
42.应用细菌通用引物(27f/1492r)从筛选得到的单菌落的基因组中扩增其16srrna序列，进行测序，该菌株的16srrna序列如seq id no.1所示，比对分析。将该序列在ncbi中进行blast比对，确定该菌株为马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)，命名为马链球菌兽疫亚种wtf101。
43.该菌株已于2022年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 2022051。
44.将野生型马链球菌兽疫亚种wtf001与突变型马链球菌兽疫亚种wtf101进行结晶紫染色，并进行电子显微镜观察，结果如图1和图2所示，从照片可以看出，马链球菌兽疫亚种wtf101菌落形态呈规则球形，晶莹透彻，有荚膜，无鞭毛，革兰氏染色呈阳性，相较于野生型马链球菌兽疫亚种wtf001，突变型马链球菌兽疫亚种wtf101出现明显的透明圈，由于细菌荚膜无法被结晶紫染色，说明突变型马链球菌兽疫亚种wtf101的荚膜变厚。
45.实施例2：马链球菌兽疫亚种wtf101生产透明质酸-小试
46.利用实施例1筛选到的马链球菌兽疫亚种wtf101制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：
47.(1)种子活化：将实施例1筛选得到的马链球菌兽疫亚种wtf101接种至装有种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的500ml锥形瓶中，200rpm、37℃活化17小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得一级种子液；
48.(2)种子扩培：将步骤(1)活化得到的一级种子液按照1％体积百分比接种量接种
至装有种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的500ml锥形瓶中，200rpm、37℃活化15小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得二级种子液；
49.(3)发酵：将5l发酵罐中发酵培养基(不同葡萄糖浓度、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁)蒸汽灭菌后，设定温度37℃，ph＝7.0，转速200-500rpm，通风比1:1，二级种子液接种量8％体积百分比。发酵期间，使用5mol/l氢氧化钠溶液调节发酵罐内发酵液的ph，使其始终维持ph＝7.0；为维持发酵罐内发酵液葡萄糖处于合适的浓度，使用50％浓度的葡萄糖溶液并采用分批补料的方式，使发酵罐内发酵液的葡萄糖浓度始终维持在1.0-2.6％之间，补加的葡萄糖分批次加入，在发酵液的葡萄糖浓度降低至1.0％时开始补加，补加后发酵液的葡萄糖浓度不超过2.6％，使得最终发酵培养基的葡萄糖总浓度达到72g/l；对于发酵液中溶氧水平的把控是决定原料与产物转化效率的关键，本发明中原料与产物的转化效率是指产物产量与原料总量的比值；通过梯度爬坡实验最终决定以200rpm为初始转速，以500rpm为最终转速，通过逐步提高发酵罐搅拌转速来维持发酵液溶氧do值始终大于30％；维持并执行以上发酵条件。检测残糖和发酵液粘度，待残糖低于2g/l时即可结束发酵，放罐提纯；
50.为验证适合马链球菌兽疫亚种wtf101高产透明质酸的初始葡萄糖浓度，对发酵条件中初始的葡萄糖浓度分别于20g/l、30g/l、40g/l、50g/l的4个梯度下进行发酵优化产量验证，结果如下：
51.表1.不同初糖浓度下马链球菌兽疫亚种wtf101的发酵情况
52.发酵培养基糖浓度(g/l)20304050补加的糖浓度(g/l)52423222发酵时间(h)20202020发酵液粘度(mpa
·
s)19000525006500054000透明质酸产量(g/l)5.39.511.99.8原料与产物之间的转化效率(％)7.413.216.513.6菌体最大od值33.929.325.022.7
53.由上表可知：当发酵培养基的葡萄糖浓度为4％，总糖浓度为7.2％时，透明质酸的产量最高，为11.9g/l，原料与产物之间的转化效率最高，为16.5％，发酵液的粘度最大，为65000mpa
·
s。本发明的发酵周期较短，为16-20h，在相同条件不同发酵批次之间，由于种子液状态及发酵培养基生产批次的差异，都会对发酵产生影响，所以本发明的发酵周期很难确定为一个准确的时间，但均在20h时能够结束发酵。
54.(4)提纯：严格按照国家安全标准执行；
55.①
粗提：将发酵液压至沉淀罐中，随后立即用95％的乙醇边喷淋边搅拌，待出现白色絮状物后停止搅拌但继续喷淋乙醇，加至整个体系中乙醇浓度为60％后停止，随后静置4-8小时使透明质酸多糖充分沉淀，抽滤或离心收集沉淀物；
56.②
打碎分散：将
①
