乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法与流程

1.本发明涉及药物合成的技术领域，特别涉及乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法。


背景技术：

2.乌苯美司(ubenimex)，化学名为n-[(2s,3r)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰]-l
‑ꢀ
亮氨酸，其化学结构式如下所示：
[0003][0004]
乌苯美司最初是由日本科学家从链霉菌属(streptomyces ofivoreticuli)的培养液中分离所得的二肽化合物，其可竞争性地抑制氨肽酶b(aminopeptidase b) 及亮氨酸肽酶(leucineamino peptidase)；增强t细胞的功能，使nk细胞的杀伤活力增强，且可使集落刺激因子合成增加而刺激骨髓细胞的再生及分化。因此，在临床上，乌苯美司能够增强免疫功能，用于抗癌化疗、放疗的辅助治疗，老年性免疫功能缺陷等；并且，其可配合化疗、放疗及联合应用于白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症及造血干细胞移植后遗症，以及其他实体瘤患者。
[0005]
由于生物发酵的周期长、产率低，且占地面积大，故在目前原料药工业生产上，主要参照日本化药株式会社(nippon kayaku)hamao umezawa等人的专利us4281180a和期刊论文《journal of antibiotics》》1983,jun,36(6):695-9.所描述的工艺路线，通过化学合成方法获得乌苯美司。该方法的最后两步反应是：
①
中间体ⅳ与亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐发生酰胺缩合反应，得到乌苯美司前体；
②
前体经催化氢化反应，得到乌苯美司。在酰胺缩合反应中，缩合试剂是1-羟基苯并三唑(hobt)、二环己基碳二亚胺(dcc)，缩合试剂hobt因制备工艺原因导致其中会有肼的残留，故hobt中残留的肼亦会参与该酰胺缩合反应，分别生成杂质ⅰ和ⅱ，其中，中间体ⅳ的结构式为乌苯美司前体的结构式为杂质i为(2s,3r)-2-羟基-3-氨基
ꢀ‑
4-苯基丁酰肼，结
构式为杂质ⅱ为1,2-二[(2s,3r)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酰基]肼，结构式为
[0006]
《regulatory toxicology and pharmacology》2006年第44卷第3期p198～211 的文章《a rationale for determing,testing and controlling specific impurities inpharmaceuticals that possess potential for genotoxicity》中的fig.1.，已明确指出肼类化合物系具有致突变性或遗传毒性的警示结构。故根据《人用药品注册技术要求国际协调会议(ich)》指导原则m7的杂质分类规定，上述杂质ⅰ和ⅱ均为 3类遗传毒性杂质，参照毒理学关注阈值，需严格控制其允许每日摄入量(adi) 为1.5μg/天，因此，需合成出相应的杂质对照品，为乌苯美司的遗传毒性杂质分析方法的开发提供物质基础。然而，虽然上述杂质i和杂质ii是缩合试剂hobt 残留的肼发生副反应而生成，但因为肼早期用作为火箭推进剂或燃料，在空气中极易燃烧爆炸，故肼的商品化试剂常以水合肼(肼的水溶液)的形式供应，而生成杂质i和杂质ii的酰胺缩合反应对水敏感，试剂和溶剂均需要无水，因此，实际生产时，无法直接以水合肼代替api工艺中的胺源(亮氨酸苄酯对甲苯磺酸盐)发生酰胺缩合制备杂质i和杂质ii，因此，有必要开发杂质i和杂质 ii的新合成路线。


技术实现要素：

[0007]
基于此，本发明提供两个乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，即上述杂质i 和杂质ii的制备方法，以便建立乌苯美司产品全面的杂质谱，有助于成品的质量控制。
[0008]
所述乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法包括以下步骤：
[0009]
使具有式(iii)所示结构的化合物与氯甲酸苄酯反应，制备具有式(iv) 所示结构的化合物；
[0010]
使具有式(iv)所示结构的化合物与1,1-二苄肼反应，制备具有式(v)所示结构的化合物；
[0011]
对具有式(v)所示结构的化合物进行催化氢化，制备具有式(i)所示结构的杂质；
[0012]
使具有式(i)所示结构的杂质与具有式(iv)所示结构的化合物反应，制备具有式(vi)所示结构的化合物；
[0013]
对具有式(vi)所示结构的化合物进行催化氢化，制备具有式(ii)所示结构的杂质；
[0014]
[0015][0016]
在其中一实施例中，使具有式(iii)所示结构的化合物与氯甲酸苄酯反应包括以下步骤：
[0017]
于碱性溶剂中溶解具有式(iii)所示结构的化合物，加入氯甲酸苄酯。
[0018]
在其中一实施例中，所述碱性溶剂为四氢呋喃水溶液和三乙胺的混合溶剂。
