一种用于多重核酸检测的DNA探针、CRISPR-反向点杂交核酸检测系统及应用

反向点杂交核酸检测系统及应用，本发明基于crispr和反向点杂交技术，可极大的提高检测效率、降低检测成本、节约检测时间，同时还具有高灵敏度、高特异性、普适性、快速、无需昂贵设备以及便携检测等优势。
7.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
8.一种用于多重核酸检测的dna探针，包括至少四组探针，每组探针分别包括一个bio-recognition dna(生物素修饰的单链dna探针)以及一个与所述bio-recognition dna互补配对的nh
2-capture dna(氨基修饰捕获的dna探针)；其中，所述四组探针中的bio-recognition dna碱基序列分别如seq id no.1～seq id no.4所示，对应配对的nh
2-capture dna碱基序列分别如seq id no.5～seq id no.8所示。
9.作为本发明的优选方式之一，所述dna探针中，每组的bio-recognition dna仅与同组的nh
2-capture dna相配合结合，不与其他组的bio-recognition dna或nh
2-capture dna发生配对。
10.作为本发明的优选方式之一，所述bio-recognition dna，生物素修饰在5’端。
11.作为本发明的优选方式之一，所述nh
2-capture dna，氨基修饰在5’端。
12.一种上述dna探针在制备多重核酸检测产品中的应用。
13.一种用于多重核酸检测的crispr-反向点杂交核酸检测系统，包括cas12蛋白、crrna、bio-recognition dna、链霉亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidin-hrp)、结合有nh
2-capture dna的尼龙膜、杂交液、底物液；
14.其中，所述crrna为特异性结合靶标核酸的序列，且不与bio-recognition dna及nh
2-capture dna结合；所述bio-recognition dna包括至少四种，序列分别如seq id no.1～seq id no.4所示；尼龙膜上的所述nh
2-capture dna与bio-recognition dna互补配对，包括至少四种，序列分别如seq id no.5～seq id no.8所示；所述链霉亲和素-辣根过氧化物酶可与bio-recognition dna结合；所述底物液可被链霉亲和素-辣根过氧化物酶中的hrp催化显色反应。
15.作为本发明的优选方式之一，所述cas12蛋白为cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12g中的一种。
16.作为本发明的优选方式之一，当所述多重核酸检测为甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒的四种核酸的检测时，对应构建的crrna为fa-crrna、fb-crrna、rsv-crrna、sars-2-n-crrna，序列分别如seq id no.9～seq id no.12所示。
17.作为本发明的优选方式之一，所述尼龙膜表面为负电荷修饰。
18.作为本发明的优选方式之一，所述结合有nh
2-capture dna的尼龙膜的制备方法如下：
19.(1)配备nh
2-capture dna工作液：将合成的nh
2-capture dna稀释成10μm终浓度以备点样使用；
20.(2)固定nh
2-capture dna：尼龙膜浸泡于含有3～10％edc溶液中10～40分钟，纯水冲洗3次并室温晾干；
21.(3)将0.5-1μl的nh
2-capture dna点在尼龙膜上，静置30分钟并晾干；
22.(4)使用氢氧化钠溶液(0.1mol/l，20ml)终止反应，并用纯水洗涤3次并晾干。
23.作为本发明的优选方式之一，所述杂交液包括a液、b液、c液；
24.所述a液的配方如下：
25.20
×
ssc 100ml；
26.10％sds 10ml；
27.纯化水 890ml；
28.总计 1l；
29.所述b液的配方如下：
30.20
×
ssc 10ml；
31.10％sds 4ml；
32.纯化水 386ml；
33.总计 400ml；
34.所述c液的配方如下：
35.1m柠檬酸钠 20ml；
36.纯化水 180ml；
37.总计 200ml。
38.作为本发明的优选方式之一，还包括核酸样；所述核酸样为待测核酸的dna全长或片段、待测核酸的等温扩增产物或pcr产物。
39.作为本发明的优选方式之一，所述等温扩增包括但不限于：环介导等温扩增(lamp)、解旋酶依赖性扩增(hda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、基于核酸序列的扩增(nasba)、转录介导扩增(tma)、切口酶扩增反应(near)、滚环扩增(rca)等。
40.一种上述crispr-反向点杂交核酸检测系统在制备多重核酸检测试剂盒中的应用，所述试剂盒用于检测样品中多重靶dna和rna。