收集的沉淀物继续边喷淋95％的乙醇边搅拌，待体系中乙醇浓度达到70％-80％停止，抽滤或离心收集沉淀物；
57.③
溶解：将
②
收集的沉淀物加入到50-60℃去离子水中搅拌溶解4-6小时，并将氯化钠和edta试剂添加至溶解体系中；溶解体系中氯化钠的浓度为5％，edta的浓度为
0.05％；
58.④
除杂：将
③
中透明质酸和盐的复合溶解体系调节ph至6.0-7.0之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的菌体和金属离子除掉；然后用活性炭进行脱色处理；再调节体系ph至10-11之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的蛋白质除掉；最后将复合溶解体系依次经过0.45μm和0.2μm的滤膜进行深层过滤；
59.⑤
精制：将
④
过滤得到的透明质酸溶液调节ph至4.0-6.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到40％-45％，再调节ph至6.0-7.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到50-60％，搅拌1小时后进行抽滤或离心；
60.⑥
成品：将
⑤
收集的透明质酸沉淀物铺匀放置在真空干燥箱中烘干，待烘干后碾碎即得透明质酸成品。
61.实施例3：马链球菌兽疫亚种wtf101生产透明质酸-中试
62.利用实施例1筛选到的马链球菌兽疫亚种wtf101制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：
63.(1)种子活化：将实施例1筛选得到的马链球菌兽疫亚种wtf101接种至装有种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的500ml锥形瓶中，200rpm、37℃活化17小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得一级种子液；
64.(2)种子扩培：将步骤(1)活化得到的一级种子液按照1％体积百分比接种量接种至含有灭菌种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的种子罐中，200rpm、37℃活化5小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得二级种子液；
65.(3)发酵：将50l发酵罐中发酵培养基(4％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁)蒸汽灭菌后，设定温度37℃，ph＝7.0，转速200-500rpm，通风比1:1，罐压0.05mpa，二级种子液接种量8％体积百分比。发酵期间，使用20mol/l氢氧化钠溶液调节发酵罐内发酵液的ph，使其始终维持ph＝7.0；为维持发酵罐内发酵液的葡萄糖处于合适的浓度，使用50％浓度的葡萄糖溶液并采用分批补料的方式，使发酵罐内发酵液的葡萄糖浓度始终维持在1.0-2.6％之间，补加的葡萄糖分2次加入，在发酵液的葡萄糖浓度降低至1.0％时开始补加，补加后发酵液的葡萄糖浓度不超过2.6％，使得最终发酵培养基的葡萄糖总浓度达到72g/l；以200rpm为初始转速，以500rpm为最终转速，通过逐步提高发酵罐搅拌转速来维持发酵液溶氧do值始终大于30％；维持并执行以上发酵条件。检测残糖和发酵液粘度，待残糖低于2g/l时即可结束发酵，放罐提纯。发酵时间为16-20h，发酵液粘度为74000mpa
·
s，透明质酸产量可达12.2g/l，原料与产物之间的转化效率为16.9％。
66.(4)提纯：严格按照国家安全标准执行；
67.①
粗提：将发酵液压至沉淀罐中，随后立即用95％的乙醇边喷淋边搅拌，待出现白色絮状物后停止搅拌但继续喷淋乙醇，加至整个体系中乙醇浓度为60％后停止，随后静置4-8小时使透明质酸多糖充分沉淀，抽滤或离心收集沉淀物；
68.②
打碎分散：将
①
收集的沉淀物继续边喷淋95％的乙醇边搅拌，待体系中乙醇浓度达到70％-80％停止，抽滤或离心收集沉淀物；
69.③
溶解：将
②
收集的沉淀物加入到50-60℃去离子水中搅拌溶解4-6小时，并将氯化钠和edta试剂添加至溶解体系中；溶解体系中氯化钠的浓度为5％，edta的浓度为0.05％；
70.④
除杂：将
③
中透明质酸和盐的复合溶解体系调节ph至6.0-7.0之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的菌体和金属离子除掉；然后用活性炭进行脱色处理；再调节体系ph至10-11之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的蛋白质除掉；最后将复合溶解体系依次经过0.45μm和0.2μm的滤膜进行深层过滤；
71.⑤
精制：将
④