[0019]
在其中一实施例中，使具有式(iv)所示结构的化合物与1,1-二苄肼反应包括以下步骤，
[0020]
于溶剂中混合具有式(iv)所示结构的化合物、1,1-二苄肼和缩合试剂，发生缩合反应。
[0021]
在其中一实施例中，所述溶剂选自四氢呋喃。
[0022]
在其中一实施例中，所述缩合试剂为1-羟基苯并三唑和二环已基碳二亚胺。
[0023]
在其中一实施例中，对具有式(v)所示结构的化合物进行催化氢化包括以下步骤：
[0024]
于溶剂中溶解具有式(v)所示结构的化合物，在催化剂作用下，通氢气反应。
[0025]
在其中一实施例中，所述溶剂为乙酸。
[0026]
在其中一实施例中，所述催化剂为钯碳。
[0027]
在其中一实施例中，使具有式(i)所示结构的杂质与具有式(iv)所示结构的化合物反应包括以下步骤：
[0028]
于溶剂中混合具有式(i)所示结构的化合物、具有式(iv)所示结构的化合物和缩合试剂，发生缩合反应。
[0029]
在其中一实施例中，所述溶剂为四氢呋喃。
[0030]
在其中一实施例中，所述缩合试剂为1-羟基苯并三唑和二环已基碳二亚胺。
[0031]
在其中一实施例中，对具有式(vi)所示结构的化合物进行催化氢化包括以下步骤：
[0032]
于溶剂中溶解具有式(vi)所示结构的化合物，在催化剂作用下，通氢气反应。
[0033]
在其中一实施例中，所述溶剂为乙酸。
[0034]
在其中一实施例中，所述催化剂为钯碳。
[0035]
与现有方案相比，本发明具有以下有益效果：
[0036]
本发明设计了一个新的合成路线，先利用氯甲酸苄酯对化合物iii的氨基进行保护，生成化合物iv，然后以其作为羧酸源，以1,1-二苄肼作为胺源，发生酰胺缩合反应，再通过催化氢化，直接获得杂质i，同时，利用上述反应原理，巧妙地以杂质i作为胺源，以上述反应的一个中间体化合物iv再次作为羧酸源，再次发生酰胺缩合反应，同样通过催化氢化，直接获得杂质ii。上述合成方法操作简单、路线短、收率高、合成得到的目标化合物纯度高，可以作为杂质对照品使用，有利于建立乌苯美司产品全面的杂质谱，有助于成品的质量控制。
具体实施方式
[0037]
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形
式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
[0038]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0039]
酰胺缩合反应的物料需包括羧酸、胺、缩合试剂(dcc或edc等碳二亚胺类、hobt)和溶剂，如下式所示，反应机理为：羧酸先与dcc反应，得到一个高活性的中间体，再与hobt反应，得到低活性的hobt酯(此时，dcc已转变为脲衍生物)，最后胺再与hobt酯发生胺解反应，得到目标酰胺。可以看出，酰胺缩合反应产生的1分子水，最后其实全部转移到了dcc这里，dcc转变成了脲衍生物，促进反应平衡向右移动。所以酰胺缩合反应对水敏感，所有物料均需要无水。
[0040][0041]
本发明设计了乌苯美司遗传毒性杂质的合成路线，具体如下：
[0042]
乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，包括以下步骤：
[0043]
使具有式(iii)所示结构的化合物与氯甲基苄酯反应，制备具有式(iv) 所示结构的化合物；
[0044]
使具有式(iv)所示结构的化合物与1,1-二苄肼反应，制备具有式(v)所示结构的化合物；
[0045]
具有式(v)所示结构的化合物经催化氢化，制备具有式(i)所示结构的杂质；
[0046]
使具有式(i)所示结构的杂质与具有式(iv)所示结构的化合物反应，制备具有式(vi)所示结构的化合物；
[0047]
具有式(vi)所示结构的化合物经催化氢化，制备具有式(ii)所示结构的杂质；
[0048][0049]
具体合成路线如下：
[0050][0051]
在其中一个实施例中，使具有式(iii)所示结构的化合物与氯甲酸苄酯(cbz-cl)反应，这一反应为上cbz保护，对具有式(iii)所示结构的化合物的氨基进行保护，保护后，该氨基在后续酰胺缩合反应中不具备反应活性，这一步骤有利于减少后续缩合步骤的副反应发生。包括以下步骤：
[0052]
于碱性溶剂中溶解具有式(iii)所示结构的化合物，加入氯甲酸苄酯。
[0053]
优选地，所述碱性溶剂为四氢呋喃水溶液和三乙胺的混合溶剂。进一步优选地，四氢呋喃水溶液中，四氢呋喃和水的体积比为1：(0.5-1.5)。
[0054]
优选地，所述具有式(iii)所示结构的化合物与所述氯甲酸苄酯的摩尔比为1：(1-1.2)。
[0055]
可以理解地，先混合四氢呋喃水溶液和三乙胺的混合溶剂和具有式(iii) 所示结构的化合物，搅拌成均相溶液后，再缓慢加入氯甲酸苄酯。反应结束后，还可包括对反应产物稀释、萃取、洗涤、调ph值、萃取、洗涤、干燥、抽滤、减压旋干滤液等步骤。
[0056]
在其中一个实施例中，使具有式(iv)所示结构的化合物与1,1-二苄肼反应，这一反应为酰胺缩合反应，具有式(iv)所示结构的化合物可作为酰胺缩合反应中的羧酸源，1,1-二苄肼不含水，可作为酰胺缩合反应中的胺源，包括以下步骤，
[0057]