41.一种基于crispr和反向点杂交技术的多重核酸检测方法，利用如权利要求5～11任一所述的crispr-反向点杂交核酸检测系统对待测样品进行检测。
42.作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：
43.s1、按照目标核酸检测的种类，将核酸样、对应的crrna、对应的bio-recognition dna、cas12蛋白溶于缓冲液，适宜温度反应，获得多个第一缓冲液；
44.s2、将所有的第一缓冲液全部混匀在一起，形成第二缓冲液；
45.s3、将上述第二缓冲液、结合有nh
2-capture dna的尼龙膜、杂交液在适宜温度下杂交反应；
46.s4、将链霉亲和素-辣根过氧化物酶与尼龙膜孵育；
47.s5、加入底物液，根据颜色的显色程度判读有无靶标核酸。
48.作为本发明的优选方式之一，所述步骤s1中：缓冲液为：10～100mm tris-hcl、10～200mm nacl、5～50mm mgcl2；适宜温度为25～42℃；反应时间为10～60分钟；所述步骤s3中：杂交适宜温度为25～45℃；杂交反应时间为30～120分钟。
49.检测原理如图1所示，现以构建四种核酸检测作为模型进行阐述(本发明实际不限于四种)：
50.首先，设计4种crrna(针对不同检测病毒)且与相应的dna靶标核酸互补结合。其次，设计4对互不干扰的bio-recognition dna和nh
2-capture dna配对序列。将4种nh
2-capture dna分别固定在同一尼龙膜上。当样本中含有一种或者多种靶标时，即形成crrna/
crispr-cas12a复合物，激活的cas12a能够无序的酶切一种或多种bio-recognition dna。断裂的bio-recognition dna不能与capture dna结合，因此没有蓝色斑点出现或蓝色斑点显色较弱。反之，有强烈的蓝色斑点信号出现。本发明设计了一种同时检测靶标核酸的方法，无需专门的仪器，且检测结果显示仅需一张便宜的尼龙膜。
51.本发明相比现有技术的优点在于：本发明基于crispr和反向点杂交技术联用，构建了一种用于同时检测多重靶标核酸的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统、检测方法及试剂盒；与常规方法相比，本发明极大的提高了检测效率，大大降低了检测成本；同时，本发明还具有高灵敏度、高特异性、快速、普适性、无需昂贵仪器、便携检测等优势，解决了现有crispr技术单靶标核酸检测的痛点。
附图说明
52.图1是本发明多重核酸检测方法的原理示意图(图中表意为，将扩增产物分别等量的加入到四个反应孔中，在适宜温度下孵育一段时间；使用杂交液将其全部洗脱到含有膜条的反应槽里，进行下一步杂交反应；加入底物进行显色；通过app进行定量识别或者肉眼直接观察判读结果)；
53.图2是本发明检测临床样本全程示意图；
54.图3是实施例4中检测4种呼吸道病毒的检测结果图。
具体实施方式
55.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
56.本发明提供了一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用。其检测临床样本的流程实体图如图2所示，首先使用提取试剂盒进行dna或者rna提取；然后使用rpa或者逆转录rpa试剂盒进行快速扩增；将扩增的产物加入到多通道微流控芯片，同时每个通道内加入cas12蛋白、对应病毒的crrna、bio-recognition dna，在反应孔反应10～30分钟；反应结束后，使用杂交液将四个通道的全部反应液与结合有nh
2-capture dna的尼龙膜进行杂交；将链霉亲和素-辣根过氧化物酶与尼龙膜孵育；加入底物液，观察并根据信号判读结果。
57.其中，需注意的是，本发明采用的试材除了特别说明以外，皆为普通市售品，可直接于市场购得。
58.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
59.实施例1
60.设计多重核酸检测的dna探针：
61.本实施例设计了四组探针，每组探针分别包括一个bio-recognition dna(生物素修饰的单链dna探针，生物素修饰在5’端)以及一个与bio-recognition dna互补配对的nh
2-capture dna(氨基修饰捕获的dna探针，氨基修饰在5’端)。
62.其中，四组探针中的bio-recognition dna-1、bio-recognition dna-2、bio-recognition dna-3、bio-recognition dna-4序列分别如seq id no.1～seq id no.4所
示；对应配对的nh
2-capture dna-1、nh
2-capture dna-2、nh
2-capture dna-3、nh
2-capture dna-1序列分别如seq id no.5～seq id no.8所示。
63.本发明中，dna探针实际包括但不限于上述四组；当用于四种以上核酸检测时，还可多设计出几组相配合的dna探针。
64.但需注意的是，每组的bio-recognition dna仅与同组的nh
2-capture dna相配合结合，不与其他组的bio-recognition dna或nh