过滤得到的透明质酸溶液调节ph至4.0-6.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到40％-45％，再调节ph至6.0-7.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到50-60％，搅拌1小时后进行抽滤或离心；
72.⑥
成品：将
⑤
收集的透明质酸沉淀物铺匀放置在真空干燥箱中烘干，待烘干后碾碎即得透明质酸成品。
73.与申请号201710074784.6的专利技术方案相比，本发明的发酵培养基成分更简单，葡萄糖用量更低，透明质酸产量更高。在申请号201710074784.6的专利中，将发酵培养基中的微量元素去除，发酵培养基组分为：葡萄糖浓度为100g/l，酵母粉浓度为10g/l，蛋白胨浓度为20g/l，硫酸镁浓度为0.5g/l，磷酸二氢钾浓度为2g/l，谷氨酸钠为20g/l时，其生产的玻尿酸产量为8g/l，发酵周期为24小时，发酵液粘度为40000mpa
·
s。
74.对比例1
75.利用野生型马链球菌兽疫亚种wtf001制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：
76.(1)种子活化：将野生型马链球菌兽疫亚种wtf001接种至装有种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的500ml锥形瓶中，200rpm、37℃活化17小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得一级种子液；
77.(2)种子扩培：将步骤(1)活化得到的一级种子液按照1％体积百分比接种量接种至装有种子培养基(0.5％葡萄糖、1％蛋白胨、0.4％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁、ph＝7.0)的500ml锥形瓶中，200rpm、37℃活化15小时，采用紫外分光光度计在600nm测菌体量吸光值为1.1左右，革兰氏染色镜检无误后得二级种子液；
78.(3)发酵：将5l发酵罐中发酵培养基(4％葡萄糖、1.5％蛋白胨、0.6％酵母浸粉、0.2％三水磷酸氢二钾、0.05％七水硫酸镁)蒸汽灭菌后，设定温度37℃，ph＝7.0，转速200-500rpm，通风比1:1，二级种子液接种量8％体积百分比。发酵期间，使用5mol/l氢氧化钠溶液调节发酵罐内发酵液的ph，使其始终维持ph＝7.0；为维持发酵罐内发酵液的葡萄糖处于合适的浓度，使用50％浓度的葡萄糖溶液并采用分批补料的方式，使发酵罐内发酵液的葡萄糖浓度始终维持在1.0-2.6％之间，补加的葡萄糖分2次加入，在发酵液的葡萄糖浓度降低至1.0％时开始补加，补加后发酵液的葡萄糖浓度不超过2.6％，使得最终发酵培养基的葡萄糖总浓度达到72g/l；以200rpm为初始转速，以500rpm为最终转速，通过逐步提高发酵罐搅拌转速来维持发酵液溶氧do值始终大于30％；维持并执行以上发酵条件。检测残糖和发酵液粘度，待残糖低于2g/l时即可结束发酵，放罐提纯。发酵时间为16-20h，发酵液粘度为2200mpa
·
s，透明质酸产量为7.3g/l，原料与产物之间的转化效率为10.1％。
79.(4)提纯：严格按照国家安全标准执行；
80.①
粗提：将发酵液压至沉淀罐中，随后立即用95％的乙醇边喷淋边搅拌，待出现白色絮状物后停止搅拌但继续喷淋乙醇，加至整个体系中乙醇浓度为60％后停止，随后静置4-8小时使透明质酸多糖充分沉淀，抽滤或离心收集沉淀物；
81.②
打碎分散：将
①
收集的沉淀物继续边喷淋95％的乙醇边搅拌，待体系中乙醇浓度达到70％-80％停止，抽滤或离心收集沉淀物；
82.③
溶解：将
②
收集的沉淀物加入到50-60℃去离子水中搅拌溶解4-6小时，并将氯化钠和edta试剂添加至溶解体系中；溶解体系中氯化钠的浓度为5％，edta的浓度为0.05％；
83.④
除杂：将
③
中透明质酸和盐的复合溶解体系调节ph至6.0-7.0之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的菌体和金属离子除掉；然后用活性炭进行脱色处理；再调节体系ph至10-11之间，利用硅藻土或珍珠岩抽滤，将复合溶解体系中的蛋白质除掉；最后将复合溶解体系依次经过0.45μm和0.2μm的滤膜进行深层过滤；
84.⑤
精制：将
④
过滤得到的透明质酸溶液调节ph至4.0-6.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到40％-45％，再调节ph至6.0-7.0，边喷淋95％的乙醇边搅拌，至体系中乙醇浓度达到50-60％，搅拌1小时后进行抽滤或离心；
85.⑥
成品：将
⑤
收集的透明质酸沉淀物铺匀放置在真空干燥箱中烘干，待烘干后碾碎即得透明质酸成品。
86.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。