于溶剂中混合具有式(iv)所示结构的化合物、1,1-二苄肼和缩合试剂，发生缩合反应。
[0058]
加入1,1-二苄肼，其分子中有苄基，便于进行反应监控。
[0059]
优选地，所述溶剂选自四氢呋喃。
[0060]
优选地，所述缩合试剂为1-羟基苯并三唑(hobt)和二环已基碳二亚胺 (dcc)。
[0061]
优选地，所述具有式(iv)所示结构的化合物和1,1-二苄肼的摩尔比为1： (1-1.2)。
[0062]
进一步优选地，所述具有式(iv)所示结构的化合物、1,1-二苄肼、1-羟基苯并三唑(hobt)和二环已基碳二亚胺(dcc)的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.5)： (1-1.5)。
[0063]
可以理解地，具有式(iv)所示结构的化合物、1,1-二苄肼和1-羟基苯并三唑(hobt)可先在溶剂中混合，然后冰水浴冷却的条件下加入二环已基碳二亚胺(dcc)，进行缩合反应。反应结束后，还包括抽滤、减压旋干滤液、柱层析纯化的步骤。
[0064]
在其中一个实施例中，对具有式(v)所示结构的化合物进行催化氢化，这一反应为脱保护反应，包括以下步骤：
[0065]
于溶剂中溶解具有式(v)所示结构的化合物，在催化剂作用下，通氢气反应。
[0066]
优选地，所述溶剂为乙酸。
[0067]
优选地，所述催化剂为钯碳。进一步优选地，所述钯碳为5％的钯碳。
[0068]
可以理解地，反应停止后，还包括抽滤、减压旋干滤液、加溶剂溶解，调 ph值、萃取、洗涤、干燥、抽滤、减压旋干滤液等步骤。
[0069]
在其中一个实施例中，使具有式(i)所示结构的杂质与具有式(iv)所示结构的化合物反应，这一反应为酰胺缩合反应，以具有式(i)所示结构的杂质为胺源，以上述反应的一个中间体化合物iv再次作为羧酸源，包括以下步骤：
[0070]
于溶剂中混合具有式(i)所示结构的化合物、具有式(iv)所示结构的化合物和缩合试剂，发生缩合反应。
[0071]
优选地，所述溶剂为四氢呋喃。
[0072]
优选地，所述缩合试剂为1-羟基苯并三唑(hobt)和二环已基碳二亚胺 (dcc)。
[0073]
优选地，所述具有式(i)所示结构的化合物和具有式(iv)所示结构的化合物的摩尔比为1：(1-1.2)。
[0074]
进一步优选地，所述具有式(i)所示结构的化合物、具有式(iv)所示结构的化合物、1-羟基苯并三唑(hobt)和二环已基碳二亚胺(dcc)的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.5)：(1-1.5)。
[0075]
可以理解地，具有式(i)所示结构的化合物、具有式(iv)所示结构的化合物和1-羟基苯并三唑(hobt)可先在溶剂中混合，然后冰水浴冷却的条件下加入二环已基碳二亚胺(dcc)，进行缩合反应。反应结束后，还包括抽滤、减压旋干滤液、柱层析纯化的步骤。
[0076]
在其中一个实施例中，对具有式(vi)所示结构的化合物进行催化氢化，这一反应为脱保护反应，包括以下步骤：
[0077]
于溶剂中溶解具有式(vi)所示结构的化合物，在催化剂作用下，通氢气反应。
[0078]
优选地，所述溶剂为乙酸。
[0079]
优选地，所述催化剂为钯碳。
[0080]
可以理解地，反应停止后，还包括抽滤、减压旋干滤液、加溶剂溶解，调 ph值、萃取、洗涤、干燥、抽滤、减压旋干滤液等步骤。]
[0081]
以下结合具体实施例和对比例进行进一步说明，以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售。下述实施例和对比例所用原料或其供应商为：
[0082]
实施例1
[0083]
本实施例提供两个乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，步骤如下：
[0084]
1)中间体ⅳ的制备
[0085]
向1.95g(0.01mol)的(2s,3r)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酸(ⅲ)中，依次加入20ml四氢呋喃水溶液(v/v＝1/1)、1.21g三乙胺(0.012mol)，搅拌形成均相溶液后，缓慢滴加1.87g(0.011mol)氯甲酸苄酯(cbz-cl)，室温反应。tlc 显示起始原料ⅲ消失后，加30ml水稀释，3
×
30ml乙酸乙酯萃取洗涤，然后用稀盐酸将水相ph调至1～2，3
×
30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用 10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到cbz保护的中间体ⅳ，称重2.76g，收率83.9％。质谱esi：m/z＝328.66([m-h]-)。
[0086]
2)中间体
ⅴ
的制备
[0087]
向1.65g(0.005mol)中间体ⅳ、1.17g(0.0055mol)1,1-二苄肼和0.81g (0.006mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入30ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入1.24g(0.006mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体