2-capture dna发生配对。
65.实施例2
66.构建crispr-反向点杂交核酸检测系统：
67.crispr-反向点杂交核酸检测系统包括核酸样、cas12蛋白、crrna、bio-recognition dna、链霉亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidin-hrp)、结合有nh
2-capture dna的尼龙膜、杂交液、底物液。
68.其中，核酸样为待测核酸的dna全长或片段、待测核酸的等温扩增产物或pcr产物(等温扩增包括但不限于lamp、hda、rpa、sda、nasba、tma、near、rca等)。
69.cas12蛋白为cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12g中的一种。
70.crrna为特异性结合靶标核酸的序列，且不与bio-recognition dna及nh
2-capture dna结合。
71.bio-recognition dna包括至少四种，序列分别如seq id no.1～seq id no.4所示。
72.尼龙膜表面为负电荷修饰。尼龙膜上的nh
2-capture dna与bio-recognition dna互补配对，包括至少四种，序列分别如seq id no.5～seq id no.8所示。
73.所述结合有nh
2-capture dna的尼龙膜的制备方法如下：
74.(1)配备nh
2-capture dna工作液：将合成的nh
2-capture dna稀释成10μm终浓度以备点样使用；
75.(2)固定nh
2-capture dna：尼龙膜浸泡于含3～10％edc溶液中10～40分钟(优选为浸泡于含5％edc溶液中25分钟)，纯水冲洗3次并室温晾干；；
76.(3)将0.5～1μl(优选为0.8ul)的nh
2-capture dna点在尼龙膜上，静置30分钟并晾干；
77.(4)使用氢氧化钠溶液(优选为0.1mol/l，20ml)终止反应，并用纯水洗涤3次并晾干。
78.杂交液包括a液、b液、c液；
79.所述a液的配方如下：
80.20
×
ssc 100ml；
81.10％sds 10ml；
82.纯化水 890ml；
83.总计 1l；
84.所述b液的配方如下：
85.20
×
ssc 10ml；
86.10％sds 4ml；
87.纯化水 386ml；
88.总计 400ml；
89.所述c液的配方如下：
90.1m柠檬酸钠 20ml；
91.纯化水 180ml；
92.总计 200ml。
93.链霉亲和素-辣根过氧化物酶可与bio-recognition dna结合。
94.底物液可被链霉亲和素-辣根过氧化物酶中的hrp催化显色反应。
95.本实施例crispr-反向点杂交核酸检测系统可作为多重核酸检测试剂盒的组成，所述试剂盒用于检测样品中多重靶dna和rna。
96.实施例3
97.基于crispr和反向点杂交技术的多重核酸检测方法(采用实施例2的crispr-反向点杂交核酸检测系统)：
98.s1、按照目标核酸检测的种类，将核酸样、对应的crrna、对应的bio-recognition dna、cas12蛋白溶于缓冲液(10～100mm tris-hcl、10～200mm nacl、5～50mm mgcl2)，25～42℃温度反应10～60分钟，获得多个第一缓冲液；
99.s2、将所有的第一缓冲液全部混匀在一起，形成第二缓冲液；
100.s3、将上述第二缓冲液、结合有nh
2-capture dna的尼龙膜、杂交液在25～45℃温度下杂交反应30～120分钟；
101.s4、将链霉亲和素-辣根过氧化物酶与尼龙膜孵育5～30分钟；
102.s5、加入适量底物液，根据颜色的显色程度判读有无靶标核酸。
103.所述步骤s1中：
104.缓冲液优选为50mm tris-hcl、100mm nacl、20mm mgcl2。
105.适宜温度优选为30℃；
106.反应时间优选为30分钟。
107.所述步骤s3中：
108.杂交适宜温度优选为30℃；杂交反应时间优选为70分钟。
109.所述步骤s4中：
110.孵育时间优选为20分钟。
111.实施例4
112.本实施例用以验证本发明检测方法：
113.利用重组酶恒温扩增技术结合crispr/cas12a和反向点杂交技术同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒。
114.本实施例描述了一种利用重组酶恒温扩增技术对待检测临床样本进行扩增后，利用cas12a附属酶切属性和反向点杂交显色进行多重核酸检测的方法。
115.一、材料与方法
116.1、设计4对rpa恒温扩增引物(4对rpa恒温扩增引物中，fa：甲型流感病毒；fb：乙型流感病毒；rsv：呼吸道合胞病毒；cov：新冠病毒)：
117.rpa-fa-f：caacaaccaatccattaataaaacatgagaac；
118.rpa-fa-r：aaattttcaagaagatcatcccttagaccag；
119.rpa-fb-f：gatatacgtaatgtgttgtccttgagagtg