ⅴ
，称重2.57g，收率98.3％。质谱esi： m/z＝524.73([m+h]
+
)。
[0088]
3)化合物ⅰ的制备
[0089]
向0.24g 5％的钯碳中加入2.35g(0.0045mol)中间体
ⅴ
溶于50ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入50ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅰ，称重0.90g，收率95.7％。
[0090]
质谱esi：m/z＝210.32([m+h]
+
)。
[0091]1hnmr(cd3cood，ppm)：2.70～2.80(2h,m)，3.75～3.85(1h,m)，4.50～ 4.52(1h,m)，7.20～7.40(5h,m)。
[0092]
4)中间体ⅵ的制备
[0093]
向0.52g(0.0025mol)化合物ⅰ、0.92g(0.0028mol)中间体ⅳ和0.41g (0.003mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入20ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入0.62g(0.003mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体ⅵ，称重1.26g，收率96.9％。质谱esi： m/z＝521.61([m+h]
+
)。
[0094]
5)化合物ⅱ的制备
[0095]
向0.11g 5％的钯碳中加入1.04g(0.002mol)中间体ⅵ溶于30ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入30ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅱ，称重0.75g，收率97.2％。
[0096]
质谱esi：m/z＝387.60([m+h]
+
)。
[0097]1hnmr(cd3cood，ppm)：2.68～2.76(4h,m)，3.74～3.83(2h,m)，4.46～ 4.51(2h,m)，7.17～7.38(10h,m)。
[0098]
实施例2
[0099]
本实施例提供两个乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，步骤如下：
[0100]
1)中间体ⅳ的制备
[0101]
向1.95g(0.01mol)的(2s,3r)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酸(ⅲ)中，依次加入30ml
四氢呋喃水溶液(v/v＝1/0.5)、1.11g三乙胺(0.011mol)，搅拌形成均相溶液后，缓慢滴加1.70g(0.01mol)氯甲酸苄酯(cbz-cl)，室温反应。tlc 显示起始原料ⅲ消失后，加30ml水稀释，3
×
30ml乙酸乙酯萃取洗涤，然后用稀盐酸将水相ph调至1～2，3
×
30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用 10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到cbz保护的中间体ⅳ，称重2.72g，收率82.7％。
[0102]
2)中间体
ⅴ
的制备
[0103]
向1.65g(0.005mol)中间体ⅳ、1.06g(0.005mol)1,1-二苄肼和0.68g (0.005mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入30ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入1.03g(0.005mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体
ⅴ
，称重2.56g，收率97.9％。
[0104]
3)化合物ⅰ的制备
[0105]
向0.19g 5％的钯碳中加入2.35g(0.0045mol)中间体
ⅴ
溶于50ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入50ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅰ，称重0.89g，收率94.6％。
[0106]
4)中间体ⅵ的制备
[0107]
向0.52g(0.0025mol)化合物ⅰ、0.82g(0.0025mol)中间体ⅳ和0.34g (0.0025mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入20ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入0.52g(0.0025mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体ⅵ，称重1.25g，收率96.2％。
[0108]
5)化合物ⅱ的制备
[0109]
向0.083g 5％的钯碳中加入1.04g(0.002mol)中间体ⅵ溶于30ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入30ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅱ，称重0.74g，收率95.8％。
[0110]
实施例3
[0111]
本实施例提供两个乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，步骤如下：
[0112]
1)中间体ⅳ的制备
[0113]
向1.95g(0.01mol)的(2s,3r)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酸(ⅲ)中，依次加入25ml四氢呋喃水溶液(v/v＝1/1.5)、1.31g三乙胺(0.013mol)，搅拌形成均相溶液后，缓慢滴加2.04g(0.012mol)氯甲酸苄酯(cbz-cl)，室温反应。tlc显示起始原料ⅲ消失后，加30ml水稀释，3
×
30ml乙酸乙酯萃取洗涤，然后用稀盐酸将水相ph调至1～2，3
×
30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到cbz保护的中间体ⅳ，称重2.77g，收率84.2％。
[0114]
2)中间体
ⅴ
的制备
[0115]
向1.65g(0.005mol)中间体ⅳ、1.27g(0.006mol)1,1-二苄肼和1.01g (0.0075mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入30ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入1.55g
(0.0075mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体
ⅴ
，称重2.58g，收率98.7％。
[0116]
3)化合物ⅰ的制备
[0117]
向0.28g 5％的钯碳中加入2.35g(0.0045mol)中间体
ⅴ
溶于50ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入50ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅰ，称重0.92g，收率97.8％。
[0118]
4)中间体ⅵ的制备
[0119]
向0.52g(0.0025mol)化合物ⅰ、0.99g(0.003mol)中间体ⅳ和0.51g (0.00375mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入20ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入0.77g(0.00375mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜。抽滤，滤液减压旋干，柱层析纯化得到中间体ⅵ，称重1.27g，收率97.7％。
[0120]
5)化合物ⅱ的制备
[0121]
向0.12g 5％的钯碳中加入1.04g(0.002mol)中间体ⅵ溶于30ml乙酸的溶液，抽换气3次后通氢气反应，至不再吸氢，停止反应。抽滤，滤液减压旋干，加入30ml丙酮水溶液(v/v＝1/1)溶解，将ph调至8～9，3
×
30ml二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到化合物ⅱ，称重0.76g，收率98.4％。
[0122]
对比例1
[0123]
本对比例提供一个乌苯美司遗传毒性杂质的制备方法，步骤如下：
[0124]
1)中间体ⅳ的制备
[0125]
向1.95g(0.01mol)的(2s,3r)-2-羟基-3-氨基-4-苯基丁酸(ⅲ)中，依次加入20ml四氢呋喃水溶液(v/v＝1/1)、1.21g三乙胺(0.012mol)，搅拌形成均相溶液后，缓慢滴加1.87g(0.011mol)氯甲酸苄酯(cbz-cl)，室温反应。tlc 显示起始原料ⅲ消失后，加30ml水稀释，3
×
30ml乙酸乙酯萃取洗涤，然后用稀盐酸将水相ph调至1～2，3
×
30ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用 10ml水、10ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压旋干，得到cbz保护的中间体ⅳ，称重2.76g，收率83.9％。
[0126]
2)中间体
ⅴ
的制备
[0127]
向1.65g(0.005mol)中间体ⅳ、0.21g(0.0055mol)85％水合肼溶液和 0.81g(0.006mol)1-羟基苯并三唑(hobt)中加入30ml无水四氢呋喃，冰水浴冷却下，加入1.24g(0.006mol)二环已基碳二亚胺(dcc)，室温过夜，不反应。
[0128]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0129]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。