120.rpa-fb-r:taagatcatcagtagcaacaagtttagcaa；
121.rpa-rsv-f：cttagcatatgtagtacaattaccactata；
122.rpa-rsv-r：tacttcacttggtaatgttaaactgttcat；
123.rpa-sars-2-n-f：gaaattcaactccaggcagcagtaggggaac；
124.rpa-sars-2-n-r：gaaagcttgtgttacattgtatgctttagtg。
125.2、设计4种crrna：
126.fa-crrna:uaauuucuacuaaguguagaugccuggugugugcaacaugugagc(如seq id no.9所示)；
127.fb-crrna:uaauuucuacuaaguguagauaugaaggacauucaaagccaauu(如seq id no.10所示)；
128.rsv-crrna:uaauuucuacuaaguguagauugacacaaugaacaguuuaacauu(如seq id no.11所示)；
129.sars-2-n-crrna:uaauuucuacuaaguguagaucugcugcuugacagauugaacca(如seq id no.12所示)。
130.3、设计4种bio-recognition dna(序列如seq id no.1～seq id no.4所示)和4种nh
2-capture dna(序列如seq id no.5～seq id no.8所示)。
131.4、制备capture dna修饰的尼龙膜：
132.(1)配备4种氨基修饰的nh
2-capture dna工作液：将合成好的4种nh
2-capture dna各自稀释成10μm终浓度以备点样使用；
133.(2)固定nh
2-capture dna：尼龙膜浸泡于含有3～10％edc溶液中10～40分钟，纯水冲洗3次并晾干。
134.(3)将0.5～1μl的nh
2-capture dna分别点在尼龙膜上，静置30分钟晾干；
135.(4)使用氢氧化钠溶液(0.1mol/l，20ml)终止反应，并在此用纯水洗涤3次并晾干。
136.二、检测过程
137.1、样本处理：
138.采用rna提取试剂盒提取待测样本中的rna作为检测模板；
139.2、样本扩增：
140.采用体外恒温rpa反转录试剂盒将所述rpa扩增产物进行体外转录，得到转录产物；
141.3、配置恒温扩增反应体系：
142.(1)在200μl管中制备反应混合物：
143.144.轻轻涡旋；
145.(2)加入2.5μl 280mm醋酸镁(mgoac)，混合均匀。
146.将上述扩增反应体系于30℃进行扩增30min。
147.4、cas12a酶切反应体系配制：
148.制备4管cas12a酶切反应体系。其中，每一管中包含cas12a，fa-crrna或fb-crrna或rsv-crrna或sars-2-n-crrna(终浓度约为0.02～2μm))，对应的biotin-recognition dna(每一个反应孔都是独立的，都含有一种已知的crrna、已知的biotin-recognition dna，且这个biotin-recognition dna可以与后面的捕获探针一一对应结合)。
149.酶切缓冲液的成分为：
150.10～200mm nacl；
151.5～100mm tris-hcl；
152.2～50mm mgcl2；
153.ph 7～9；
154.加入2～10μl扩增产物，将配制的酶切反应体系至于25～42℃温浴5～30min。
155.5、杂交反应：
156.将上述4种反应液共同与结合有四种nh
2-capture dna的尼龙膜杂交，在25～45℃孵育30～120分钟。
157.6、充分洗涤后，加入适量的链霉亲和素-辣根过氧化物酶streptavidin-hrp进行孵育5～30分钟。
158.7、充分洗涤并加入适量(10～50ml)的底物液，显色2分钟并观察结果。
159.本实施例检测结果如图3所示。图3中，“全阴性”：膜条上的位点均出现蓝色斑点；“全阳性”：膜条上的位点未出现蓝色斑点；“一种阳性”：膜条上出现3个蓝色斑点，且另外1个位点未出现蓝色斑点；“两种阳性：膜条上出现2个蓝色斑点，且另外2个位点未出现蓝色斑点；“三种阳性”膜条上出现1个蓝色斑点，且另外3个位点未出现蓝色斑点。
160.检测结果主要是通过每个孔的crrna进行特异性辨别。如果扩增产物中仅含有甲型流感病毒核酸扩增产物，那么fa通道中的生物素dna探针就会被切割，而其他的3个通道的生物素dna探针保持完整状态；再将全部反应液洗脱到含有膜条的反应槽中，由于fa通道的生物素探针被酶切，不会结合到膜条上，而其他通道的生物素探针结合到相应的膜条上。如果样本中时含有两种，三种及四种上述病毒，同理均会被检测到。
161.综上所述，本发明一种基于crispr和反向点杂交技术的多重核酸检测方法，能够便捷、快速、高效多重病毒核酸，不仅检测成本低，还具有很强的应用性。将该发明转化为诊断试剂盒，可用于临床早期诊断，从而提高检测效率。
162.同时，经初步验证，该发明还具有高灵敏度、高特异性，检测性能好。
163.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。